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要約

ここで規制エキソサイトーシスの生きているセルイメージ投射のための方法を詳しく説明します。このメソッドは、記者として FITC デキストラン、細胞小器官のリソソーム関連に蓄積を利用しています。この簡単な方法は、遺伝子を操作することは困難されているセルの規制エキソサイトーシスの異なるモード間の区別もできます。

要約

規制エキソサイトーシスは分泌トリガーへの応答で、分泌顆粒 (SGs) に格納されている貨物が解放されるプロセスです。規制エキソサイトーシスは、神経伝達物質、ホルモン、炎症性メディエーター、および他の化合物は、様々 な細胞によって分泌する重要なメカニズムとして細胞間コミュニケーションのための基本です。規制エキソサイトーシスの少なくとも 3 つの異なるメカニズムが知られている: 単一の SG が完全にどこ単一 SG うつろい原形質膜とヒューズ、キス-実行エキソサイトーシスと化合物分泌細胞膜と融合、完全エキソサイトーシスどこいくつか SGs は、前または SG 細胞膜融合後、お互いに融合します。セルによる規制のエキソサイトーシスの種類よく分泌トリガーの種類によって決まります。ただし、多くの細胞で分泌トリガーを 1 つでは規制エキソサイトーシスの複数のモードを同時にアクティブできます。にもかかわらず、彼らの豊かさと重要性細胞の種類と種の間で、分泌の異なるモードを決定する機構が主として解決されません。規制エキソサイトーシスの異なるモードの調査における主要な課題の 1 つは、個別にそれらの探索し同様、それらの間の区別の難しさです。ここでかに (FITC) の使用を記述-デキストラン エキソサイトーシス記者と生細胞イメージング、化合物のエキソサイトーシスに焦点を当て、規制のエキソサイトーシスの異なる経路を区別するために堅牢性に基づく、exocytic イベントの期間です。

概要

規制エキソサイトーシスは、容易に作られた貨物が特定のトリガーへの応答の分泌細胞から解放される主要なメカニズムです。貨物は前もって形作られた、それが格納されているトリガーは、SGs のコンテンツのリリースのための信号をリレーまで、分泌小胞に隔離。規制エキソサイトーシスの異なったモードの信号の種類可能性があります。 または規制エキソサイトーシスの異なるモードが同時に発生することがあります。規制エキソサイトーシスの 3 つの主要なモードが知られている: 細胞膜; 単一顆粒の完全融合を含む完全エキソサイトーシスそのリサイクル; 続いてプラズマ膜で分泌顆粒の一時的な融合を含むキス実行エキソサイトーシス化合物の放出 (すなわち、粒エキソサイトーシス) SGs 前にいくつかのエネルギー核融合によって特徴付けられるまたはシーケンシャル (すなわち、逐次開口放出)1細胞膜と融合します。複合エキソサイトーシスと見なされます貨物リリース2の最も広範なモードある sgs を含む貨物の高速の分泌の細胞膜から遠位。化合物の放出は、両方外分泌と内分泌のセル3,4,5,6,7,8,9, だけでなく、文書化されています。免疫細胞。好酸球10、11,12と好中球13などの免疫細胞の化合物の放出によりよう侵入病原体を殺すために必要とされる仲介人の高速かつ堅牢なリリース細菌や寄生虫。マスト細胞 (MCs) は生得の免疫反応、アナフィラキシー、他アレルギー反応14,15,16時に中古に格納されて炎症性メディエーターの効率的なリリースの化合物の分泌を展開します。,17. リアルタイムでそれらを区別するためにまたは彼らのそれぞれの融合機械、それゆえ解明を識別するために課題となっているそれ以来、エキソサイトーシスの異なるモードが同時に発生する18,19、彼らの根本的なメカニズム。

ここで、手法は紹介生細胞に細胞のイメージング ロード FITC デキストラン、exocytic イベントをリアルタイムに追跡し、異なるモードの間の区別ができます。特に、本手法は、化合物のエキソサイトーシスの排他的な監視できます。

FITC デキストランはグルカン多糖デキストランと pH に敏感な fluorophore FITC の共役です。蛍光に分類された dextrans は、個室に入るポリイグ20,21とマクロピノサイトーシス22,23で示されています。エンドサイトーシスのコンパートメントは、リソソームに成熟、FITC デキストランが明らか劣化なしとライソゾームに蓄積、示されています。ただし、FITC は pH 高感度蛍光24、リソソーム内腔は酸性ですので、リソソーム24に到達するとデキストラン投与により蛍光を消光します。したがって、FITC の pH の感度とともに撮影した貨物を対象とした、リソソーム エキソサイトーシス25,26,27の研究で FITC デキストランの使用のための基盤を築いたリソソームとして dextrans を確立します。,28,29。

MCs、好中球、好酸球、T 細胞、メラノソーム、および他を含むいくつかの細胞のタイプ、SGs はライソゾームの機能を表示、リソソーム性細胞小器官 (リモート・センシング) または分泌リソソーム30,31 として分類されて.リモート・センシング酸性内腔 pH を持っている、ので、FITC デキストランは、リモート・センシングの外在化に関連付けられているより高い pH の結果として、彼らの開口放出を視覚化する使用できます。実際、デキストラン投与によりは MCs18,32,33開口放出を監視するために使用されています。このメソッドで FITC デキストランを細胞培養に追加, pinocytosis によって細胞によってとらし、SGs に分類します。それがリソソーム内に、セル内にあるときに、FITC の蛍光が SGs で急冷され。ただし、SG 融合膜と外部環境に必然的な露出、時に FITC デキストランを取り戻す SG pH が高くなるにつれてその蛍光顕微鏡による生細胞 exocytic イベントの簡単な追跡を可能します。ここでは、我々 は化合物のエキソサイトーシスの一意の追跡を有効にするのにこのメソッドを調整しました。

他の 2 つの方法は、化合物の放出を追跡する以前に使用されています。電子顕微鏡は、エキソサイトーシスの異なるモードの発生が示唆された exocytic 構造を特徴付けるための最初の方法だった。特に、膵腺房細胞34と MCs35,36,37 「分泌型トンネル」観測は、化合物エキソサイトーシス仮説をもたらした。しかし、電子顕微鏡の高分解能では、溶かされた小胞を明らかにする力がありますが、それらの融合ダイナミクスを追跡できません。、それゆえ SG 融合複合エキソサイトーシス時または再キャプチャした顆粒の融合に対応しているかどうかを定義できません。彼らのエンドサイトーシスを次します。膜容量11,13,38,39またはアンペロメトリーのパッチ ・ クランプの測定などの生きた細胞の開口放出を測定することができます他の方法でこの障害を克服します。メディアの40 。ただし、パッチク ランプ特別な設定を必要とする、すべてのセルのタイプに適していない場合があります。電流測定は、電極に非常に近くで貨物が解放される場合にのみ開口放出を追跡することが。したがって、ライブセル イメージングを使用して提供していますこれらの方法上の利点、エキソサイトーシスのリアルタイム追跡のためでなく、全体のセルからのデータの迅速かつ簡単な取得も可能します。

生細胞顕微鏡検査によるデキストラン投与により追跡はまた、他の生細胞にいくつかの利点にイメージング手法を提供しています。たとえば、広く使用されている方法は、蛍光 SG プローブ搭載または蛍光タンパク質タグ SG 貨物または膜蛋白質26,41,を表現するセルの内部全反射蛍光顕微鏡 (TIRFM)42,43。 このメソッドの強みはその能力 (ここのフット プリントという膜の近くに発生するイベントのみを監視するにしたがって exocytic イベント。しかし、これはまたこの方法の欠点は、coverglass に隣接して、顕微鏡のレンズの近くにすることができます細胞画分だけイメージ44ので。このような足跡は確かに全体の細胞膜表面を表すかどうかは、まだ議論の余地が45,46,47です。この点で、開いたピンホールと FITC デキストランなどの pH 感受性色素と標準的な蛍光顕微鏡や共焦点顕微鏡を使用すると、全体のセルは、そのセルで発生する合計 exocytic イベントのキャプチャの画像ができます。

全細胞イメージングや観察によって調整された分泌を研究に使用される追加の pH に敏感な記者には、SG 貨物または phlourin、pH 感受性 GFP バリアントに溶ける SG 膜蛋白質が含まれます。たとえば、NPY - phlourin - β-hexoseaminidase-phlourin、シナプト phluorin48,49,50,51,52です。これらのプローブの表現より密接に SGs の内因性の合成で表すことができる、それは細胞のトランスフェクションを伴います、transfect に困難であるセルに適さなくなります。したがって、transfect に困難でいるとき、勉強のセルまたは複数のゲノム操作を必要とする実験の条件下で細胞培養液、FITC デキストランなどに単に補完することができます化合物の使用が有利であります。.FITC デキストランはまたアクリジンのオレンジ (AO)、以上の利点を提供していますライブ携帯顕微鏡53,54,55,56エキソサイトーシスの追跡のために使用されている別の pH 感受性色素,57,58。 AO が実際分泌に対応しない偽の点滅で結果が27を処理する小胞の光分解を誘導するために示されています。対照的に、FITC デキストランは、おそらく生産のための低光誘起活性酸素27の良い分泌イベントを反映しています。

特に、エキソサイトーシスの勉強のアプローチは、このプロセス時に表示される融合細孔を SG に外的な媒体からの染料の流入を追跡することによってです。この場合、色素が分泌トリガーと一緒に外部メディアに追加されます。その後、融合細孔が開いたら、SG59,60に染料を拡散させます。この方法の明確な利点はことまた可変サイズの染料を使用して融合細孔の大きさを推定する能力を提供しています。たとえば、異なる分子量 (MW)、異なった fluorophores に共役 dextrans をという SG を浸透することができます。 デキストランの最大サイズは、融合細孔59,のサイズに対応する細胞外の染料として使用できます。61,62,63,64。 さらに、このアプローチは pH に敏感なプローブの使用を必要とします。しかし、重大な欠点は、信号対雑音比が非常に低く、大量の染料は高いバック グラウンドで画像の取得中にメディアに存在です。

全体的にみて、エキソサイトーシスのマーカーとして FITC デキストランの使用は、信号対雑音比、毒性、動的追跡、複雑さなど、以前に報告された方法でいくつかの欠点を克服します。

ここで (以下というエクルストンらによって主に確立された RBL RBL-2 H 3 マスト細胞ラインで化合物放出を監視する FITC デキストランの使用を説明します。65 Barsumianらが、さらに66), 免疫グロブリン E (IgE) の応答で/活性化抗原 (Ag)。

プロトコル

1. 準備

  1. RBL 培地の調製
    1. 低血糖ダルベッコのミックス 500 mL は、ペニシリン-ストレプトマイシン-ナイスタチン液、L-グルタミン 200 ミリメートルのソリューションの 5.5 mL の mL の 5.5 イーグル培地 (DMEM) ウシ胎児血清 (FBS) の 56 ml を変更しました。低血糖でこの結果 DMEM を 10 %fbs、100 μ g/mL ストレプトマイシン、100 単位/ml ペニシリン、12 単位/ml ナイスタチン、2 mM L グルタミンを補った。
    2. 4 ° C で 0.22 μ m の細孔径とストアのトップ真空フィルターを使用して、メディアをフィルター処理します。
  2. RBL 細胞の維持。
    1. 10 cm 皿に 90% の最大密度に RBL 細胞を成長します。細胞培養の健康は、細胞が時折突起部を紡錘形に必要です。
    2. セル分割のためメディアを吸引し、2 mL の trypsine/EDTA 溶液 * 加温加湿雰囲気 37 ° C で 5% CO2の 5-10 分に置き換えるお皿からセルをデタッチします。
    3. セルが切り離された後、ピペットを使用して培地 2 mL を追加してトリプシンを中和して 1:2-1 でセルを分割: 10 の比率。
  3. 20 x タイロード バッファーの準備
    1. 在庫 20 x 54 mM KCl の解決、20 mM MgCl2、2.74 M の NaCl および 8 mM NaH2PO4二重蒸留水 (DDW) を準備します。よく混合し、4 ° C で保存

2. 生細胞顕微鏡検査の RBL 細胞の培養

  1. FITC デキストラン溶液の調製。
    1. 文化メディア (手順 1.1.1 参照) の 1 mL あたり FITC デキストラン粉 (150 K) の 1 mg を混ぜます。完全カバーグラスチェンバー用 3 mL を準備します。
    2. 酢酸セルロース シリンジ フィルター ユニットを使用すると、0.22 μ m の孔径、フィルター、デキストラン投与により溶存です。
    3. 1 μ G/ml の濃度にマウス IgE を追加します。
  2. RBL 細胞イメージングのための播種
    1. イメージング、前日培養皿からメディアを吸引し、37 ° C で 5% CO2の加湿雰囲気で 5-10 分の trypsine/EDTA 溶液 * 加温の 2 mL で置き換えるセルが切り離された後、培地 2 mL を追加してトリプシンを中和します。
    2. カウント RBL 細胞の診断を使用して、音量を調節します 7.5 x 10 の5/mL の細胞濃度を得るために文化メディアと。
    3. 新鮮な FITC デキストランが記入されたカバーグラスチェンバーに細胞懸濁液の 10 μ L 添加培地 (この結果、区域の 10 の3セル × 7.5 の播種、) を追加します。
    4. 37 ° C で 5% CO2の腐植質雰囲気で一晩 RBL 細胞を成長します。セルは、セルが分割されている、簡単に顕微鏡下で個別に各セルを識別できるかどうかを確認するためにサブ合流レベルのままする必要があります。
  3. 省略可能な RBL 細胞のトランスフェクションします。
    1. その他の蛍光付けられた蛋白質との組み合わせで exocytic イベントをイメージング、Azouzらの RBL 細胞のトランスフェクション プロトコルを参照してください。67

3. エキソサイトーシスの生細胞の顕微鏡検査

  1. 溶液の調製:
    1. 最終タイロード緩衝液を準備、1:20 の DDW で原液を希釈して希釈し、20 mM Hepes pH 7、1.8 mM CaCl2、1 mg/mL、BSA、5.6 mM グルコースを栄養補助。
    2. たてタイロード バッファーに 20 倍分泌促進剤試薬の準備 [1 μ G/ml ジニトロフェニル標識ヒト血清アルブミン (DNP-(Ag) は、) 50 ng/mL の 1x 濃度の場合]。
    3. タイロード バッファー内の粉体を溶解することにより 400 mM 塩化アンモニウム溶液を調製します。
  2. セルの準備。
    1. 商工会議所からメディアを吸引、タイロード バッファー、37 ° c. に prewarmed の 300 μ L でそれを補充し、カバーグラスチェンバー 3 回を洗う最後に、タイロード バッファー、37 ° c. に prewarmed の 300 μ L で商工会議所を補充します。
    2. 顕微鏡のインキュベーター室に、カバーグラスチェンバーを配置します。商工会議所は、安定していることを確認します。
  3. 顕微鏡のセットアップ
    1. 追跡に関心の領域を選択するには、蛍光灯の光源 (従来は水銀ランプ) をオンにし、適切な蛍光フィルターを選択 (緑 fluorophores FITC デキストランを表示するためのフィルターを選択します)。関心領域は、フォーカスの視野の真ん中には、一度は、光退色、光毒性を避けるために光源をオフに。
      注: セルに組み込まれて FITC デキストランの一部は蛍光を保持可能性があります。これは FITC デキストランをエンドソームなど非ライソゾームのコンパートメントに並べ替えることもできます。
    2. FITC 励起の適切な照明をオンにします。レーザー顕微鏡を用いた、488 nm レーザーをオンします。排出量の周りに集まった必要があります 500 550 nm (FITC 発光ピーク 510 520 nm)。
    3. 共焦点の顕微鏡を使用している場合は、最大にピンホールを開きます。これは漂白を避けるために低いレーザー力と毒性を使用できるようになります、セルのすべての面から開口放出イベントのキャプチャになります。
    4. 画像取り込み間隔時間を調整します。
      1. 異なるセルは規制エキソサイトーシス68その反応速度論で異なる場合があります。複合エキソサイトーシスの特定イメージングは、5 秒以上の間隔をお勧めします。ただし、親指のルールとして高速イメージングできるように、確認 1 つのフレームの取得時間は高速。
      2. レーザー走査型共焦点顕微鏡を使用している場合スキャン方向を双方向に設定を許可せず、平均化するため、512 x 512 で解像度を設定 (推奨; 後者の 2 つの規定また漂白と毒性を最小限にするのに役立ちます)。
  4. エキソサイトーシスのイメージング。
    1. イメージ セル セルまたは分泌促進剤の種類によっては、目的の期間のため。RBL 細胞が IgE/銀の発生、活性化の 15-20 分以内ほとんどの exocytic イベントが発生します。
    2. 細胞の活性化、商工会議所に分泌促進ソリューション x 20 から 16 μ L を追加します。
  5. デキストラン投与により細胞の存在を確認します。
    1. 存在と SGs に FITC デキストランの局在を確認する追加塩化アンモニウム液の 16 μ L (フォーカスを失うために商工会議所を移動しないように注意である) 商工会議所に優しく (20 mM の最終的な集中になる)。これは、SGs のアルカリ化との FITC の蛍光は、数秒以内に発生します dequenching を誘発します。

結果

図 1 aは、開口放出を規制し、exocytic イベントの異なるモードを要約に FITC デキストランが記者として機能する方法概略を表します。まず、セルは SGs に pinocytosis によって、デキストラン、FITC と孵化させます。ここに示すように黒い顆粒、FITC の蛍光以来 MCs SGs、リモート・センシング、低 pH を弱める (A ~ C、私)。細胞は分泌促進物質や細胞膜と...

ディスカッション

ここで我々 は FITC デキストラン SGs にロードの蛍光が具体的化合物放出イベントをキャプチャ使える方法トレースについて説明します。これは、15 秒ごとに画像を取り込むために、顕微鏡を設定、時間をかけて長期的なイベントだけが記録されます、しないように、完全エキソサイトーシスまたはキス実行エキソサイトーシスに対応する短いイベントは除外によって達成されました。手法の?...

開示事項

著者は競合する金利を宣言しません。

謝辞

我々 は博士米国アシェリー cDNA の寛大な贈り物をありがちましょう。顕微鏡による貴重な援助夫妻 G. 質量・ l. Mittleman、m. Shaharbani ・ サックラー細胞及び分子イメージング センターから Y.Zilberstein をありがとうございます。この作品 (R. 鷺アイゼンバーグ、I. ハンメル、S.J.Galli グラント 2013263) アメリカ合衆国イスラエル二国間科学技術振興財団によって支えられたし、イスラエル (R.Sagi アイゼンバーグに科学アカデミーによって設立されたイスラエル科学財団から 933/15 を付与) や NIH 助成金 U19 AI 104209 と R01 AR067145 (スバールバルヤンマイエン島 Galli) します。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
DMEM low glucoseBiological Inductries01-050-1A
Fetal bovine serumGibco12657
Pen-strep-nystatin solutionBiological Inductries03-032-1B
L-Glutamine 200 mM solution Biological Inductries03-020-1A
FITC dextran 150KSigma-Aldrich46946-500MG-F
Trypsin/EDTA Solution BBiological Inductries03-052-1AWarm in 37 °C water bath before use
Top-vacuum filter of 0.22 µm pore size Sigma-AldrichCLS430769-1EA
Cellulose acetate syringe filter unit, 0.22 µm pore sizeSartorius16534K
Chambered coverglass Thermo scientific155411
Corning tissue-culture treated culture dishesSigma-AldrichCLS430167
Bovine serum albuminSigma-AldrichA4503
Anti-DNP monoclonal IgESigma-AldrichD8406
DNP-HSA (Ag)Sigma-AldrichA6661 Avoid direct light exposure
Hepes buffer 1M, pH 7.4Biological Inductries03-025-1B
CaCl2MERK102382
GlucoseBDH Laboratories284515V
Ammonium chlorideMERK1145
PIPES dipotassium saltSigma-Aldrich108321-27-3
Calcium acetate hydrateSigma-Aldrich114460-21-8
Magnesium acetate tetrahydrateSigma-AldrichM5661
Potassium glutamate (L-Glutamic acid potassium salt monohydrate)Sigma-AldrichG1501
NaH2PO4MERK6346
NaClMERK106404
MgCl2MERK105833
KClMERK104936
Electroporator BTXECM830
Confocal microscope, ZeissZeissLSM 5 Pascal, Axiovert 200MUsed in Figure 3. Equipped with an electronic temperature-controlled
airstream incubator
Confocal microscope, ZeissZeissLSM 800, Axio Observer.Z1 /7Used in Figure 2. Equipped with a GaAsP detector an electronic temperature-controlled
airstream incubator
Confocal microscope, LeicaLeicaSP5Used in Figure 1. Equipped with a leica HyD detector and an top-stage incubator (okolab)
RBL-2H3 cellsRBL-2H3 cells were cloned in the lab of Reuben P. Siraganian. See reference 67

参考文献

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