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Resumen

Aquí detallamos un método para obtener imágenes de células vivas de exocitosis regulada. Este método utiliza FITC-los dextranos, que se acumulan en orgánulos relacionados con los lisosomas, como reportero. Este sencillo método permite también distinguir entre los diferentes modos de exocitosis regulada en las células que son difíciles de manipular genéticamente.

Resumen

Regulada de la exocitosis es un proceso que carga, que se almacena en gránulos secretores (SGs), se libera en respuesta a un gatillo secretora. Regulada de la exocitosis es fundamental para la comunicación intercelular y es un mecanismo clave para la secreción de neurotransmisores, hormonas, mediadores inflamatorios y otros compuestos, por una variedad de células. Se conocen al menos tres mecanismos distintos para exocitosis regulada: exocitosis completo, donde un solo SG completamente se fusiona con la membrana plasmática, exocitosis de beso-y-run, donde un solo SG transitoriamente se fusiona con la membrana plasmática, y exocitosis compuesto, donde SGs varios fusionan, antes o después de la fusión de la SG con la membrana plasmática. El tipo de exocitosis regulada por una célula es dictado a menudo por el tipo de gatillo secretora. Sin embargo, en muchas células, un solo gatillo secretora puede activar varios modos de exocitosis regulada simultáneamente. A pesar de su abundancia e importancia a través de especies y tipos de la célula, los mecanismos que determinan los diferentes modos de secreción son en gran parte sin resolver. Uno de los principales retos en la investigación de los diferentes modos de exocitosis regulada, es la dificultad de distinguir entre ellos, así como exploración de por separado. Aquí describimos el uso de isotiocianato de fluoresceína (FITC)-dextrano como reportero de exocitosis y celular directo imágenes, para diferenciar entre las diferentes vías de exocitosis regulada, centrándose en la exocitosis compuesto, basado en la robustez y duración de los eventos exocíticas.

Introducción

Regulada de la exocitosis es el mecanismo primario por el cual carga fácilmente hecho es liberado de una célula secretora en respuesta a un disparador específico. La carga está preformada y secuestrada en vesículas secretoras, en la que se almacena hasta un relés la señal para la liberación del contenido de la SGs. Diferentes tipos de señales pueden resultar en diferentes modos de exocitosis regulada, o diferentes modos de exocitosis regulada pueden ocurrir simultáneamente. Se conocen tres modos principales de exocitosis regulada: exocitosis completo, que consiste en la fusión completa de un solo gránulo secretor con la membrana plasmática; exocitosis de beso-y-funcione, que consiste en la fusión transitoria del gránulo secretor con la membrana plasmática seguida por su reciclado; y exocitosis compuesta, que se caracterizaron por homotípicos fusión de varios SGs antes (es decir, multigranular exocitosis) o secuencial (es decir, exocitosis secuencial) a la fusión con la membrana plasmática1. Exocitosis compuesto se consideran el modo más extenso de carga release2, como permite la secreción rápida de la carga, la incluida del SGs que se encuentra distal de la membrana plasmática. Compuesto exocitosis se ha documentado en ambas células exocrinas y endocrinas3,4,5,6,7,8,9, así como en células inmunes. En las células inmunes, como los eosinófilos10,11,12 y neutrófilos13, exocitosis compuesto permite la liberación de mediadores que se requieren para matar a patógenos invasores tales como rápida y robusta bacterias o parásitos. Las células del mástil (MCs) desplegar compuesto exocitosis para la eficiente liberación de mediadores inflamatorios depositados durante la respuesta inmune innata, anafilaxia y otras reacciones alérgicas14,15,16 , 17. puesto que los diferentes modos de exocitosis pueden ocurrir simultáneamente18,19, se ha convertido en un reto para distinguir entre ellos en tiempo real o para identificar sus maquinarias de fusión respectivos, por lo tanto, la aclaración sus mecanismos subyacentes.

Aquí presentamos un método, basado en células vivas imágenes de celular cargado FITC-los dextranos, que permite el seguimiento en tiempo real de eventos exocíticas y distinguir entre sus diferentes modos. En particular, nuestro método permite el control exclusivo de exocitosis compuesto.

FITC-dextrano es un conjugado de fluoróforo sensible al pH FITC con el dextrano polisacárido de glucano. Fluorescencia de etiquetado dextranos han demostrado entrar en la célula micropinocytosis20,21 y macropinocitosis22,23. Como compartimentos endocíticos maduran hasta convertirse en lisosomas, se ha demostrado que FITC-los dextranos se acumulan en los lisosomas con sin degradación aparente. Sin embargo, desde FITC es un fluoróforo altamente sensibles al pH24, y el lumen del lisosoma es ácido, fluorescencia FITC-los dextranos apaga al llegar a la24del lisosoma. Por lo tanto, establecer dextranos como lisosoma dirigida la carga, junto con la sensibilidad del pH del FITC, han sentado las bases para el uso de FITC-los dextranos en estudios de lisosoma exocitosis25,26,27 , 28 , 29.

En varios tipos celulares, incluyendo MCs, neutrófilos, eosinófilos, células de T citotóxicas, melanosomas y otros, el SGs Mostrar características lisosomales y se clasifican como organelos relacionados con el lisosoma (LROs) o lisosomas secretores30,31 . Desde LROs tiene un pH ácido luminal, FITC-los dextranos pueden utilizarse para visualizar su exocitosis, como resultado de pH mayor asociado con la exteriorización de los LROs. De hecho, FITC-los dextranos se ha utilizado para monitorear la exocitosis en MCs18,32,33. En este método, FITC-los dextranos es agregado a la cultura de célula, tomado por las células por pinocitosis y clasificó en el SGs. Como es en los lisosomas, fluorescencia FITC se apaga en el SGs cuando están dentro de la célula. Sin embargo, en fusión con la membrana plasmática y la consecuente exposición al ambiente externo en SG, el FITC-los dextranos recupera su fluorescencia como el SG pH se levanta, permitiendo que el simple seguimiento de eventos exocíticas por microscopía de células vivas. Aquí, hemos ajustado este método para activar el seguimiento exclusivo de exocitosis compuesto.

Otros dos métodos se han utilizado previamente para seguimiento compuesto exocitosis. La microscopia electrónica fue el primer método para caracterizar estructuras exocíticas que sugirieron la ocurrencia de los diferentes modos de exocitosis. En particular, observaciones de "túneles secretoras" en las células acinares pancreáticas34 y MCs35,36,37 dieron lugar a la hipótesis de exocitosis compuesto. Sin embargo, mientras que la alta resolución de la microscopía electrónica tiene el poder de revelar las vesículas fusionadas, no puede seguir la dinámica de la fusión y por lo tanto no es posible definir si corresponden a la fusión de SG durante la exocitosis compuesto o la fusión de gránulos recapturados siguiendo su endocitosis. Este obstáculo es superado en otros métodos que pueden medir la exocitosis en las células vivas, tales como medidas de abrazadera de remiendo de la membrana plasmática capacitancia11,13,38,39 o Amperometría 40 de los medios de comunicación. Sin embargo, parche de sujeción requiere una instalación especial y puede no ser adecuado para todos los tipos de la célula. Amperometría medidas son capaces de rastrear exocitosis solamente si la carga se libera en las proximidades de los electrodos. Por lo tanto, usando proyección de imagen de células vivas ofrece una ventaja sobre estos métodos, permite no sólo para seguimiento en tiempo real de exocitosis, pero también permite la adquisición rápida y sencilla de los datos de la célula entera.

El seguimiento de FITC-los dextranos por microscopía de células vivas también ofrece algunas ventajas a otras células vivas métodos basados en la proyección de imagen. Por ejemplo, un método ampliamente usado es la microscopía de fluorescencia de reflexión interna total (TIRFM) de células cargado con una sonda fluorescente de SG o expresando un fluorescente etiquetado proteína SG carga o membrana proteína26,41, 42 , 43. la fuerza de este método radica en su capacidad para supervisar exclusivamente los sucesos que ocurren cerca de la membrana plasmática (en adelante como huella), por lo tanto eventos exocíticas. Sin embargo, esto es también el inconveniente de este método porque sólo la fracción celular que está al lado del cubreobjetos y cerca de la lente del microscopio puede ser había reflejada44. Si esas huellas representan de hecho la superficie de la membrana de la célula entera es todavía discutible45,46,47. En este sentido, utilizando un tinte pH-sensible como FITC-los dextranos y un microscopio estándar de fluorescencia o un microscopio confocal con un agujero de alfiler abierto permite la proyección de imagen de la célula entera, así capturar los eventos de total exocíticas que ocurren en ese celular.

Adicionales reporteros sensibles al pH que se utilizan para el estudio de exocitosis regulada por proyección de imagen de células enteras o TIRFM incluyen carga de SG o SG membrana proteína fusionada a phlourin, una variante de la GFP de pH-sensible. Los ejemplos incluyen NPY - phlourin-, β-hexoseaminidase-phlourin y synapto phluorin48,49,50,51,52. Mientras que la expresión de estas puntas de prueba puede representar más de cerca la composición endógena de las SGs, conlleva la transfección de las células y por lo tanto puede ser menos adecuado para las células que son difíciles de transfectar. Por lo tanto, cuando estudiando las células son difíciles de transfectar o bajo condiciones experimentales que requieren múltiples manipulaciones genómicas, es ventajoso el uso de un compuesto que puede ser suplido simplemente en el medio de cultivo celular, como FITC-los dextranos, . FITC-los dextranos también ofrece una ventaja sobre naranja de acridina (AO), otro tinte pH-sensible que ha sido utilizado para el rastreo de la exocitosis por celular vivo microscopia53,54,55,56 , 57 , 58. AO se ha demostrado para inducir la fotólisis de vesículas que dan lugar a destellos falsos, que no corresponden a la secreción real procesos de27. Por el contrario, FITC-los dextranos reflejan mejor eventos de secreción, probablemente debido a su baja producción foto-inducida del oxígeno reactivo27.

En particular, un enfoque alternativo para el estudio de exocitosis es mediante el seguimiento de la afluencia de un tinte, desde el medio exterior en la SG a través del poro de fusión que se abre durante este proceso. En este caso, el tinte se agrega al medio externo junto con el gatillo secretora. Entonces, cuando se abra el poro de fusión, el tinte se difunde en el SG59,60. Una clara ventaja de este método es que también ofrece la capacidad para estimar el tamaño del poro de fusión, mediante el uso de tintes de tamaño variable. Por ejemplo, dextranos de distinto peso molecular (MW), conjugado con diferentes fluoróforos, pueden utilizarse como colorantes extracelulares por el que el tamaño máximo de dextrano que puede penetrar la SG correspondería al tamaño del poro de fusión59, 61 , 62 , 63 , 64. Además, este enfoque no requiere el uso de una sonda de pH-sensibles. Sin embargo, una desventaja significativa es que la relación señal a ruido es muy baja, ya que una gran cantidad de colorante está presente en los medios de comunicación durante la adquisición de imágenes, resultando en la euforia.

En general, el uso de FITC-los dextranos como marcador para la exocitosis supera varios inconvenientes en métodos previamente divulgados, como señal a ruido ratio, toxicidad, seguimiento dinámico y complejidad.

Aquí describimos el uso de FITC-los dextranos supervisar exocitosis compuesta en la línea de la célula de mástil 3 RBL - 2H (en adelante como RBL, establecido principalmente por Eccleston et al. 65 y más clonados por Barsumian et al. 66), en respuesta a la inmunoglobulina E (IgE) / activación de antígeno (Ag).

Protocolo

1. preparaciones

  1. Preparación de medios de cultivo RBL
    1. Mezclar 500 mL de glucosa baja Dulbecco había modificado medio de águila (DMEM) con 56 mL de suero bovino fetal (FBS), 5,5 mL de solución de penicilina-estreptomicina-nistatina, 5,5 mL de la solución de L-glutamina 200 mM. Esto da lugar a glucosa baja DMEM suplementado con 10% FBS, estreptomicina 100 μg/mL, 100 unidades/mL de penicilina, 12 nistatina unidades/mL y 2 mM L-glutamina.
    2. Filtro de los medios de comunicación mediante el uso de un filtro de alto vacío de 0,22 μm tamaño de poro y tienda a 4 ° C.
  2. Mantenimiento de las células RBL.
    1. Crecer las células RBL para una confluencia máxima del 90% en un plato de 10 cm. Si el cultivo celular es saludable, las células deben tener forma de huso con ocasionales protuberancias.
    2. Para la división de la célula, separar las células del plato aspirando los medios de comunicación y reemplazar con 2 mL de solución de tripsina/EDTA B. incubar de 5 a 10 minutos en un ambiente humidificado de 5% CO2 a 37 ° C.
    3. Una vez que han separado las células, neutralizar la tripsina por añadir 2 mL de medio de cultivo, utilizando una pipeta y dividir las celdas en un 1:2-1:10 de la relación.
  3. Preparación de 20 x buffer de Tyrode
    1. Preparar un stock 20 x 8 mM NaH2PO4 en agua bidestilada (DDW), solución de 54 mM KCl, 20 mM MgCl2y 2.74 M de NaCl. Mezclar bien y guardar a 4 ° C.

2. cultivo de células RBL para microscopía de células vivas

  1. Preparación de solución de FITC-los dextranos.
    1. Mezcle 1 mg de polvo de FITC-los dextranos (150 K) por 1 mL de medio de cultivo (véase el paso 1.1.1). Para un completo cámara cubreobjetos, preparar 3 mL.
    2. Usando una unidad de filtro de jeringa de acetato de celulosa con tamaño de poro de 0,22 μm, filtro de la FITC-dextrano disuelto.
    3. Añadir mouse IgE a una concentración de 1 μg/mL.
  2. Siembra de las células RBL para la proyección de imagen
    1. El día antes de la proyección de imagen, los medios de comunicación desde la placa de cultivo de aspirar y reemplazar con 2 mL de solución de tripsina/EDTA B. incubar de 5 a 10 minutos en un ambiente humidificado de 5% CO2 a 37 ° C. Una vez que han separado las células, neutralizar la tripsina por añadir 2 mL de medio de cultivo.
    2. RBL cuenta las células usando un hemocitómetro y ajustar en consecuencia el volumen con medios de cultivo para obtener una concentración celular de 7.5 x 105/ml.
    3. Añadir 10 μl de la suspensión celular a un cubreobjetos cámara, Prellenado con FITC-los dextranos fresco complementa los medios de cultivo (esto resulta en siembra de 7.5 x 103 células en una cámara).
    4. Cultivar células RBL durante la noche en un ambiente humified de 5% CO2 a 37 ° C. Las células deben permanecer en un nivel del confluente para cerciorarse de que las células se separan y que es fácil de identificar cada celda individualmente bajo el microscopio.
  3. Transfección de células RBL - opcionales.
    1. Para exocíticas eventos en combinación con otras proteínas de la fluorescencia de etiquetado de imágenes, ver protocolo de la transfección de las células RBL en Azouz et al. 67

3. vivir la microscopía celular de exocitosis

  1. Preparación de soluciones:
    1. Preparar solución de tampón de un Tyrode final diluyendo la solución madre en DDW en una 1:20 dilución y suplemento con 20 mM de Hepes pH 7, 1,8 mM CaCl2, 1 mg/mL BSA y 5,6 mM de glucosa.
    2. Recién preparar un reactivo de secretagogue 20 x en buffer de Tyrode [1 μg/mL dinitrophenyl conjugada con albúmina sérica humana (DNP-tiene (Ag)) en nuestro caso, para una concentración de 1 x 50 ng/mL].
    3. Preparar una solución de cloruro de amonio 400 mM disolviendo el polvo en buffer de Tyrode.
  2. Preparación de las células.
    1. Lavar las cámaras cubreobjetos 3 veces por los medios de comunicación de la cámara de aspiración y rellenar con 300 μL de tampón de Tyrode, precalentada a 37 ° C. Finalmente, llenar la cámara con 300 μL de tampón de Tyrode, precalentada a 37 ° C.
    2. Colocar el cubreobjetos cámaras en cámara de la incubadora del microscopio. Asegúrese de que la cámara sea estable.
  3. Configuración del microscopio
    1. Para seleccionar una región de interés para realizar el seguimiento, encienda la fuente de luz fluorescente (tradicionalmente una lámpara de mercurio) y seleccione el filtro apropiado de la fluorescencia (elegir el filtro verde fluoróforos para ver FITC-los dextranos). Una vez que la región de interés está en foco y está en el centro del campo de visión, apague la fuente de luz para evitar blanqueo de foto y toxicidad.
      Nota: Algunos de la FITC-dextran incorporado en las células pueden retener de la fluorescencia. Esto es porque FITC-los dextranos también pueden ordenarse a compartimentos no lisosomal como endosomas.
    2. Encender la iluminación adecuada para la excitación de FITC. Si utilizando un microscopio láser, activar el láser de 488 nm. Emisión debe recogerse alrededor de 500-550 nm (FITC picos de emisión a 510-520 nm).
    3. Cuando se utiliza un microscopio confocal, abrir el poro al máximo. Esto permitirá utilizar toxicidad y baja energía de láser para evitar el blanqueo y asegurará la captura de eventos de la exocitosis de los planos de la célula.
    4. Calibrar el intervalo de tiempo entre adquisición de imagen.
      1. Distintas células pueden variar en su cinética de exocitosis regulada68. Para la proyección de imagen específica de exocitosis compuesta, se recomienda un intervalo de tiempo de al menos 5 segundos. Sin embargo, como regla general, para permitir la proyección de imagen rápida, asegúrese de que el tiempo de la adquisición de un solo cuadro es rápido.
      2. Cuando se utiliza un microscopio confocal de escaneo láser, establezca la dirección de exploración en bidireccional, no permite para calcular el promedio y establece la resolución a 512 x 512 (recomendado; las últimas dos disposiciones también ayudará a minimizar el blanqueo y toxicidad).
  4. Proyección de imagen de exocitosis.
    1. Imagen de células para la duración deseada, dependiendo del tipo de célula o secretagogos. En las células RBL accionadas con IgE/Ag, se producen más eventos de exocíticas en 15-20 min de activación.
    2. Para la activación de las células, agregar 16 μl de 20 x solución de secretagogue a la cámara.
  5. Confirmar presencia de FITC-los dextranos en las células.
    1. Para confirmar la presencia y localización de FITC-los dextranos a las SGs, añadir 16 μl de solución de cloruro de amonio (tenga cuidado de no mover la cámara para no perder el enfoque) a la cámara suavemente (esto hará que una concentración final de 20 mM). Esto inducirá la alcalización de las SGs y dequenching de fluorescencia FITC, que tendrá lugar dentro de los segundos.

Resultados

Figura 1a se representa esquemáticamente cómo FITC-los dextranos pueden actuar como reportero para regulada de la exocitosis y recapitular los diferentes modos de eventos exocíticas. En primer lugar, las células se incuban con FITC-los dextranos, que es internalizado por pinocitosis y ordenados para el SGs. Puesto que el SGs de MCs LROs, su bajo pH amortigua la fluorescencia del FITC, se muestra gránulos negros (A-C, I). Cuando las células se activan po...

Discusión

Aquí describimos cómo traza la fluorescencia de FITC-los dextranos en SGs puede utilizarse para capturar específicamente compuesto exocitosis eventos. Esto se logró mediante el ajuste del microscopio para adquirir una imagen cada 15 segundos, asegurando que se registrarán sólo eventos de larga duración en el tiempo y por lo tanto excluyendo eventos cortos que corresponderían a la exocitosis completo o exocitosis de beso-y-funcione. Para establecer el método, nos demostró caída de las Rab5 isoformas que se expr...

Divulgaciones

Los autores no declaran competencia interés financiero

Agradecimientos

Agradecemos al Dr. U. Ashery el regalo generoso de cDNA. Agradecemos a los Drs. G. Mass, L. Mittleman, M. Shaharbani y Y.Zilberstein de Sackler celular & Molecular Imaging Center por su inestimable asistencia con microscopía. Este trabajo fue apoyado por la binacional Estados Unidos-Israel Science Foundation (grant 2013263 R. Sagi-Eisenberg, I. Hammel y S.J.Galli) y conceder 933/15 de la Israel Science Foundation, fundada por la Academia de Israel de Ciencias (R.Sagi-Eisenberg ) y las subvenciones de NIH U19 AI 104209 y AR067145 R01 (a S.J. Galli).

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
DMEM low glucoseBiological Inductries01-050-1A
Fetal bovine serumGibco12657
Pen-strep-nystatin solutionBiological Inductries03-032-1B
L-Glutamine 200 mM solution Biological Inductries03-020-1A
FITC dextran 150KSigma-Aldrich46946-500MG-F
Trypsin/EDTA Solution BBiological Inductries03-052-1AWarm in 37 °C water bath before use
Top-vacuum filter of 0.22 µm pore size Sigma-AldrichCLS430769-1EA
Cellulose acetate syringe filter unit, 0.22 µm pore sizeSartorius16534K
Chambered coverglass Thermo scientific155411
Corning tissue-culture treated culture dishesSigma-AldrichCLS430167
Bovine serum albuminSigma-AldrichA4503
Anti-DNP monoclonal IgESigma-AldrichD8406
DNP-HSA (Ag)Sigma-AldrichA6661 Avoid direct light exposure
Hepes buffer 1M, pH 7.4Biological Inductries03-025-1B
CaCl2MERK102382
GlucoseBDH Laboratories284515V
Ammonium chlorideMERK1145
PIPES dipotassium saltSigma-Aldrich108321-27-3
Calcium acetate hydrateSigma-Aldrich114460-21-8
Magnesium acetate tetrahydrateSigma-AldrichM5661
Potassium glutamate (L-Glutamic acid potassium salt monohydrate)Sigma-AldrichG1501
NaH2PO4MERK6346
NaClMERK106404
MgCl2MERK105833
KClMERK104936
Electroporator BTXECM830
Confocal microscope, ZeissZeissLSM 5 Pascal, Axiovert 200MUsed in Figure 3. Equipped with an electronic temperature-controlled
airstream incubator
Confocal microscope, ZeissZeissLSM 800, Axio Observer.Z1 /7Used in Figure 2. Equipped with a GaAsP detector an electronic temperature-controlled
airstream incubator
Confocal microscope, LeicaLeicaSP5Used in Figure 1. Equipped with a leica HyD detector and an top-stage incubator (okolab)
RBL-2H3 cellsRBL-2H3 cells were cloned in the lab of Reuben P. Siraganian. See reference 67

Referencias

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