بروتوكول تجريبي لفحص ملفات تعريف الاستجابة السلوكية في الأسماك اليرقات: تطبيق على الكافيين منشط للأعصاب

Summary

نقدم هنا، بروتوكولا لدراسة اليرقات الزرد والسمينة المنوه غليظة الرأس الحركي الأنشطة والاستجابات فوتوموتور (PMR) باستخدام برامج تتبع الآلي. عندما تدمج المشتركة المقايسة علم السموم، تقدم تحليلات لهذه السلوكيات أداة تشخيصية لفحص بيواكتيفيتي الكيميائية. يتم وصف هذا البروتوكول استخدام الكافيين، طراز نيوروستيمولانت.

Abstract

يتزايد استخدام نماذج الأسماك والسلوكيات في مجال العلوم البيولوجية الطبية؛ ومع ذلك، طويل الأسماك موضوع دراسات السمية الإيكولوجية والفسيولوجية. استخدام الآلي منصات التعقب الرقمي، يتم حشد الجهود التي بذلت مؤخرا في الأعصاب الأسماك اليرقات السلوك الحركي لتحديد الأهداف العلاجية المحتملة للجزيئات الصغيرة رواية. مشابهة لهذه الجهود، البحوث في مجال العلوم البيئية والصيدلة النسبية وعلم السموم بدراسة السلوكيات المختلفة لنماذج الأسماك كأدوات التشخيص في تقييم مستويات الملوثات والرصد في الوقت الحقيقي للمياه السطحية التهديدات الملوث. بينما الزرد نموذج أسماك يرقات شعبية في علوم الطب الحيوي، غليظة وضع نموذج موحد لأسماك يرقات في علم السموم الإيكولوجية. ولسوء الحظ، تلقي اليرقات غليظة الرأس السمينة أقل بكثير من الاهتمام في الدراسات السلوكية. هنا، علينا تطوير وإثبات بروتوكول سلوكية الشخصية باستخدام الكافيين كطراز نيوروستيمولانت. على الرغم من أن الردود فوتوموتور من الأسماك تتأثر أحياناً بالكافيين، الزرد كان ملحوظا أكثر حساسية فوتوموتور والنهاية الحركية، التي ردت على المستويات ذات الصلة بيئياً. هناك حاجة إلى دراسات مستقبلية تفهم حساسية السلوكية مقارنة الاختلافات بين الأسماك مع العمر والوقت من اليوم، وتحديد ما إذا كانت الآثار السلوكية مماثلة سوف تحدث في الطبيعة ويكون مؤشرا للنتائج السلبية على الفرد أو السكان مستويات التنظيم البيولوجي.

Introduction

على الرغم من أن تستخدم نماذج الأسماك متزايدة لدراسات الطب الحيوي، الأسماك بشكل روتيني استخدمت الدراسات الإيكولوجيا وعلم وظائف الأعضاء، لدراسة تلوث المياه السطحية، وأن نفهم عتبات السمية للمواد الكيميائية. مثل هذه الجهود ضرورية للتلوث الكيميائي يمكن أن تنال من النظم الإيكولوجية المائية ويعرض للخطر نوعية مصدر إمدادات المياه^1،2. وحتى معظم المواد الكيميائية المتداولة في التجارة، غير أن الافتقار إلى معلومات السموم الأساسية³.

فحوصات الحيوان النموذجية المستخدمة تقليديا في اختبار السمية التنظيمية هي كثيفة الموارد ولا يمكن توفير إنتاجية عالية، أوائل الطبقة الفحص اللازمة لسمية اختبار في القرن الحادي والعشرين⁴. وفي وقت لاحق، هناك دفعة متزايد إلى اعتماد واستخدام نماذج في المختبر يمكن أكثر سرعة وكفاءة فحص المركبات للأنشطة البيولوجية^3،5. على الرغم من أن الخلية على أساس نماذج تتيح فرصاً عديدة، أنها غالباً ما تفتقر إلى تعقيد البيولوجية، وهكذا لا تراعي العديد من العمليات الهامة الكائن الحي كله، بما في ذلك التمثيل الغذائي⁶.

الزرد هو نموذج حيوان الطبية مشتركة التي تكتسب شعبية كنموذج بديل في علم السموم المائية وعلم السموم الإيكولوجية^7،8. ونظرا لصغر حجمها، والتطور السريع، والخصوبة العالية، يمكن استخدام نماذج الأسماك سرعة وكفاءة الشاشة المواد الكيميائية بيواكتيفيتي وسمية على نطاق الحي كله⁹. مع معونة برامج التتبع الآلي، توفر السلوكيات الزرد اليرقات المحسنة أداة التشخيص المساعدة في فحص الملوثات السمية^10،11. وقد أثبتت الدراسات في مجال العلوم الصيدلانية أن نهايات سلسلة التفاعل الحركي الزاخر بالمعلومات الكيميائية آليات العمل، ويمكن استخدامها لسلوكيات النمط الظاهري، وثم يجوز مبدئياً تحديد الأهداف سوبسيلولار لجزيئات رواية^{12، 13}. حين الزرد نموذج أسماك يرقات شعبية في علوم الطب الحيوي، غليظة هو نموذج السمكية المشتركة، إيكولوجيا هاما الذي يتم استخدامه لدراسات السمية الإيكولوجية وخلال المحتملين (مثلاً، تقييمات كيميائية جديدة) و التقييمات البيئية بأثر رجعي (مثلاً المياه السطحية المحيطة أو رصد تصريف النفايات السائلة مياه الصرف الصحي). ولسوء الحظ، تلقي الاستجابات السلوكية للأسماك اليرقات اهتماما ملحوظا أقل مما الزرد. لدينا الأبحاث الجارية مع نموذجين اليرقات السمكية المشتركة، تقترح الزرد والسمينة المنوه غليظة الرأس، يبدو أن الأسماك اليرقات السباحة أنماط فريدة من نوعها لأوضاع المتوقعة أو آليات عمل للمواد الكيميائية المختلفة. وبالتالي، توفر نقاط النهاية السلوكية القدرة على سرعة وحس مرهف بدراسة المواد الكيميائية السمية وتحديد الأهداف سوبسيلولار للملوثات الصناعية الكيميائية وغيرها، لا سيما من خلال تقييمات مبكرة الطبقة.

هنا، نحن تقرير وضع بروتوكول لدراسة ملامح الاستجابة السلوكية في الأسماك اليرقات. نبدي هذه الأساليب باستخدام الكافيين، من طراز نيوروستيمولانت ومن الملوثات المائية مشتركة التي يتم تقديمها للنظم المائية عن طريق التصريف من محطات العلاج بعد الاستهلاك البشري للأطعمة، والمشروبات، و المستحضرات الصيدلانية التي وضعت مع¹⁴من الكافيين. علينا أن ندرس الاستجابة السلوكية للكافيين في كلا اليرقات الزرد والسمينة المنوه غليظة الرأس، بما في ذلك تغيير مفاجئ في حالة الإضاءة، التي كثيرا ما يشار إلى كرد فوتوموتور (PMR) أثناء الدراسات الصيدلانية مع الأجنة واليرقات الزرد^13،15. كذلك فإننا نحدد آثار الكافيين عبر عدة نقاط النهاية الحركي وضع ملامح المواد الكيميائية استجابة لكل طراز الأسماك. مستويات العلاج الكافيين المستخدمة في هذه الدراسة تمثل المنحنيين العلوي من توزيعات التعرض استناداً إلى القيم البيئية المقاسة من الكافيين¹⁶. نحن تشمل أيضا علاجات قياسها للأسماك اليرقات LC₅₀ القيم، وقيمة بدل المخاطر العلاجية (THV)، بتركيز الأدوية في المياه التي من المتوقع أن تسفر مستويات البلازما في الأسماك متسقة مع جرعة بلازما علاجية بشرية.

Protocol

دراسات في هذا البروتوكول عموما اتبع التصميم التجريبي الموحد وأوصت المبادئ التوجيهية للتحليل الإحصائي عن وكالة حماية البيئة الأمريكية (وكالة حماية البيئة رقم 2000.0) للأسماك، ومنظمة "التعاون الاقتصادي" و التنمية الزرد (في الميدان رقم 236). يمكن تعديل هذه النماذج التجريبية (مثل، زيادة النسخ المتماثل) ضمن البروتوكول الحالي للدراسات المستقبلية. الاستزراع السمكي تتبع ظروف سبق نشر الأدب¹⁷. يتبع جميع تجريبية إجراءات الأسماك ثقافة البروتوكولات ورعاية الحيوان المؤسسية واللجنة استخدام البروتوكولات المعتمدة في جامعة بايلور.

1-تعريض الأسماك للعلاج الكيميائي

1. تحضير الكافيين الحلول التعرض بتذويب الكافيين في المياه الصلبة المعاد تشكيلها. إجراء تخفيف تسلسلي المناسبة بإضعاف أعلى العلاج الكافيين مع المياه الثابت لإنتاج أقل مستويات العلاج الكافيين.
   ملاحظة: يلخص الجدول 1 كل مستوى من مستويات العلاج المستخدمة في هذه التجربة.

	الزرد			غليظة
العلاج	تركيز الكافيين الاسمية (مغ/لتر)	تركيز الكافيين المقاسة (مغ/لتر)	العلاج	تركيز الكافيين الاسمية (مغ/لتر)	تركيز الكافيين المقاسة (مغ/لتر)
عنصر التحكم	0	< اللد	عنصر التحكم	0	< اللد
عشير ال 75 *	0.001	0.001	عشير ال 75 *	0.001	0.001
الخامسة والتسعون عشير *	0.039	0.013	الخامسة والتسعون عشير *	0.039	0.009
99-عشير *	0.412	0.361	99-عشير *	0.412	0.310
THV	4.07	3.81	THV	4.07	4.12
التركيز المميت، 50 10%	48.46	46.66	التركيز المميت، 50 10%	14.1	14.7
التركيز المميت، 50 40%	193.82	186.67	التركيز المميت، 50 40%	56.38	53.91

الجدول 1: علاجات تجريبية الكافيين لتجارب المنوه غليظة الرأس الزرد وغبي. وترد القيم الاسمية ويقاس من الكافيين لكل معاملة. * الكافيين العلاجات المستخدمة في هذه الدراسة تمثل المنحنيين العلوي من توزيعات التعرض استناداً إلى القيم البيئية المقاسة من الكافيين¹⁶. THV: قيمة بدل المخاطر العلاجية. اللد: الحد من الكشف عن

2. من أجل الحل المعدة في شامبيرس التعرض الفردية. استخدام قنينة الزجاج 100 مل تعبئة مع 20 مل من محلول التعرض للدوائر التعرض الزرد وقنينة 500 مل مع 200 مل من محلول التعرض السمينة المنوه غليظة الرأس التعرض الدوائر.
3. استخدام ماصة نقل، مكان الإخصاب 10 الزرد الأجنة، الذين تتراوح أعمارهم بين 4 – 6 ح وظيفة (hpf) في كل من أربع دوائر تكرار التعرض للمعاملة الواحدة.
4. تتراوح أعمارهم بين 10 مكان السمينة المنوه غليظة الرأس اليرقات خلال 24 ساعة الفقس في كل من الدوائر الثلاث تكرار التعرض للمعاملة الواحدة. لاستيعاب حجم أكبر من اليرقات السمينة المنوه غليظة الرأس، قطع غيض ماصة نقل قبل النقل.
5. المحافظة على تجارب الزرد في 16:8 ح ضوء: الظلام كبيرة ودرجة حرارة ثابتة من 28 ± 1 درجة مئوية. استخدام نفس النظام كبيرة للدراسات المنوه غليظة الرأس السمينة، ولكن عند درجة حرارة 25 ± 1 درجة مئوية.
6. بعد 96 ساعة تعرض للمواد الكيميائية، ألواح تحميل الأسماك الفردية في آبار منفصلة من 48 (الزرد) و 24 (غليظة).
   1. لضمان أن كل جيدا يحتوي على وحدة تخزين مساوية للحل، نقل اليرقات الزرد إلى 48 لوحات جيدا باستخدام أوتوبيبيتي ميليلتر 5,000 لوحدة تخزين ميليلتر 1,000 كل بئر. استخدام أوتوبيبيتي الانسحاب ونقل اليرقات الزرد والتعرض للحل في وقت واحد.
   2. نظراً لحجمها أكبر، نقل اليرقات غليظة الرأس السمينة استخدام ماصة نقل مع تلميح قطع. قبل نقل اليرقات غليظة الرأس السمينة إلى الآبار الفردية، ملء كل جيدا إلى 2,000 ميليلتر باستخدام أوتوبيبيتي. عند نقل اليرقات السمينة الفردية إلى الآبار، ضع طرف ماصة نقل في حل جيد والسماح للأسماك السباحة من طرف الماصة في البئر.

2-معايرة المعلمات تتبع الفيديو

1. قبل التدابير السلوكية، تعيين المعلمات الملاحظة والمعايرة في برنامج مسار الفيديو (انظر الجدول للمواد).
   1. ضع لوحة جيدا في قاعة التسجيل مع الأسماك اليرقات على الأقل 1 في بئر فردية. استخدم لوحة والأسماك المرتبطة بها كتمثيل لتعيين معلمات المعايرة.
   2. في برنامج مسار الفيديو، انقر فوق "ملف | إنشاء بروتوكول "، الذي سيتم فتح مربع حوار" معالج إنشاء بروتوكول ". في الحقل "الموقع" العد، أدخل عدد الآبار الأفراد من لوحة جيدا وثم انقر فوق "موافق".
   3. في الجزء العلوي من الشاشة، انقر فوق "عرض | ملء الشاشة "، الذي سيدفع النظام لعرض طريقة عرض كاميرا علوية للوحة جيدا.
   4. انقر فوق رمز "رسم المناطق"، الذي يظهر كأشكال متعددة الألوان الثلاثة. إلى يمين اللوحة جيدا منطقة العرض، حدد رمز الدائرة في الحقل المسمى "المناطق".
   5. استخدام المؤشر لتحديد الفيديو دائرية تتبع منطقة في أعلى اليسار من لوحة جيدا جيدا. حدد "علامة أعلى اليمين" ومخطط ثم منطقة العرض من أعلى اليمين جيدا. ثم حدد "علامة أسفل" لتحديد الجزء السفلي على حق.
      ملاحظة: بعد رسم المخطط الدائري، موقفها المحتمل ستحتاج إلى تعديل.  لضبط موضع المخطط التفصيلي، انقر فوق "تحديد" وثم استخدم المؤشر لتحريك المساحة المحددة. أيضا، يمكن تكرار الخطوط العريضة بواسطة النقر فوق "نسخ" و "لصق" ثم.
   6. بعد الأعلى اليسار، أعلى اليمين، وتم تحديد القاع على حق تتبع المناطق، انقر فوق "بناء" لمطالبة البرنامج تلقائياً تحديد مجالات عرض الآبار المتبقية.
   7. في المنطقة المسماة "معايرة"، انقر فوق "رسم جدول". استخدم المؤشر لرسم خط أفقي عبر اللوحة. حالما يتم رسم الخط، سوف يظهر مربع حوار المسمى "قياس المعايرة". أدخل طول اللوحة جيدا، وانقر فوق "موافق".
   8. قم بإنهاء إدارة الرسم بالنقر على أيقونة "رسم المناطق".
   9. انقر فوق رمز "البلاط".  باستخدام المؤشر، تسليط الضوء على كافة المربعات التي تظهر على شاشة عرض بحيث يكون كل مربع أخضر.
      ملاحظة: يظهر رمز البلاط كمجموعة من ستة مربعات صغيرة فردية
   10. "انقر فوق عرض | ملء الشاشة ".  إلى يمين اللوحة مساحة العرض، انقر فوق "بكج" في المربع المسمى "عتبة الكشف". استخدام شريط التكيف عتبة لتعيين عتبة الكشف بكسل. مرة واحدة، يتم تحديد عتبة الكشف المناسبة بكسل، انقر فوق "تطبيق للفريق".
       ملاحظة: قد يحدد هذا البروتوكول عتبة الكشف 13 في وضع الأسود لالزرد الملاحظات وإلى 110 بطريقة شفافة للملاحظات المنوه غليظة الرأس السمينة.
   11. في المربع المسمى "حركة العتبة"، أدخل سرعة الحركة المطلوب تتبع المعلمات. حالما يتم تعيين سرعة المعلمات، انقر فوق "تطبيق للفريق".
       ملاحظة: يحدد هذا البروتوكول الحركات الصغيرة/الكبيرة في 20 مم/s والخاملة الصغيرة حركات الساعة 5 مم/s. هذه التحديدات البرنامج البرنامج لتعقب حركة الأسماك اليرقات على ثلاثة مستويات مختلفة السرعة: غير نشط (تجميد) = < 5 مم/s، الصغيرة (المبحرة) = 5 – 20 ملم/s، والكبيرة (الانفجار) = > 20 مم/s.
   12. انقر فوق "معلمات | بروتوكول معلمات "من القائمة المنسدلة. في مربع الحوار، حدد علامة التبويب "الوقت" إدخال وقت الملاحظة والوقت التكامل. بعد أن يتم إدخال معلمات انقر فوق "موافق".
   13. لتعيين أوقات كبيرة الضوء/الظلام وكثافة الضوء لكل كبيرة فتح إعدادات برنامج تشغيل ضوء الحوار مربع عن طريق تحديد "القيادة الضوء" من "المعلمات" القائمة المنسدلة.
       ملاحظة: انظر الفيديو بروتوكول لإعداد عدة الضوء الظلام فوتوبيريودس.
   14. بعد أن تم تعيين المعلمات تتبع الفيديو، إنقاذ بروتوكول المراقبة.
       ملاحظة: يلاحظ هذا البروتوكول سلوك الأسماك على مدى فترة 50 دقيقة يتضمن مرحلة التأقلم 10 دقيقة تليها 4 تغيير مراحل فاتح/داكن تتكون من فترتين الخفيفة 10 دقيقة وفترتين من فترات مظلمة 10 دقيقة. يتم تعيين الوقت التكامل قياس سلوك لكل دقيقة من المحاكمة السلوكية 50 دقيقة.

3-مراقبة الأسماك اليرقات الحركي والسلوك فوتوموتور

1. ضع لوحة جيدا التي تحتوي على الأسماك التجريبية في قاعة تسجيل السلوكية.
2. في شريط الفيديو تتبع البرامج، فتح بروتوكول تتبع وضعت في الخطوة 3.
3. في عارض تتبع الفيديو، تحقق للتأكد من أن جميع اليرقات مرئية على شاشة الكمبيوتر، أن اليرقة فردي واحد فقط موجود في كل بئر، وأنه قد تمت محاذاة الآبار الفردية ضمن مجالات المراقبة التي تم تعريفها في الخطوتين 2.1.5 و 2.1.6.
4. انقر على "التجربة | تنفيذ ".
   ملاحظة: سيقوم النظام بطلب للمستخدم بتوفير اسم وموقع لحفظ بيانات المراقبة.
5. مرة واحدة الاسم وحفظ موقع الملاحظة التي تم تحديد البيانات، انقر على أيقونة "عدة صور لايف" لتسليط الضوء على جميع مجالات العرض المعرفة مسبقاً
   ملاحظة: هذا الرمز الموجود في الجزء العلوي من شاشة الكمبيوتر ويظهر كمربع مقسمة إلى أربع مربعات صغيرة. النقر فوق هذا الرمز سيتم تسليط الضوء على جميع مجالات العرض المعرفة مسبقاً.
6. إغلاق لوحة دائرة التسجيل وانقر فوق "الخلفية | بدء تشغيل "على جهاز الكمبيوتر.

4-تحليل البيانات السلوكية

1. لاسترداد بيانات نشاط الأسماك اليرقات، فتح جدول البيانات، التي يتم تصنيف تلقائياً بتتبع البرامج وهو في المجلد المحدد بواسطة المستخدم قبل بدء المحاكمات السلوكية (الخطوة 3، 4).
2. الرجوع إلى الأرقام 1A و 1B لقياسات تمثيلية ساذجة النشاط الحركي الزرد لم يتعرضوا واليرقات السمينة المنوه غليظة الرأس، على التوالي. الرجوع إلى الأرقام 1 ود 1 للحسابات من جهة أخرى، والتي تدرس فعالية حجم حركة الفرق بين التحولات الخفيفة للظلام أو الظلام إلى النور.

رقم 1: مثال لنشاط خط الأساس لم يتعرضوا الزرد (A و B) وغليظة (ج ود). المسافة يعني (± SEM) سبح الزرد (A) وتعطي غليظة (ج) بنقط كل فواصل زمنية دقيقة واحدة تمثل النشاط. يتم قياس الظلام اثنين وفترتين الخفيفة من الاستجابات فوتوموتور. آخر (أ، ج، ه وز) والأولى (ب، د، و، وح) المستخدمة لحساب الردود ورود. فوتوموتور من الزرد (ب) دقيقة لكل كبيرة وغليظة (د) تقاس كالتغير في المسافة يعني (±SEM) سافر بين اللحظة الأخيرة كبيرة أولى والدقيقة الأولى من الفترة التالية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

النتائج

لم تختلف مستويات العلاج الكافيين ملحوظ أثناء تجارب 96 ساعة مع المنوه الزرد وغبي. على سبيل المثال، يعرض الجدول 1 تركيزات التحقق من الناحية التحليلية لكل مستوى العلاج. هذا البروتوكول التحقق من عينات المياه لمستويات العلاج الكافيين بتمييع النظائر المشعة اللوني السائل جنبا إلى جنب الكتلي (LC-MS/MS) عموما بعد²⁸من أساليب سبق الإبلاغ عنها. وكان كمياً تشكيل paraxanthine، المستقلب الرئيسي من الكافيين، أيضا. ويرد وصف هذه الإجراءات التحليلية في معلومات تحليلية إضافية. بسبب أوجه الشبه بين الاسمية وتحليلية للتحقق من العلاجات، يتم عرض مستويات العلاج الاسمية طوال الفترة المتبقية من هذه المخطوطة. الكافيين تعديل السلوكيات المنوه غليظة الرأس الزرد والسمينة بشكل ملحوظ. ومع ذلك، كانت الردود الحركي الزرد دائماً أكثر حساسية للكافيين من الأسماك. نقاط النهاية السلوكية الأكثر حساسية لليرقات غليظة الرأس الزرد والسمينة تأثرت الكافيين بتركيز 0.039 مغ/ل. 2 جدول يلخص تركيزات أقل من التأثير الملاحظ (لوكس) ولا توجد تركيزات التأثير الملاحظ (NOECs) لكل نقطة نهاية السلوكية في كلا النموذجين الأسماك.

الزرد			غليظة
نقطة النهاية	LOEC (مغ/لتر)	NOEC (مغ/لتر)	نقطة النهاية	LOEC (مغ/لتر)	NOEC (مغ/لتر)
المسافة الإجمالية الظلام	0.412	0.039	المسافة الإجمالية الظلام	−	56.38
الضوء المسافة الإجمالية	48.46	4.07	الضوء المسافة الإجمالية	−	56.38
مجموع التهم الظلام	0.412	0.039	مجموع التهم الظلام	−	56.38
مجموع التهم الخفيفة	48.46	4.07	مجموع التهم الخفيفة	−	56.38
الانفجار بعد حلول الظلام	−	193.82	الانفجار بعد حلول الظلام	−	56.38
انفجار الضوء المسافة	193.82	48.46	انفجار الضوء المسافة	−	56.38
انفجار التهم الظلام	193.82	48.46	انفجار التهم الظلام	−	56.38
انفجار الضوء التهم	193.82	48.46	انفجار الضوء التهم	−	56.38
انفجار مدة الظلام	193.82	48.46	انفجار مدة الظلام	−	56.38
انفجار الضوء مدة	−	193.82	انفجار الضوء مدة	−	56.38
المبحرة مسافة الظلام	0.412	0.039	المبحرة مسافة الظلام	−	56.38
المبحرة مسافة الضوء	48.46	4.07	المبحرة مسافة الضوء	−	56.38
المبحرة التهم الظلام	0.412	0.039	المبحرة التهم الظلام	−	56.38
المبحرة التهم الخفيفة	48.46	4.07	المبحرة التهم الخفيفة	−	56.38
المبحرة مدة الظلام	0.412	0.039	المبحرة مدة الظلام	−	56.38
المبحرة مدة الضوء	48.46	4.07	المبحرة مدة الضوء	−	56.38
تجميد مسافة الظلام	0.412	0.039	تجميد مسافة الظلام	0.039	0.001
تجميد المسافة الخفيفة	0.039	0.001	تجميد المسافة الخفيفة	−	56.38
تجميد حساب الظلام	0.412	0.039	تجميد حساب الظلام	−	56.38
تجميد حساب الخفيفة	48.46	4.07	تجميد حساب الخفيفة	−	56.38
تجميد المدة الظلام	−	193.82	تجميد المدة الظلام	56.38	14.10
تجميد المدة الخفيفة	48.46	4.07	تجميد المدة الخفيفة	−	56.38
من جهة أخرى 1 المظلمة	48.46	4.07	من جهة أخرى 1 المظلمة	0.039	0.001
الضوء على جهة أخرى 1	48.46	4.07	الضوء على جهة أخرى 1	−	56.38
من جهة أخرى في الظلام 2	48.46	4.07	من جهة أخرى في الظلام 2	−	56.38
2 من جهة أخرى على ضوء	48.46	4.07	2 من جهة أخرى على ضوء	−	56.38
انفجار الظلام من جهة أخرى 1	−	193.82	انفجار الظلام من جهة أخرى 1	−	56.38
انفجار الضوء 1 من جهة أخرى	−	193.82	انفجار الضوء 1 من جهة أخرى	−	56.38
انفجار الظلام من جهة أخرى 2	193.82	48.46	انفجار الظلام من جهة أخرى 2	−	56.38
انفجار الضوء 2 من جهة أخرى	−	193.82	انفجار الضوء 2 من جهة أخرى	−	56.38
من جهة أخرى 1 المظلمة المبحرة	48.46	4.07	من جهة أخرى 1 المظلمة المبحرة	−	56.38
المبحرة الضوء من جهة أخرى 1	48.46	4.07	المبحرة الضوء من جهة أخرى 1	−	56.38
المبحرة من جهة أخرى 2 داكن	48.46	4.07	المبحرة من جهة أخرى 2 داكن	−	56.38
الضوء المبحرة 2 من جهة أخرى	193.82	48.46	الضوء المبحرة 2 من جهة أخرى	56.38	14.10
من جهة أخرى 1 المظلمة تجميد	48.46	4.07	من جهة أخرى 1 المظلمة تجميد	−	56.38
تجميد الضوء 1 من جهة أخرى	193.82	48.46	تجميد الضوء 1 من جهة أخرى	−	56.38
تجميد الظلام من جهة أخرى 2	48.46	4.07	تجميد الظلام من جهة أخرى 2	−	56.38
تجميد الضوء 2 من جهة أخرى	193.82	48.46	تجميد الضوء 2 من جهة أخرى	−	56.38

الجدول 2: الزرد والسمينة المنوه غليظة الرأس NOECs السلوكية ولوكس للكافيين. لا يوجد تركيز تأثير لاحظ (NOEC) وقيم أدنى لاحظ تأثير تركيز (LOEC) (مغ/لتر) لكل من الضوء/الظلام السباحة النهاية النشاط والردود فوتوموتور المنوه الزرد والسمينة تتعرض للكافيين. شرطات تشير إلى أن أي آثار لوحظت في نقطة معينة عبر جميع مستويات العلاج.

ويعرض الشكل 2 مجموع النشاط الحركي وورود من الزرد والسمينة المنوه غليظة الرأس عقب 96 ساعة من التعرض لمادة الكافيين. فقد تأثرت اليرقات غليظة الرأس السمينة ورود تم استبدالها بواسطة الكافيين في مستويات أدنى من المعاملة (0.038 مغ/لتر) من الزرد، ولكن عدد أكبر كثيرا من النهاية فوتوموتور في الزرد. غيرت أعلى مستوى العلاج الكافيين (193.82 مغ/لتر) من جهة أخرى في الزرد، الذي كانت هذه الردود المعاكس تماما من عناصر التحكم. في هذا المستوى العلاج مرتفعة، غير أن ورود انخفض في الظلام وزيادة في ضوء الظروف.

رقم 2: نشاط السباحة والردود فوتوموتور الزرد (A و B) وغليظة (ج ود) بعد التعرض ح 96 للكافيين. المسافة يعني (± SEM) سبح الزرد (A) وتعطي غليظة (ج) بنقط كل الفواصل 1-دقيقة تمثل النشاط. يتم قياس الاستجابات فوتوموتور الزرد (ب) وغليظة (د) كتغيير المسافة الإجمالية يعني (± SE) سافر بين last minutes من كبيرة الأولى والدقيقة الأولى من الفترة التالية. وقيست الظلام اثنين واثنين من الردود الخفيفة فوتوموتور الفترة. ما مجموعة 24 الزرد (4 replicates كل من اليرقات 6) و 12 (3 replicates كل من اليرقات 4) المنوه السمينة استخدمت للمراقبة السلوكية. ف < 0.10؛ ف < 0.05؛ ف < 0.01. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

بالإضافة إلى قياس ورود اليرقات، وقد تم تحليل النشاط الحركي الفاتحة والداكنة عبر ثلاث عتبات السرعة لمسافة نقل، وعدد من الحركات والمدة للحركات. يتم استخدام هذه البيانات لوضع ملامح الاستجابة السلوكية للكافيين (الشكل 3، التكميلية الشكل 1). في كل من هذه النماذج الأسماك، تتأثر الكافيين يعوق النشاط إلى حد كبير في جميع نهايات سلسلة التفاعل الحركي. نماذج كلا السمك أظهرت زيادة النشاط في عتبات سرعة انفجار عقب التعرض للكافيين، على الرغم من عدم كثيرا. مماثلة لنتائج الملاحظات من جهة أخرى، الكافيين تنفذ عددا أكبر من الزرد الحركي نقاط النهاية. في الواقع، غيرت الكافيين إلى حد كبير عدة استجابات الحركية تحت ظروف مظلمة في مستويات واقعية بيئياً أدناه THV. ومع ذلك، لم تتأثر السمينة المنوه غليظة الرأس النشاط الحركي إلى حد كبير تحت ظروف الإضاءة بأي مستوى العلاج.

الشكل 3: ملامح استجابة لليرقات البلم الزرد وغبي بعد التعرض ح 96 للكافيين. يعني الزرد الظلام (A) والضوء (ب) السباحة النشاط مقارنة يعني غليظة المظلمة (ج) والضوء (د) النشاط بعد التعرض ح 96 للكافيين. رسم البيانات يمثل النشاط فوتوبيريودس الظلام 10 دقيقة أكثر من اثنين وهما فوتوبيريودس الخفيفة 10 دقيقة لكل طراز الأسماك. هو تطبيع البيانات لعنصر التحكم، التي تمثل في المحور 0 في كل شخصية. معلمات السلوكية تشمل المسافة سبح، عدد من الحركات (التهم)، ومدة كل حركة عبر مستويات سرعة 3، تتضاعف (> 20 مم/s)، المبحرة (5-20 ملم/s)، وتجميد (< 5 مم/ثانية). بالإضافة إلى أنماط الحركة في كل من عتبات السرعة، المسافة الإجمالية سبح، ويمثل العدد الإجمالي للحركات. ↑ يمثل زيادة كبيرة في النشاط بالمقارنة مع التحكم و ↓ يشير إلى انخفاض كبير في النشاط بالمقارنة مع عنصر التحكم. ما مجموعة 24 الزرد (4 replicates كل من اليرقات 6) و 12 (3 replicates كل من اليرقات 4) غليظة حيث تستخدم في الملاحظات السلوكية لكل مجموعة. ف < 0.10؛ ف < 0.05؛ ف < 0.01. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الإضافي رقم 1: فوتوموتور ردود الزرد (A و B) وغليظة (ج ود) عبر ثلاثة سرعة العتبات. الزرد (أ وب وج) والسمينة المنوه غليظة الرأس اليرقات (د، ه، و) فوتوموتور الردود عبر ثلاثة سرعة عتبات (تجميد: 20 مم/s) بعد التعرض 96 ساعة للكافيين. يتم قياس الاستجابات فوتوموتور من الزرد والسمينة المنوه غليظة الرأس كالتغير في المسافة الإجمالية يعني (±SE) سافر بين last minutes من كبيرة الأولى والدقيقة الأولى من الفترة التالية. وقيست الظلام اثنين واثنين من الردود الخفيفة فوتوموتور الفترة. ما مجموعة 24 الزرد (4 replicates كل من اليرقات 6) و 12 (replicates 3 يرقات 4) المنوه السمينة استخدمت للمراقبة السلوكية. * ف < 0.01 اضغط هنا لتحميل هذا الملف.

Discussion

عند تحديد مستويات المعالجة الكيميائية لدراسات علم السموم السلوكية، يجب النظر في عدة عوامل. واختيرت مستويات العلاج الكافيين في هذه الدراسة استناداً إلى القيم العليا المئوي لسيناريوهات التعرض البيئية المتوقعة من مياه الفضلات السائلة¹⁶. عندما يكون ذلك ممكناً، ونحن بشكل روتيني تحديد مستويات العلاج لدراسات علم السموم المائية باستخدام تقييمات احتمالية التعرض للمراقبة البيئية^19،،من²⁰²¹. THV, الذي يمكن حسابه للأدوية، أدرجت أيضا كمستوى علاج في هذه الدراسة. تعرف بأنها تجمعات المياه المتوقعة مما يؤدي إلى جرعات علاجية البشرية (كم) للمستحضرات الصيدلانية في الأسماك²³THV القيم (مكافئ. 1)^22،23 وهي مستوحاة من البلازما الأولية النمذجة الجهود²⁴وهي يحسب استناداً إلى المادة الكيميائية في الدم: المياه تقسيم المعاملات (مكافئ. 2)²⁵.

THV = ج_{كحد أقصى} /سجل ف_{الأسلحة البيولوجية} (مكافئ. 1)

سجل ف_BW = سجل [(10^{0.73. log Kow} · 0.16) + 0.84] (مكافئ. 2)

هنا، نحن أيضا تحديد مستويات العلاج المقاسة بالنسبة إلى الزرد والسمينة المنوه غليظة الرأس قيم التركيز المميت، 50. ونحن نعتبر هذا النهج إجراء مقارنة مفيدة للاستجابات السلوكية، خاصة عند مقارنة عتبات لسلوكيات معينة مع نموذج أسماك عبر العديد من المواد الكيميائية. ويسهل كذلك حسابات الحاد لنسب المزمن، الذي يمكن أن يكون مفيداً دياجنوستيكالي في علم السموم المائية للدراسات الميكانيكية والتقييمات. تم الحصول على قيم التركيز المميت، 50 من المقايسة سمية الأولية وفقا للمبادئ التوجيهية الموحدة في الخطوة 2، 1.

في هذا البروتوكول، نحن نوظف التصاميم التجريبية المشتركة والتقنيات الإحصائية أوصت وكالة حماية البيئة الأمريكية، ومنظمة التعاون والتنمية أساليب موحدة لدراسات علم السموم مع نماذج الأسماك. على الرغم من أننا تقرير قيم p (مثلاً.، < 0.01، < 0.05، < 0.10)، الاختلافات الكبيرة (α = 0.10) حددت مستويات النشاط بين العلاجات باستخدام تحليل التباين (ANOVA) إذا الحياة الطبيعية والمعادلة من الافتراضات الفرق وتلبي. يتم إجراء في دونيت أو في توكي HSD المخصصة بعد الاختبارات لتحديد الاختلافات مستوى العلاج. لقد حدد هذا ألفا (α = 0.10) القيمة تقليل الأخطاء النوع الثاني، خاصة بالنسبة لأوائل الطبقة فحوصات وعندما يقتصر فهم حجم تأثير هامة بيولوجيا لنقاط النهاية السلوكية المداريين ونموذج الكائنات²⁶، بدلاً من استخدام إجراءات أكثر شيوعاً في مجال العلوم الطبية الحيوية لمقارنات متعددة (على سبيل المثال.، تصحيح بونفيروني لبيانات تسلسل الحمض النووي الريبي)²⁷.  الدراسات المستقبلية ضرورية لفهم تنوع هذه الاستجابات السلوكية، ويحتمل أن تكون تعديل تصاميم تجريبية (مثل، زيادة النسخ المتماثل) تبعاً لذلك.

هناك عدد من العوامل يمكن أن تؤثر في سلوك الأسماك اليرقات بالإضافة إلى التعرض للمواد الكيميائية. على سبيل المثال، الوقت من اليوم والعمر، وحجم جيدا، درجة الحرارة، حالة الإضاءة وحجم التعرض للحل في كل من الاعتبارات الهامة تمثل جيدا^11،30. لهذه الأسباب، ينبغي اتخاذ الاحتياطات التقليل من آثار العوامل الخارجية التي يمكن أن تؤثر في السلوك الحركي للأسماك اليرقات أثناء التجريب. ينبغي القيام بالملاحظات السلوكية في إطارات زمنية ضيقة (3 إلى 4 ح) وعبر فترات زمنية عند وقت الآثار اليوم من المتوقع أن يكون الحد الأدنى من التأثير على السلوك الحركي اليرقات¹¹. بالإضافة إلى ذلك، ينبغي أن يحتفظ الأسماك اليرقات في درجة حرارة متسقة (28 ± 1 درجة مئوية الزرد) و 24 ± 1 درجة مئوية لفهم وعلى دورة الضوء/الظلام محددة في درجة الحرارة التي تسيطر حاضنات طوال فترة التعرض. وبالإضافة إلى ذلك، ينبغي الإبقاء على درجة حرارة المختبر حيث يتم تسجيل السلوكيات لظروف تقارب الظروف التجريبية لتجنب التأثيرات درجة الحرارة في السلوكيات. علاوة على ذلك، ينبغي الإبقاء على الآبار المستخدمة خلال الملاحظات السلوكية في وحدة متسقة لكل الأسماك الفردية.

استخدمت ورود سابقا في مجال العلوم الطبية الحيوية لتحديد الأهداف العلاجية المحتملة للمركبات رواية^12،13الزرد اليرقات والأجنة. يوسع هذا البروتوكول في البحوث السلوكية السابقة مع الزرد باستخدام نقاط النهاية 38 للتحقيق بيواكتيفيتي الكيميائية للملوثات البيئية. على الرغم من أن الكافيين الملوثات المائية مشتركة مع إليه مفهومة للعمل (وزارة الزراعة)، تفتقر إلى العديد من المركبات في التجارة الهامة البيانات آليا. ولذلك، يمكن استخدام هذا البروتوكول لاكتساب المعرفة مواس للمركبات التي تفتقر إلى بيانات السمية، بما في ذلك المواد الكيميائية التجارية³⁹. وعلاوة على ذلك، ينص البروتوكول على أساليب اثنين من نماذج الأسماك الأكثر استخداماً. وكما لوحظ سابقا، بينما الزرد هو وضع نموذج موحد لأسماك الطبية الحيوية التي تزداد شعبية في علم السموم الإيكولوجية، والسمينة المنوه غليظة الرأس يستخدم عادة كنموذج إيكولوجية لتطبيقات التقييم البيئي، لكنه يتلق أقل نسبيا من الاهتمام في الدراسات السلوكية مع النظم الآلية الزرد بالمقارنة. على الرغم من أنه لا يزال هناك لا أساليب تنظيمية موحدة لدراسات علم السموم السلوكية الأسماك، يوفر هذا البروتوكول نهجاً لدعم الجهود في المستقبل.

وقد آثار الكافيين الاستجابة السلوكية في كل من نماذج الأسماك على المستويات التي تم الكشف عنها في البيئة المائية¹⁶. وضع رودريغيز-جيل et al. عام 2018 توزيعات التعرض البيئي العالمي في النظم المائية استناداً إلى قيم مقيسة من الكافيين¹⁶. على وجه التحديد، تقل 95 في المائة تركيزات المتوقعة من مياه الفضلات السائلة لوكس لنقاط النهاية السلوكية الأكثر حساسية من الزرد والسمينة المنوه غليظة الرأس في الدراسة الحالية (الجدول 2). على الرغم من أن العديد من الآثار السلوكية للكافيين لوحظت في الزرد (لا سيما في ظروف مظلمة) على المستويات ذات الصلة بيئياً، من غير الواضح ما إذا كانت هذه التعديلات السلوكية قد تحدث في التجمعات السمكية الطبيعية أو يؤدي إلى النتائج الضائرة المهمة إيكولوجيا. عتبات السلوكية الأسماك اليرقات على الرغم من المفيد لأغراض الفحص حساسة، والتشخيص، قد لا تكون ممثلة لمراحل تاريخ حياة أخرى أو من الأسماك في التجمعات الطبيعية. يبرر إجراء المزيد من البحوث لتحديد ما إذا كانت مشابهة عتبات الاستجابة السلوكية سوف تحدث في الطبيعة ويكون مؤشرا لنتائج سلبية على مستويات التنظيم البيولوجي الأفراد أو السكان.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
ViewPoint Zebrabox	ViewPoint		ZebraLab and ZebraLab platform for automated behavioral observations
Caffeine	Sigma-Aldrich	C0750-100G	Study chemical
Incubator	VWR	9110589	Maintains light/dark cycle and temperature for fathead minnow experiments
Incubator	Thermo Fisher Scientific	35824-636	Maintains light/dark cycle and temperature for zebrafish experiments
100 mL glass beakers	VWR	89000-200	Zebrafish exposure chambers
500 mL glass beakers	Pyrex	EW-34502-03	Fathead minnow exposure chambers
5,000 µL auto-pipette	Eppendorf	Research 5000	Used to fill individual wells in well plates
Transfer Pippettes	VWR	414-004-004	Used to transfer study organisms
48-well plates	Fisher Scientific	08-772-52	Larval zebrafish behavioral recording chambers
24-well plates	VWR	10062-896	Larval fathead minnow behavioral recording chambers
Calcium sulfate dihydrate	Sigma-Aldrich	C3771	For reconstituted hard water
Magnesium Sulfate	Sigma-Aldrich	M7506	For reconstituted hard water
Sodium Bicarbonate	Sigma-Aldrich	S5761	For reconstituted hard water
Potassium Chloride	Sigma-Aldrich	P9333	For reconstituted hard water
z-mod recirculating system	Marine Biotech Systems		Recirculating system to maintian zebrafish cultures
Statistical analysis software	Sigma Plot	Version 13.0	Used to analyze beahvioral data and produce figures
Statistical analysis software	Graphpad Prism	Prism 5	Used to produce figures
Autosampler/quaternary pumping system	Agilent Technologies	Infinity 1260 model	Analytical verification of caffeine treatment levels
Jet stream thermal gradient electrospray ionization source	Agilent Technologies		Analytical verification of caffeine treatment levels
Triple quadrupole mass analyzer	Agilent Technologies	Model 6420	Analytical verification of caffeine treatment levels
10 cm × 2.1 mm Poroshell 120 SB-AQ column (120Å, 2.7)	Agilent Technologies	685775-914T	Caffiene chromatography
MassHunter Optimizer Software	Agilent Technologies		Determine the ionization mode, monitored transitions, and instrumental parameters for caffeine/caffeine-d9 and paraxanthine/paraxanthine-d6