נסיוני לבחינת תגובה התנהגותית פרופילים בדגים זחל: ליישום הקפאין נוירו-ממריץ

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לבחון פעילויות זחל דג זברה, פאטהד מינו גינקולוגיות ותגובות photomotor (PMR) באמצעות תוכנת מעקב אוטומטי אנטי. כאשר שולבו במשותף הרעלים bioassays, ניתוחים של התנהגויות אלו מספקים כלי אבחון לבחון אתריים כימי. פרוטוקול זה מתואר באמצעות קפאין, neurostimulant מודל.

Abstract

מודלים של דגים, התנהגויות משמשים יותר ויותר במדעים הביו-רפואית; עם זאת, דגים כבר מזמן הנושא של מחקרים אקולוגיים, פיזיולוגיים, רעילות. שימוש אוטומטי מעקב דיגיטלי פלטפורמות, מאמצים שנעשו לאחרונה ב- neuropharmacology הם מינוף זחל דגים התנהגויות גינקולוגיות לזהות מטרות טיפוליות אפשריות עבור הרומן מולקולות קטנות. בדומה למאמצים הללו, מחקר מדעי הסביבה, פרמקולוגיה השוואתי, הרעלים הוא בחינת התנהגויות שונות של דגמי דגים כמו כלי אבחון וניטור בזמן אמת של פני המים עבור הערכה בשכבות של מזהמים של איומים מזהם. ואילו דג זברה הוא מודל פופולרי דגים זחל במדעים הביו-רפואית, מינו פטהד הוא מודל דגים הזחל נפוץ ב- ecotoxicology. למרבה הצער, פאטהד מינו הזחלים קיבלו הרבה פחות תשומת לב במחקרים התנהגותיים. כאן, אנו מפתחים להדגים פרוטוקול הפרופיל ההתנהגותי באמצעות קפאין כמו neurostimulant המודל. למרות התגובות photomotor של דגי פטהד הושפעו לעיתים קפאין, דג זברה היו במידה ניכרת יותר רגישים photomotor, הקצה גינקולוגיות, אשר הגיבו ברמות רלוונטי לסביבה. מחקרים עתידיים יש צורך להבין רגישות התנהגותית השוואתי ההבדלים בין דגים עם הגיל, שעת היום, וכדי לקבוע אם תופעות התנהגותיות דומות מתרחשות בטבע אינדיקטיבית תוצאות שליליות של האדם או האוכלוסייה רמות הארגון הביולוגי.

Introduction

על פי מודלים דגים משמשים יותר ויותר מחקרים ביו, דגים יש כבר באופן שגרתי מועסקים ללימודי אקולוגיה, פיזיולוגיה, לבחון זיהום של פני המים, וכדי להבין את סף רעילות של כימיקלים. מאמצים כאלה הם חשובים כי זיהום כימי יכול לפגום המערכת האקולוגית הימית ולסכן את האיכות של מקור אספקת המים^1,2. רוב הכימיקלים בתחום המסחר, עם זאת, חוסר אפילו מידע בסיסי³.

מבחני במודל חיה משמשת גם בדיקות רעילות רגולטוריות משאבים רבים, אין אפשרות לספק את התפוקה גבוהה, בתחילת ההקרנה הרמה הדרושה רעילות בדיקות המאה ה-21⁴. לאחר מכן, יש תנופה גוברת לאמץ ולנצל מודלים במבחנה שיכולים יותר במהירות וביעילות המסך תרכובות פעילות ביולוגית^3,5. למרות תא מבוסס מודלים להציג הזדמנויות רבות, הם לעתים קרובות חוסר המורכבות הביולוגית, ובכך להסביר תהליכים מהאורגניזם חשובים רבים, כולל מטבוליזם⁶.

דג זברה היא דגם נפוץ בעלי חיים ביו זה הוא צובר פופולריות כמו מודל אלטרנטיבי הרעלים הימית,^7,ecotoxicology⁸. בהתחשב שלהם גודל קטן, פיתוח מהיר, פוריות גבוהה, מודלים דגים ניתן למסך במהירות וביעילות כימיקלים אתריים רעילות על סולם מהאורגניזם⁹. בעזרת תוכנת מעקב אוטומטי, דג זברה זחל התנהגויות מספקים של תוכנית השירות לאבחון משופרת בהקרנת מזהמים רעילות^10,11. מחקרים במדעי הרוקחות הראו כי נקודות קצה גינקולוגיות אינפורמטיבי של מנגנוני פעולה כימית, יכול לשמש כדי פנוטיפ התנהגויות, ואז ייתכן באופן לא סופי לזיהוי מטרות subcellular מולקולות הרומן^{12, 13}. ואילו דג זברה הוא מודל פופולרי דגים זחל במדעים הביו-רפואית, מינו פטהד הוא מודל משותף, חשוב מבחינה אקולוגית דגים המשמש ללימודי ecotoxicology, ובמהלך פוטנציאליים (למשל, חדש כימי הערכות) ו רטרוספקטיבה (למשל, טמפרטורת מים עיליים או ניטור שפכים פריקה קולחים) תסקירים. למרבה הצער, תגובות התנהגותיות של דגי פטהד זחל קיבלו במידה ניכרת פחות. תשומת לב מאשר דג זברה. מחקר שוטף שלנו עם שני דגמים דגים הזחל נפוץ, מינו דג זברה, פטהד, מרמז כי הזחל דג שוחה דפוסי להופיע ייחודי למצבי הצפויה או מנגנון פעולה עבור כימיקלים שונים. לפיכך, התנהגותיות נקודות הקצה לספק את הפוטנציאל לבחון במהירות וברגישות כימיקלים רעילות וכדי לזהות מטרות subcellular עבור תעשיה מזהמים כימיים ואחרים, במיוחד במהלך המוקדמות הערכות מהשכבה.

כאן, אנחנו מדווחים על פרוטוקול לבחינת תגובה התנהגותית פרופילים בדגים זחל. נדגים את שיטות אלה באמצעות קפאין, על neurostimulant דגם מזהם הימית נפוצות שהוצגה למערכות מים באמצעות הפרשות של טיפול בשפכים בעקבות צריכת האדם של מזונות, משקאות, ו תרופות ניסח עם קפאין¹⁴. אנו בוחנים תגובות התנהגותיות הקפאין אצל שני זחל דג זברה, פאטהד מינו, ובכלל זה שינוי פתאומי במצב תאורה, אשר מתייחסים לרוב כתגובה photomotor (PMR) במהלך לימודי רוקחות עם עובריים, זחל דג זברה^13,15. אנו עוד יותר לזהות השפעות הקפאין ברחבי בכמה נקודות קצה גינקולוגיות לפתח תגובה כימית פרופילים עבור כל דגם דגים. רמות הטיפול הקפאין השתמשו במחקר זה מייצגים את centiles העליון של התפלגויות החשיפה בהתבסס על ערכי איכות הסביבה מדודה של קפאין¹⁶. אנו גם כוללים טיפולים benchmarked דגים זחל LC₅₀ ערכים, הערך טיפולי הסיכון (THV), ריכוז התרופות במים זה צפוי לגרום פלזמה רמות בדגים בקנה אחד עם מנה לפלסמה אנושית טיפולית.

Protocol

לימודי פרוטוקול זה בדרך כלל בצע מתוקננת עיצוב ניסיוני, מומלץ ניתוח סטטיסטי קווים מנחים את אותנו הסוכנות להגנת הסביבה (המשרד לאיכות הסביבה מס 2000.0) עבור דגי פטהד, הארגון לשיתוף פעולה כלכלי, פיתוח (ה-OECD מס 236) עבור דג זברה. אלה עיצובים מוטוריים (למשל, הגדלת שכפול) יכול להיות שונה בתוך פרוטוקול הנוכחי עבור מחקרים עתידיים. תרבות דגים תנאים פעל בעבר לאור ספרות¹⁷. כל ניסיוני הליכים ודגים תרבות פרוטוקולים בעקבות אכפת לי חיה המוסדית והוועדה שימוש בפרוטוקולים אישרה באוניברסיטת ביילור.

1. חשיפת דגים כדי טיפול כימי

1. להכין קפאין פתרונות חשיפה על ידי המסת קפאין במים קשה משוקם. לבצע דילולים טורי המתאים על ידי דילול גבוה יותר קפאין טיפולים עם מים קשים כדי לייצר רמות נמוכות יותר של טיפול קפאין.
   הערה: טבלה 1 מסכמת כל הרמות הטיפול נעשה שימוש בניסוי זה.

	דג זברה			מינו פאטהד
טיפול	ריכוז קפאין נומינלית (mg/L)	קפאין נמדד ריכוז (mg/L)	טיפול	ריכוז קפאין נומינלית (mg/L)	קפאין נמדד ריכוז (mg/L)
שליטה	0	< לוד	שליטה	0	< לוד
75: Centile *	0.001	0.001	75: Centile *	0.001	0.001
Centile ה־95 *	0.039	0.013	Centile ה־95 *	0.039	0.009
Centile-99% *	0.412	0.361	Centile-99% *	0.412	0.310
THV	4.07	3.81	THV	4.07	4.12
10% LC50	48.46	46.66	10% LC50	14.1	14.7
40% LC50	193.82	186.67	40% LC50	56.38	53.91

טבלה 1: קפאין ניסיוני טיפולים ניסויים מינו דג זברה, פאטהד. תינתן ערכים נומינלית, נמדד של קפאין עבור כל טיפול. * הטיפולים קפאין השתמשו במחקר זה מייצגים את centiles העליון של התפלגויות החשיפה בהתבסס על ערכי איכות הסביבה מדודה של קפאין¹⁶. THV: ערך טיפולי הסיכון. לוד: גבול של זיהוי

2. יוצקים את הפתרון מוכן ב חשיפה בודדים מעודד מאוד. שימוש 100 מ ל זכוכית בקבוקונים מלא 20 מ של חשיפה פתרון עבור חדרי חשיפה דג זברה 500 מ"ל בקבוקונים עם 200 מ של חשיפה לפתרון פטהד מינו חשיפה צ'יימברס.
3. באמצעות פיפטה העברה, מקום 10 דג זברה עוברי בגילאי 4-6 h פוסט הפריה (hpf) בכל אחת ארבעה חדרי חשיפה שכפל לכל טיפול.
4. מקום 10 פטהד מינו הזחלים בגילאי בתוך 24 שעות של הבקיעה בכל אחד ושלושה. חדרי קבורה שכפל חשיפה לכל טיפול. כדי להתאים את גודל גדול של הזחלים מינו פטהד, חתוך קצה פיפטה העברה לפני ההעברה.
5. לשמור על דג זברה ניסויים photoperiod בהירה: כהה 16:8 h, טמפרטורה של 28 ± 1 ° C. השתמש המשטר photoperiod אותו ללימודי מינו פטהד, אבל בטמפרטורה של 25 ± 1 ° C.
6. לאחר h 96 של החשיפה כימיים, טען דגים בודדים בבארות נפרדים של 48 (עבור דג זברה) ו-24 (עבור פטהד מינו) טוב צלחות.
   1. כדי להבטיח כי כל טוב מכיל אמצעי שווה של פתרון, להעביר דג זברה הזחלים 48 צלחות היטב באמצעות autopipette µL 5000 עבור אמצעי אחסון 1,000 µL לכל טוב. להשתמש את autopipette לפרוש ולהעביר דג זברה הזחלים והן חשיפה פתרון בו זמנית.
   2. עקב גודלם גדול, להעביר פטהד מינו הזחלים באמצעות פיפטה העברה עם קצה מנותקים. לפני העברת פטהד מינו הזחלים בארות בודדים, למלא כל אחד היטב כדי µL 2,000 באמצעות של autopipette. בעת העברת בודדים פטהד הזחלים להוסיף וולס, המקום קצה פיפטה העברה בפתרון טוב ולאפשר את הדגים לשחות מהקצה פיפטה לתוך הבאר.

2. כיול של פרמטרים מעקב וידאו

1. לפני באמצעים התנהגותיים, הגדרת פרמטרים תצפית וכיול בתוכנה סרטון הווידיאו (ראה טבלה של חומרים).
   1. מניחים צלחת טוב בבית הבליעה הקלטה עם דגים זחל לפחות 1 בבאר בודדים. להשתמש את צלחת ודגים המשויך ייצוגים כדי להגדיר את הפרמטרים כיול.
   2. התוכנה הווידאו, לחץ על "קובץ | ליצור פרוטוקול", אשר יפתח תיבת דו-שיח"אשף יצירת פרוטוקול". בשדה "מיקום חשוב", הזן את מספר יחידים בארות של צלחת טוב ולחץ על "אישור".
   3. בחלקו העליון של המסך, לחץ על "נוף | מסך מלא", אשר תנחה את המערכת כדי להציג מבט המצלמה תקורה של צלחת טוב.
   4. לחץ על הסמל "אזורים לצייר", המופיע כשלוש צורות צבעוניים. מימין של צלחת טוב שטח תצוגה, בחר בסמל מעגל בשדה הנקרא "אזורים".
   5. השתמש הסמן על הוידאו מעגלית למעקב אחר באזור השמאלי טוב של הצלחת היטב העליון. בחר "הימנית העליונה סימן" ולאחר מכן המתאר אזור התצוגה העליון ממש טוב. לאחר מכן, בחר "סימן תחתון" חלוקה לרמות התחתון היטב.
      הערה: לאחר ציור המתאר עגול, מעמדה ככל הנראה תצטרך להיות מותאם.  כדי לכוונן את המיקום של החלוקה לרמות, לחץ על 'בחר' ולאחר מכן השתמש הסמן כדי להזיז את האזור עם מיתאר. כמו כן, ניתן לשכפל מתאר על-ידי לחיצה על "העתק" ולאחר מכן "הדבק".
   6. לאחר למעלה שמאל, ימין, למעלה הוגדרו התחתון היטב מעקב אחר אזורים, לחץ על "לבנות" תציג את התוכנה באופן אוטומטי ניסחו את תחומי צפייה הבארות הנותרים.
   7. באזור הנקרא "כיול", לחץ על "סולם לצייר". השתמש הסמן כדי לצייר קו אופקי על פני הלוח. ברגע נמשך הקו, תופיע תיבת דיאלוג בה שכותרתו "כיול מדידה". הזן את אורך צלחת טוב ולחץ "אישור".
   8. יציאה המנהל הציור על-ידי לחיצה על סמל "אזורים לצייר".
   9. לחץ על הסמל 'אריחים'.  באמצעות הסמן, לסמן את כל תיבות המופיעות על המסך הצפייה כך כל תיבה הוא ירוק.
      הערה: הסמל אריחים מופיע בתור קבוצה של שישה ריבועים קטנים בודדים
   10. "לחץ על תצוגה | מסך מלא".  מימין של צלחת אזור התצוגה, לחץ על "Bkg" הקופסה "זיהוי סף". השתמש בשורת התאמת הסף להציב את הסף זיהוי הפיקסל. פעם אחת, הסף זיהוי הפיקסל המתאים נבחר, לחץ על "החל לקבוצה".
       הערה: פרוטוקול זה קביעת הסף זיהוי בגיל 13 במצב שחור עבור דג זברה תצפיות ו- 110 במצב שקוף עבור פטהד מינו תצפיות.
   11. הקופסה "סף תנועה", הזן את מהירות התנועה הרצוי מעקב פרמטרים. לאחר הגדרת מהירות פרמטרים, לחץ על "להחיל את קבוצת".
       הערה: פרוטוקול זה מגדיר את תנועות קטנות/גדולות ב- 20 מ מ/s ותנועות לא פעיל/קטן-5 מ מ/s. בחירות אלה לתכנת את התוכנה כדי לעקוב אחר תנועת הדגים זחל בשלוש רמות מהירות שונה: לא פעיל (הקפאה) = < 5 מ"מ/s, קטן (שיוט) = 5 – 20 מ מ/s, וגדול (מתפרצת) = > 20 מ מ/s.
   12. לחץ על "פרמטרים | פרוטוקול פרמטרים"מתוך התפריט הנפתח. בתיבת דו-שיח, בחר את הכרטיסיה "זמן" הזן את התצפית וזמן אינטגרציה. לאחר הזנת פרמטרים לחץ "על אישור".
   13. כדי להגדיר photoperiod/כהה פעמים ואת עוצמת האור כל photoperiod פתח שהגדרות מנהל ההתקן אור תיבת דיאלוג על-ידי בחירת 'נהיגה אור"מן"הפרמטרים"הנפתחת תפריט.
       הערה: ראה פרוטוקול וידאו עבור הגדרת photoperiods בהירה-כהה מרובים.
   14. לאחר הפרמטרים מעקב וידאו הוגדרו, לשמור את פרוטוקול התצפית.
       הערה: פרוטוקול זה מתבונן בהתנהגות הדגים במשך 50 דקות הכולל שלב להתאקלמות 10 דקות ולאחריו 4 שינוי/כהה שלבים המורכב משתי תקופות אור 10 דקות ו 10 דקות שתי תקופות כהה. הפעם שילוב מוגדר למדוד התנהגות כל דקה של המשפט התנהגותית 50 דקות.

3. התבוננות גינקולוגיות זחל דגים והתנהגות Photomotor

1. מקם את הצלחת טוב המכיל דגים ניסיוני בתא ההקלטה התנהגותית.
2. תוכנת מעקב וידאו, פתח את פרוטוקול מעקב פותח בשלב 3.
3. במציג מעקב וידאו, בדוק כדי לוודא כי כל הזחלים גלויים על מסך המחשב, זה זחל בודד אחד בלבד הוא נוכח בכל טוב, בארות בודדים מיושרים בתוך האזורים תצפית הוגדרו בשלבים 2.1.5 ו 2.1.6.
4. לחץ על "ניסוי | בצע".
   הערה: המערכת יבקש מהמשתמש לספק שם ומיקום כדי לשמור את נתוני התצפית.
5. פעם אחת את השם שמור מיקום של התצפית צוינו נתונים, לחץ על סמל "תמונות חיים מספר" כדי לסמן כל אזורים מוגדרים מראש צפייה
   הערה: סמל זה הינו ממוקם בחלק העליון של מסך המחשב, מופיע כמלבן מחולק ארבעה ריבועים קטנים יותר. לחיצה על סמל זה ידגיש את כל האזורים תצוגה מוגדרים מראש.
6. סגור את הפאנל של תא הקלטה ולחץ על "רקע | התחלה"על צג המחשב.

4. ניתוח נתונים התנהגותיים

1. כדי לאחזר נתוני פעילות דגים זחל, לפתוח את הגיליון האלקטרוני, אשר נצבר באופן אוטומטי על-ידי תוכנת מעקב היא בתיקייה שצוינה על-ידי המשתמש לפני ביצוע ניסויים התנהגותיים (שלב 3.4).
2. עיין דמויות 1A ו- 1B למדידות מייצג הפעילות גינקולוגיות תמימה של דג זברה סמויה וזחלים מינו פטהד, בהתאמה. עיין דמויות 1C ו- 1 D לחישובי PMR, אשר ביעילות לבחון את סדר הגודל של התנועה לבין מעברי אור כהה או חשוך לאור.

איור 1: דוגמה של פעילות בסיסית של דג זברה סמויה (A ו- B), פאטהד מינו (C ו- D). מרחק ממוצע (± SEM) שחיתי עבור דג זברה (A), פאטהד מינו (C) ניתנת על ידי נקודות במרווחי זמן ייצוג כל דקה של פעילות. שתי חשוך ונקודות אור שתי תגובות photomotor נמדדים. האחרון (a, c, e, ו- g) לראשון (b, d, f ו- h) דקה של כל photoperiod משמשים לחישוב PMRs. Photomotor תגובות של דג זברה (B), פאטהד מינו (D) נמדדים כמו בשינוי המרחק אומר (±SEM) בין הדקה האחרונה photoperiod הראשונית של ו הדקה הראשונה של התקופה הבאה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

תוצאות

רמות הטיפול הקפאין לא משתנה ניכרת במהלך הניסויים 96 h עם דגי דג זברה, פאטהד. לדוגמה, טבלה 1 מציגה בצורה אנליטית מאומת ריכוזים של כל רמה טיפול. פרוטוקול זה אומתו דגימות מים עבור רמות הטיפול קפאין איזוטופ-דילול כרומטוגרפיה נוזלית טנדם ספקטרומטר מסה (LC-MS/MS) בדרך כלל בעקבות שיטות שדווחה בעבר²⁸. היווצרות paraxanthine, מטבוליט ראשי של קפאין, היה גם לכמת. תיאור של נהלים אנליטיים אלה מסופק מידע אנליטי משלימה. בגלל הדמיון בין אימות תקינות אנליטיים של טיפולים, טיפול הנומינלי רמות מוצגים תוצרי הלמידה כתב היד הזה. קפאין שינו באופן משמעותי בהתנהגויות מינו דג זברה, פאטהד. עם זאת, תגובות גינקולוגיות דג זברה היו באופן עקבי יותר רגישים לקפאין יותר פטהד רקק. סתם. הקצה התנהגותית הרגישים ביותר עבור הזחלים מינו דג זברה, פאטהד הושפעו קפאין-ריכוז של 0.039 מ ג/ל' 2 טבלה מסכמת הריכוזים הנמוך ביותר נצפתה השפעה (LOECs), אין ריכוזים האפקט הנצפה (NOECs) עבור כל נקודת קצה התנהגותית בשני המודלים דגים.

דג זברה			מינו פאטהד
נקודת קצה	LOEC (mg/L)	NOEC (mg/L)	נקודת קצה	LOEC (mg/L)	NOEC (mg/L)
המרחק הכולל כהה	0.412	0.039	המרחק הכולל כהה	−	56.38
המרחק הכולל אור	48.46	4.07	המרחק הכולל אור	−	56.38
סה כ מניית אפל	0.412	0.039	סה כ מניית אפל	−	56.38
סה כ נחשב אור	48.46	4.07	סה כ נחשב אור	−	56.38
מתפוצץ מרחק כהה	−	193.82	מתפוצץ מרחק כהה	−	56.38
מתפוצץ מרחק אור	193.82	48.46	מתפוצץ מרחק אור	−	56.38
מתפוצץ מניית אפל	193.82	48.46	מתפוצץ מניית אפל	−	56.38
אור ספירת להתפקע	193.82	48.46	אור ספירת להתפקע	−	56.38
מתפוצץ משך כהה	193.82	48.46	מתפוצץ משך כהה	−	56.38
מתפוצץ משך אור	−	193.82	מתפוצץ משך אור	−	56.38
שיוט מרחק כהה	0.412	0.039	שיוט מרחק כהה	−	56.38
שיוט מרחק אור	48.46	4.07	שיוט מרחק אור	−	56.38
שיוט מניית אפל	0.412	0.039	שיוט מניית אפל	−	56.38
אור ספירת שיוט	48.46	4.07	אור ספירת שיוט	−	56.38
שיוט משך כהה	0.412	0.039	שיוט משך כהה	−	56.38
שיוט משך אור	48.46	4.07	שיוט משך אור	−	56.38
הקפאת מרחק כהה	0.412	0.039	הקפאת מרחק כהה	0.039	0.001
הקפאת מרחק אור	0.039	0.001	הקפאת מרחק אור	−	56.38
הקפאה מניית אפל	0.412	0.039	הקפאה מניית אפל	−	56.38
אור ספירת קופא	48.46	4.07	אור ספירת קופא	−	56.38
קפוא משך כהה	−	193.82	קפוא משך כהה	56.38	14.10
קפוא משך אור	48.46	4.07	קפוא משך אור	−	56.38
PMR 1 כהה	48.46	4.07	PMR 1 כהה	0.039	0.001
אור 1 PMR	48.46	4.07	אור 1 PMR	−	56.38
PMR 2 כהה	48.46	4.07	PMR 2 כהה	−	56.38
אור 2 PMR	48.46	4.07	אור 2 PMR	−	56.38
מתפוצץ PMR 1 כהה	−	193.82	מתפוצץ PMR 1 כהה	−	56.38
מתפוצץ אור 1 PMR	−	193.82	מתפוצץ אור 1 PMR	−	56.38
מתפוצץ כהה PMR 2	193.82	48.46	מתפוצץ כהה PMR 2	−	56.38
מתפוצץ אור 2 PMR	−	193.82	מתפוצץ אור 2 PMR	−	56.38
שיוט PMR 1 כהה	48.46	4.07	שיוט PMR 1 כהה	−	56.38
שיוט אור 1 PMR	48.46	4.07	שיוט אור 1 PMR	−	56.38
שיוט כהה PMR 2	48.46	4.07	שיוט כהה PMR 2	−	56.38
שיוט אור 2 PMR	193.82	48.46	שיוט אור 2 PMR	56.38	14.10
הקפאת PMR 1 כהה	48.46	4.07	הקפאת PMR 1 כהה	−	56.38
הקפאת אור 1 PMR	193.82	48.46	הקפאת אור 1 PMR	−	56.38
הקפאת כהה PMR 2	48.46	4.07	הקפאת כהה PMR 2	−	56.38
הקפאת אור 2 PMR	193.82	48.46	הקפאת אור 2 PMR	−	56.38

בטבלה 2: מינו דג זברה, פאטהד התנהגותית NOECs ו- LOECs עבור קפאין. אין ריכוז אפקט שנצפו (NOEC) ושחייה ערכים הנמוך ביותר נצפתה השפעה ריכוז (LOEC) (mg/L) עבור כל אחד / כהה נקודות קצה פעילות ותגובות photomotor עבור דגי דג זברה, פאטהד נחשפים קפאין. קווים מפרידים מציינים כי אין תופעות נצפו בנקודת קצה מסוים על פני כל רמות הטיפול.

איור 2 מציג PMRs של דג זברה, פאטהד מינו בעקבות חשיפה 96 h קפאין ופעילות גינקולוגיות הכולל. הזחלים מינו פטהד ש-pmrs שונו על ידי קפאין ברמות הטיפול נמוכות (0.038 mg/L) מאשר דג זברה, אבל מספר גדול יותר במידה ניכרת של נקודות הקצה photomotor הושפעו בדג זברה. רמת הטיפול הגבוהה ביותר קפאין (193.82 mg/L) שינוי PMR בתהליך דג זברה, שבו התגובות הללו היו הפוכים לגמרי מפני פקדי. ברמה זו טיפול מוגבר, אולם, PMRs ירד בחושך, גדל בתנאי אור.

איור 2: שחייה הפעילות והתגובות photomotor של דג זברה (A ו- B), מינו פטהד (C ו- D) לאחר חשיפה 96 h קפאין. מרחק ממוצע (± SEM) שחיתי עבור דג זברה (A), פאטהד מינו (C) ניתנת על ידי נקודות במרווחים 1-מין ייצוג לכל פעילות. תגובות Photomotor של דג זברה (B), פאטהד מינו (D) נמדדים כמו בשינוי המרחק הכולל ממוצע (± SE) בין את last minutes של photoperiod הראשונית הדקה הראשונה של התקופה הבאה. שתי חשוך ותגובות אור photomotor תקופה שני נמדדו. בסך הכל 24 דג זברה (4 משכפל כל של הזחלים 6) ו- 12 (3 משכפל כל של הזחלים 4) פטהד רקק. סתם שימשו תצפית התנהגותית. p < 0.10; p < 0.05; p < 0.01. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

בנוסף מדידה PMRs הזחל, פעילות גינקולוגיות כהה נותחה על-פני שלוש מהירות סף עבור מרחק זז, מספר תנועות, והמשך של תנועות. נתונים אלה משמשים כדי לפתח תגובה התנהגותית פרופילים עבור קפאין (איור 3, המשלימים איור 1). בשני המודלים דגים, קפאין עכבות פעילות מושפע באופן משמעותי בכלל נקודות קצה גינקולוגיות. שני דגים מודלים הפגינו פעילות מוגברת על הסף מהירות המתפרצת בעקבות חשיפה קפאין, אם כי לא באופן משמעותי. בדומה תוצאות התצפיות PMR, קפאין התבצע מספר רב יותר של נקודות קצה גינקולוגיות דג זברה. למעשה, קפאין שינו באופן משמעותי את מספר התגובות גינקולוגיות בתנאים כהה ברמות לסביבה מציאותי מתחת THV. עם זאת, פאטהד מינו גינקולוגיות פעילות לא משמעותית הושפע בתנאים קלים לפי רמת טיפול כלשהו.

איור 3: התגובה פרופילים של דגי דג זברה, פאטהד זחל לאחר חשיפה 96 h קפאין. זאת אומרת דג זברה כהה (A), אור (B) שחייה הפעילות בהשוואה מתכוון פטהד מינו כהה (C) ופעילות אור (D) לאחר חשיפה 96 h קפאין. להתוות נתונים מייצג פעילות photoperiods כהה על פני שני 10 דקות, 10 דקות שני אור photoperiods עבור כל דגם דגים. נתונים מנורמל לפקד, המיוצגת ב ציר ה 0-לכל דמות. התנהגות שפרמטרים מרחק שחו, מספר תנועות (ספירות), ואת משך כל תנועה על פני 3 רמות מהירות, מתפוצץ (> 20 מ מ/s), שיוט (5 – 20 מ מ/s), וכלה בהקפאת (< 5 מ"מ/s). בנוסף דפוסי תנועה בכל אחד הסף מהירות, המרחק הכולל שחו, המספר הכולל של תנועות מיוצג. ↑ מייצג עלייה משמעותית בפעילות לעומת שליטה, ↓ מצביעה על ירידה משמעותית בפעילות לעומת שליטה. בסך הכל 24 דג זברה (4 משכפל כל של הזחלים 6) ו- 12 (3 משכפל כל של הזחלים 4) פטהד מינו שם בשימוש תצפיות התנהגותיות עבור כל קבוצה. p < 0.10; p < 0.05; p < 0.01. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

משלימה איור 1: תגובות Photomotor של דג זברה (A ו- B), מינו פטהד (C ו- D) על פני שלושה גדלי סף של מהירות. דג זברה (A, B ו- C) ותגובות פטהד מינו הזחלים (D, E ו- F) photomotor על פני שלושה גדלי סף של מהירות (קפוא: 20 מ מ/s) לאחר חשיפה 96hr קפאין. תגובות Photomotor של דג זברה, פאטהד מינו נמדדים כמו בשינוי המרחק הכולל ממוצע (±SE) בין את last minutes של photoperiod הראשונית הדקה הראשונה של התקופה הבאה. שתי חשוך ותגובות אור photomotor תקופה שני נמדדו. בסך הכל 24 דג זברה (4 משכפל כל של הזחלים 6) ו- 12 (משכפל 3 של הזחלים 4) פטהד רקק. סתם שימשו תצפית התנהגותית. * p < 0.01 אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

Discussion

בעת בחירת טיפול כימי רמות ללימודי טוקסיקולוגיה סביבתית, יש לקחת בחשבון מספר גורמים. קפאין רמות הטיפול במחקר הנוכחי נבחרו על בסיס ערכי centile העליון עבור תרחישים החשיפה הסביבתית החזוי של קולחים שפכים¹⁶. במידת האפשר, אנו בוחרים באופן שגרתי לטיפול רמות עבור מחקרים ימיים רעלים באמצעות הערכות חשיפה הסתברותית של תצפיות הסביבה^19,20,21. THV, אשר הניתנים לחישוב עבור תרופות, נכללה גם לשלב הטיפול במחקר הנוכחי. THV ערכים (הציוד 1)^22,23 מוגדרים ריכוזים מים החזוי שמוביל מינונים טיפולית אנושי (Cmax) של תרופות דגים²³, השראה מן הפלסמה הראשונית מידול המאמצים²⁴, הם מחושב בהתבסס על הדם: מים כימי למחיצות המקדמים (הציוד 2)²⁵.

THV = C_מקס / התחבר P_BW (הציוד 1)

יומן P_BW = יומן [(10^{0.73. יומן קאו} · 0.16) + 0.84] (הציוד 2)

כאן, אנחנו גם לבחור רמות הטיפול לא קטלני ביחס מינו דג זברה, פאטהד LC50 ערכים. אנו רואים בגישה זו שגרה בהשוואות שימושי עבור תגובות התנהגותיות, במיוחד בעת השוואת סף של התנהגויות ספציפיות עם דגם דגים על פני כימיקלים מרובים. זה עוד יותר מקלה על חישובים של חריפה על יחסי כרונית, אשר יכול להיות שימושי אבחונית הרעלים ימיים עבור מכניסטית מחקרים והערכות. ערכים LC50, התקבלו bioassays רעילות ראשוני לבצע את ההנחיות מתוקננת בהתחשב בשלב 2.1.

פרוטוקול זה, אנו מעסיקים נפוצות עיצובים מוטוריים, טכניקות סטטיסטיות המומלצת על-ידי אותנו EPA ו- OECD שיטות מתוקננת הרעלים מחקרים במודלים דגים. אבל אנחנו לדווח על פי ערכים (למשל., < 0.01, < 0.05, < 0.10), הבדלים משמעותיים (α = 0.10) בפעילות רמות מזוהים בין טיפולים באמצעות ניתוח השונות (ANOVA) אם נורמליות, שקילות של ההנחות השונות הם נפגשו. של Dunnett או של Tukey HSD הוק לאחר הבדיקות מבוצעות כדי לזהות הבדלים ברמת הטיפול. אנו בוחרים את האלפא (α = 0.10) ערך כדי להפחית סוג II שגיאות, במיוחד עבור מבחני מהשכבה מוקדם, כאשר הבנה של גודל אפקט חשוב מבחינה ביולוגית היא מוגבלת עבור נקודות קצה התנהגותית understudied ודגם אורגניזמים²⁶, במקום העסקת שכיחה יותר בקרב למדעים ביו להשוואות מרובות הליכים (למשל., Bonferroni תיקון עבור נתוני ה-RNA-Seq)²⁷.  מחקרים עתידיים יש צורך להבין השתנות של אלה תגובות התנהגותיות, פוטנציאל לשנות עיצובים מוטוריים (למשל, עלייה שכפול) בהתאם.

מספר גורמים יכולים להשפיע על התנהגות של דגים זחל בנוסף לכימיקלים. לדוגמה, זמן של יום, גיל, גודל טוב, טמפרטורה, תנאי תאורה נפח של חשיפה פתרון כל שיקולים חשובים לייצג טוב^11,30. מסיבות אלו, אמצעי זהירות יש לנקוט כדי למזער את ההשפעות של גורמים חיצוניים יכול להשפיע על התנהגותו גינקולוגיות של הדג זחל במהלך ניסויים. תצפיות התנהגותיות צריכה להתבצע בחלונות זמן קצר (3-4 שעות), על פני תקופות זמן מתי הזמן של תופעות היום צפויים השפעה מינימלית על התנהגות גינקולוגיות זחל¹¹. בנוסף, דגים זחל צריך להישמר בטמפרטורה אחידה (28 ± 1 ° C עבור דג זברה) ו- 24 ± 1 ° C עבור FHM, מחזור/כהה מוגדר מבוקרי טמפרטורה חממות לאורך כל תקופת החשיפה. בנוסף, הטמפרטורה של המעבדה שבו יירשמו התנהגויות כדאי להישמר בתנאים קירוב ניסיוני תנאים כדי למנוע השפעות הטמפרטורה על התנהגויות. עוד, בארות בשימוש במהלך תצפיות התנהגותיות צריך להישמר בווליום עקבית עבור כל דג בודדים.

הזחל, עובריים דג זברה ש-pmrs בעבר השתמשו במדעים ביו כדי לזהות מטרות טיפוליות אפשריות עבור הרומן תרכובות^12,13. פרוטוקול זה מרחיב על מחקר התנהגותי קודם עם דג זברה על ידי ניצול 38 נקודות קצה לחקור אתריים כימי של מזהמים סביבתיים. למרות הקפאין הוא מזהם הימית משותף עם מנגנון מובן של פעולה (מואה), תרכובות רבות במסחר חסרים נתונים מכניסטית חשובים. לכן, פרוטוקול זה יכול להיות מועסק כדי לקבל תובנה של MoAs עבור תרכובות חסר רעילות נתונים, לרבות כימיקלים מסחרי³⁹. יתר על כן, הפרוטוקול מספק שיטות עבור שני המודלים דג הנפוץ ביותר. כמו שצוין לעיל, ואילו דג זברה הוא דגם דגים ביו נפוץ זה נהיה יותר ויותר פופולרי ב ecotoxicology, פאטהד את מינו משמשת כמודל האקולוגית ליישומים הערכת הסביבה אך קיבל יחסית פחות. תשומת לב במחקרים התנהגותיים עם מערכות אוטומטיות לעומת את דג זברה. למרות נותר אין שיטות הרגולציה מתוקננת ללימודי טוקסיקולוגיה סביבתית דגים, פרוטוקול זה מספק גישה לתמיכה המאמצים העתידיים.

קפאין elicited תגובות התנהגותיות בכל אחד מן הדגמים דגים ברמות זה זוהו אצל ה¹⁶של הסביבה הימית. רודריגז-גיל ואח . 2018 פיתחו חשיפה סביבתית גלובלית הפצות במערכות הימית, בהתבסס על ערכים נמדד קפאין¹⁶. באופן ספציפי, 95% של ריכוזים קולחים בשפכים החזוי יפול מתחת LOECs הקצה התנהגותית הרגישים ביותר של מינו דג זברה, פאטהד במחקר הנוכחי (טבלה 2). למרות כמה תופעות התנהגותיות של קפאין נצפתה דג זברה (במיוחד בתנאים כהה) ברמות הרלוונטיות. לסביבה, לא ברור אם לבצע שינויים התנהגותיים אלה עלול להתרחש אוכלוסיות הדגים טבעיים או התוצאה תוצאות שליליות חשוב מבחינה אקולוגית. למרות שימושי למטרות ההקרנה רגיש, אבחון, ספי התנהגותית זחל דגים לא יכול להיות נציג של שלבים אחרים על החיים או דגים באוכלוסיות טבעיות. נדרש מחקר נוסף כדי לקבוע אם דומה סף התגובה ההתנהגותית להתרחש בטבע, להיות מעידה על תוצאות שליליות ברמות הפרט או אוכלוסייה של הארגון הביולוגי.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
ViewPoint Zebrabox	ViewPoint		ZebraLab and ZebraLab platform for automated behavioral observations
Caffeine	Sigma-Aldrich	C0750-100G	Study chemical
Incubator	VWR	9110589	Maintains light/dark cycle and temperature for fathead minnow experiments
Incubator	Thermo Fisher Scientific	35824-636	Maintains light/dark cycle and temperature for zebrafish experiments
100 mL glass beakers	VWR	89000-200	Zebrafish exposure chambers
500 mL glass beakers	Pyrex	EW-34502-03	Fathead minnow exposure chambers
5,000 µL auto-pipette	Eppendorf	Research 5000	Used to fill individual wells in well plates
Transfer Pippettes	VWR	414-004-004	Used to transfer study organisms
48-well plates	Fisher Scientific	08-772-52	Larval zebrafish behavioral recording chambers
24-well plates	VWR	10062-896	Larval fathead minnow behavioral recording chambers
Calcium sulfate dihydrate	Sigma-Aldrich	C3771	For reconstituted hard water
Magnesium Sulfate	Sigma-Aldrich	M7506	For reconstituted hard water
Sodium Bicarbonate	Sigma-Aldrich	S5761	For reconstituted hard water
Potassium Chloride	Sigma-Aldrich	P9333	For reconstituted hard water
z-mod recirculating system	Marine Biotech Systems		Recirculating system to maintian zebrafish cultures
Statistical analysis software	Sigma Plot	Version 13.0	Used to analyze beahvioral data and produce figures
Statistical analysis software	Graphpad Prism	Prism 5	Used to produce figures
Autosampler/quaternary pumping system	Agilent Technologies	Infinity 1260 model	Analytical verification of caffeine treatment levels
Jet stream thermal gradient electrospray ionization source	Agilent Technologies		Analytical verification of caffeine treatment levels
Triple quadrupole mass analyzer	Agilent Technologies	Model 6420	Analytical verification of caffeine treatment levels
10 cm × 2.1 mm Poroshell 120 SB-AQ column (120Å, 2.7)	Agilent Technologies	685775-914T	Caffiene chromatography
MassHunter Optimizer Software	Agilent Technologies		Determine the ionization mode, monitored transitions, and instrumental parameters for caffeine/caffeine-d9 and paraxanthine/paraxanthine-d6