Experimentelles Protokoll für die Prüfung Verhaltensreaktion Profile in Larval Fish: Anwendung auf die Neuro-Stimulans Koffein

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um Larven Zebrafisch und Fathead Elritze motorischen Aktivitäten und Photomotor Antworten (PMR) mithilfe einer automatischen Tracking-Software prüfen. Wenn gemeinsam Toxikologie Bioassays enthalten, liefern Analysen dieser Verhaltensweisen ein Diagnose-Tool um chemische Bioaktivität zu untersuchen. Dieses Protokoll wird beschrieben mit Koffein, ein Modell Neurostimulant.

Zusammenfassung

Fisch-Modelle und Verhaltensweisen werden zunehmend in den biomedizinischen Wissenschaften verwendet; Allerdings sind Fische längst das Thema ökologische, physiologische und toxikologische Studien. Mit automatisierten digitalen Tracking Plattformen, die jüngsten Anstrengungen in Neuropharmacology nutzen larval Fish Bewegungsorgane Verhaltensweisen um mögliche therapeutische Ziele für neuartige kleine Moleküle zu identifizieren. Ähnlich wie bei diesen Bemühungen Forschung in den Umweltwissenschaften und vergleichende Pharmakologie und Toxikologie prüft verschiedene Verhaltensweisen der Fische-Modelle als diagnostische Hilfsmittel in mehrstufigen Bewertung von Schadstoffen und Echtzeit-Überwachung von Oberflächengewässern für Schadstoff-Bedrohungen. Während der Zebrabärbling ein beliebtes larval Fish-Modell in den biomedizinischen Wissenschaften ist, ist Fathead Elritze ein gemeinsames larval Fish-Modell in der Ökotoxikologie. Leider erhielten Fathead Elritze Larven in Verhaltensstudien deutlich weniger Aufmerksamkeit. Hier entwickeln wir und zeigen ein Verhaltens-Profil-Protokoll mit Koffein als ein Modell Neurostimulant. Obwohl Photomotor Antworten von Fathead Elritzen gelegentlich von Koffein betroffen waren, Zebrafisch waren für Photomotor und Bewegungsorgane Endpunkte, die umweltrelevanten Ebene reagiert deutlich empfindlicher. Zukünftige Studien werden benötigt, um vergleichende Verhaltens Empfindlichkeit Unterschiede unter den Fischen mit Alter und Tageszeit zu verstehen, und um festzustellen, ob ähnliche Auswirkungen auf das Verhalten in der Natur vorkommen und würde bezeichnend für negative Ergebnisse in den einzelnen oder Bevölkerung Ebenen der biologischen Organisation.

Einleitung

Obwohl Fisch-Modelle zunehmend für biomedizinischen Studien verwendet werden, sind Fische routinemäßig für Ökologie und Physiologie Studien, Verschmutzung der Oberflächengewässer zu prüfen und zu verstehen, toxikologischen Schwellenwerte von Chemikalien eingesetzt worden. Diese Bemühungen sind wichtig, weil chemischer Verunreinigung kann aquatische Ökosysteme beeinträchtigen und die Qualität der Quelle Wasserversorgung^{1,2 gefährden}. Die meisten der Chemikalien im Handel, jedoch fehlen sogar grundlegende toxikologische Informationen³.

Tiermodell Assays traditionell in regulatorischen Toxizitätstests verwendet ressourcenintensiv sind und nicht den hohen Durchsatz bieten Tier Früherkennung für Toxizitätstests in das 21. Jahrhundert-⁴benötigt. Anschließend gibt es ein wachsender Impuls zu verabschieden und in-vitro- Modelle, die schneller und effizienter Verbindungen für biologische Aktivitäten^3,5Bildschirm können zu nutzen. Obwohl zellbasierten Modelle viele Gelegenheiten bieten, sie oft nicht über biologische Komplexität und somit nicht entfallen viele wichtige Gesamtorganismus Prozesse, einschließlich Stoffwechsel⁶.

Der Zebrabärbling ist ein gemeinsames biomedizinische Tiermodell, das gewinnt Popularität als ein alternatives Modell in aquatische Toxikologie und Ökotoxikologie^7,8. Angesichts ihrer geringen Größe, schnelle Entwicklung und hohe Fruchtbarkeit, Fisch-Modelle lässt sich schnell und effizient Chemikalien für Bioaktivität und Toxizität auf dem gesamten Organismus Skala⁹Bildschirm. Mit Hilfe von automatisierten Tracking-Software bieten Larven Zebrafisch Verhaltensweisen erweiterten Diagnosedienstprogramm Screening-Kontaminanten für Toxizität^10,11. Studien in der pharmazeutischen Wissenschaften haben gezeigt, dass Bewegungsorgane Endpunkte informativ von chemischen Wirkmechanismen sind, Phänotyp Verhaltensweisen genutzt werden und dann versuchsweise subzelluläre Ziele für neuartige Moleküle^{12identifizieren können, 13}. Der Zebrabärbling ist ein beliebtes larval Fish-Modell in den biomedizinischen Wissenschaften, Fathead Elritze ist eine gemeinsame, ökologisch wertvollen Fisch-Modell, das für Ökotoxikologie Studien und prospektive verwendet wird (z. B. neue chemische Bewertungen) und Retrospektive (z. B. ambient Oberflächenwasser oder Abwasser Abwässer Überwachung) Umweltprüfungen. Verhaltensreaktionen von Larven Fathead Elritzen haben leider deutlich weniger Aufmerksamkeit als Zebrafisch erhalten. Unsere kontinuierliche Forschung mit zwei gemeinsamen larval Fish-Modellen, dem Zebrafisch und Fathead Elritze, legt nahe, dass Larven Fische schwimmen Muster zu erwartenden Modi oder Wirkmechanismen für diverse Chemikalien einzigartig erscheinen. Verhaltens Endpunkte geben damit das Potenzial, schnell und sensibel prüfen Chemikalien für Toxizität und subzelluläre Ziele für industrielle chemische und andere Verunreinigungen, besonders während der frühen Stufe Bewertungen zu identifizieren.

Hier berichten wir über ein Protokoll zur Untersuchung Verhaltensreaktion Profile in larval Fish. Wir zeigen diese Methoden mit Koffein, eine Modell-Neurostimulant und eine gemeinsame aquatische Verunreinigung, die in aquatischen Systemen durch Entlastung von Abwasseranlagen Behandlungen nach Verzehr von Lebensmitteln, eingeführt ist Getränke, und Arzneimittel mit Koffein¹⁴formuliert. Wir untersuchen Verhaltensreaktionen auf Koffein in beiden Larven Zebrafisch und Fathead Elritze, unter anderem zu einer plötzlichen Änderung der Lichtverhältnisse, die oft als Photomotor Reaktion (PMR) während pharmazeutische Studien mit embryonale und Larvale bezeichnet wird Zebrafisch^13,15. Wir identifizieren weitere Effekte des Koffeins über mehrere Bewegungsorgane Endpunkte, chemische Reaktion Profile für jedes Fisch-Modell zu entwickeln. Koffein Behandlung Ebenen in dieser Studie verwendeten repräsentieren die oberen Perzentile der Exposition Distributionen basierend auf ökologischen Messwerte von Koffein¹⁶. Wir gehören auch Behandlungen Benchmarking larval Fish LC₅₀ Werte und der therapeutischen Gefahr Wert (THV), eine pharmazeutische Konzentration im Wasser, das voraussichtlich Plasmaspiegel in Einklang mit einer therapeutischen Humanplasma Dosis Fisch führen.

Protokoll

Studien in diesem Protokoll in der Regel folgen standardisierte Versuchsplanung und statistische Analyse Leitlinien empfohlen, von der US Environmental Protection Agency (EPA Nr. 2000.0) für Fathead Elritzen und der Organisation für wirtschaftliche Zusammenarbeit und Entwicklung (OECD Nr. 236) für Zebrafisch. Diese experimentellen Designs (z.B.Erhöhung der Replikation) können im Rahmen des aktuellen Protokolls für zukünftige Studien geändert werden. Fisch-Kultur, die Bedingungen zuvor folgen veröffentlicht Literatur¹⁷. Alle experimentellen Verfahren und Fisch-Kultur-Protokolle gefolgt institutionelle Animal Care und Use Committee Protokolle an der Baylor Universität zugelassen.

(1) Fische, chemische Behandlung aussetzen

1. Bereiten Sie Koffein Belichtung Lösungen durch Koffein in rekonstituierte hartes Wasser auflösen. Führen Sie entsprechende serielle Verdünnungen durch Verdünnung höheren Koffein Behandlungen mit hartem Wasser, geringeren Koffein Behandlung zu produzieren.
   Hinweis: Tabelle 1 fasst die Behandlung Ebenen in diesem Experiment verwendet.

	Zebrafisch			Fathead Elritze
Behandlung	Nominale Koffein-Konzentration (mg/L)	Gemessenen Koffein-Konzentration (mg/L)	Behandlung	Nominale Koffein-Konzentration (mg/L)	Gemessenen Koffein-Konzentration (mg/L)
Kontrolle	0	< LOD	Kontrolle	0	< LOD
75. Herz *	0,001	0,001	75. Herz *	0,001	0,001
95. Herz *	0,039	0,013	95. Herz *	0,039	0,009
99. Herz *	0,412	0.361	99. Herz *	0,412	0,310
THV	4.07	3.81	THV	4.07	4.12
10 % LC50	48.46	46,66	10 % LC50	14.1	14.7
40 % LC50	193.82	186.67	40 % LC50	56.38	53.91

Tabelle 1: experimentelle Koffein Behandlungen für Zebrafisch und Fathead Elritze Experimente. Nominal- und gemessenen Werte von Koffein für jede Behandlung erhalten. * Die Koffein-Behandlungen, die in dieser Studie verwendeten repräsentieren die oberen Perzentile der Exposition Distributionen basierend auf ökologischen Messwerte von Koffein¹⁶. THV: Therapeutische Risiko Wert. DG: Limit of Detection

2. Gießen Sie die fertige Lösung in einzelnen Exposition Sekt. Verwenden Sie 100 mL Glas Becher gefüllt mit 20 mL Exposition Lösung für Zebrafisch Exposition Kammern und 500 mL Becher mit 200 mL Exposition Lösung für Fathead Elritze Exposition Kammern.
3. Legen Sie mit einer transferpipette, 10 Zebrafish Embryos im Alter von 4 – 6 h Post Düngung (hpf) in jede der vier wiederholte Exposition Kammern pro Behandlung.
4. Platz 10 Fathead Elritze Larven im Alter innerhalb von 24 h von Schraffuren in jedem der drei wiederholte Exposition Kammern pro Behandlung. Um die größere Größe von Fathead Elritze Larven unterzubringen, geschnitten Sie die Transfer-PIPETTENSPITZE vor Übertragung ab.
5. Pflegen Zebrafisch Experimente auf eine 16:8 h hell: dunkel Photoperiode und eine Konstante Temperatur von 28 ± 1 ° C. Verwenden Sie das gleiche Photoperiode Regime für Fathead Elritze Studien, aber bei einer Temperatur von 25 ± 1 ° C.
6. Nach 96 h Exposition gegenüber chemischen Stoffen Platten Ladung Fisch einzeln in separaten Brunnen von 48 (für Zebrafisch) und 24 (für Fathead Elritze) gut.
   1. Um sicherzustellen, dass jeder auch ein gleiches Volumen der Lösung enthält, übertragen Sie zebrafischlarven auf 48 well-Platten mit einer 5.000 µL Autopipette ein Volumen von 1.000 µL pro Bohrloch. Verwenden der Autopipette zum zurückziehen und übertragen der zebrafischlarven und der Exposition Lösung gleichzeitig.
   2. Aufgrund ihrer größeren Größe übertragen Sie Fathead Elritze Larven mit einer transferpipette mit der Spitze abgeschnitten. Vor der Übertragung von Fathead Elritze Larven auf einzelnen Wells, füllen jeweils gut auf 2.000 µL mit einer Autopipette. Beim Übertragen von einzelnen Fathead Larven in Brunnen, die Transfer-PIPETTENSPITZE in die gut Lösung und ermöglichen Sie die Fische zu schwimmen von der Pipettenspitze in den Brunnen.

2. Kalibrierung des Video-Tracking-Parameter

1. Vor Verhaltensmaßnahmen, Beobachtung und Kalibrierung Parameter in der Videospur Software einstellen (siehe Tabelle der Materialien).
   1. Legen Sie eine well-Platte in der Aufnahme-Kammer mit mindestens 1 larval Fish in einem einzelnen Brunnen. Verwenden Sie die Platte und die damit verbundenen Fisch als Darstellungen, um Kalibrierung Parameter festzulegen.
   2. In der Videospur Software, klicken Sie auf "Datei | Protokoll zu generieren", dem öffnet sich einer Dialogbox"Protokoll-Assistent". Geben Sie im Feld "Standort Count" die Anzahl der einzelnen Vertiefungen der well-Platte, und klicken Sie dann auf "OK".
   3. Am oberen Rand des Bildschirms, klicken Sie auf "Ansicht | Full Screen", die das System eine obenliegende Kameraansicht der well-Platte anzeigen veranlassen wird.
   4. Klicken Sie auf "Zeichnen Areas", die als drei bunten Formen erscheint. Wählen Sie auf der rechten Seite der gut Sichtbereich Platte das Kreissymbol im Feld mit der Bezeichnung "Areas".
   5. Verwenden Sie den Cursor, um das kreisförmige Video tracking-Bereich in der oberen linken gut von der well-Platte zu umreißen. Wählen Sie "Oben rechts markieren" und dann skizzieren Sie den Anzeigebereich oben rechts gut zu. Wählen Sie dann "Unten Mark" unten rechts gut zu skizzieren.
      Hinweis: Nachdem Sie den kreisförmigen Umriss gezeichnet, seine Position müssen wahrscheinlich angepasst werden.  Um die Position der Kontur ändern möchten, klicken Sie auf "auswählen" und verwenden Sie dann den Cursor zu den umrissenen Bereich bewegen. Außerdem können Konturen repliziert werden, indem Sie auf "Kopieren" und dann "Einfügen".
   6. Nach oben, rechts, oben links und unten recht gut tracking Bereiche definiert wurden, klicken Sie auf "Build", um die Software automatisch die Viewings der verbleibenden Brunnen abzugrenzen.
   7. Klicken Sie in den Bereich mit der Bezeichnung "Kalibrierung" "Scale zeichnen". Verwenden Sie den Cursor auf um eine horizontale Linie über die Platte zu ziehen. Sobald die Linie gezeichnet wird, erscheint ein Dialogfeld mit der Bezeichnung "Kalibriermessung". Geben Sie die Länge der well-Platte, und klicken Sie auf "OK".
   8. Beenden Sie die Zeichnung Manager durch Anklicken des Symbols "Bereiche zeichnen".
   9. Klicken Sie auf das Symbol "Kacheln".  Mit dem Cursor markieren Sie alle Felder, die auf dem Bildschirm angezeigt werden, so dass jede Box grün ist.
      Hinweis: Die Fliesen-Symbol erscheint als eine Gruppe von sechs einzelne kleine Quadrate
   10. "Klicken Sie auf Ansicht | "Full Screen".  Klicken Sie auf der rechten Seite der Platte die Bildfläche "Bkg" in das Feld mit der Bezeichnung "Nachweisgrenze". Verwenden Sie den Schwellenwert-Schieberegler, um die Pixel-Nachweisgrenze festzulegen. Einmal die entsprechenden Pixel Nachweisgrenze ausgewählt ist, klicken Sie auf "Anwenden, Gruppe".
       Hinweis: Dieses Protokoll wird die Nachweisgrenze um 13 Uhr im schwarzen Modus für Zebrafisch-Beobachtungen und bei 110 im transparenten Modus für Fathead Elritze Beobachtungen.
   11. Geben Sie im Feld mit der Bezeichnung "Bewegungsgrenze" die gewünschten Bewegungsgeschwindigkeit tracking-Parameter. Sobald Geschwindigkeitsparameter festgelegt sind, klicken Sie auf "Anwenden zu Gruppe".
       Hinweis: Dieses Protokoll setzt kleine/große Bewegungen auf 20 mm/s und inaktiv/kleine Bewegungen bei 5 mm/s. Diese Auswahl Programmieren die Software larval Fish Bewegung auf drei verschiedenen Geschwindigkeitsstufen: inaktiv (Einfrieren) = < 5 mm/s, kleine (cruising) = 5-20 mm/s und großen (platzen) = > 20 mm/s.
   12. Klicken Sie auf "Parameter | Das Protokoll Parameter"aus dem Dropdown-Menü. Wählen Sie in der Dialogbox die Registerkarte "Time" "geben Sie die Beobachtungszeit und Integrationszeit. Klicken Sie auf "Ok", nachdem Parameter eingegeben werden.
   13. Legen Sie Dropdown die hell/dunkel Photoperiode Zeiten und Lichtintensität für jede Photoperiode offen die leichte Treibereinstellungen Box Dialog durch Auswahl von "Licht fahren" von den "Parametern"-Menü.
       Hinweis: Siehe Protokoll für die Einstellung mehrere hell-dunkel-photoperioden video.
   14. Nachdem Sie die video-Tracking-Parameter eingestellt haben, retten Sie die Beobachtung-Protokoll.
       Hinweis: Dieses Protokoll beobachtet Fisch Verhalten über einen Zeitraum von 50 min, der enthält eine 10 min Akklimatisierung Phase gefolgt von 4 hell/dunkel-Phasen, bestehend aus zwei 10 min leichte Perioden und zwei 10 min dunkle Perioden zu verändern. Die Integrationszeit soll Verhalten für jede Minute der 50 min Verhaltens Prüfung zu messen.

3. Beobachtung der Bewegungsorgane Larval Fish und Photomotor Verhalten

1. Legen Sie die well-Platte mit experimentellen Fischen in der Verhaltenstherapie Aufnahme Kammer.
2. Öffnen Sie in dem Video tracking-Software die Tracking-Protokoll, das in Schritt 3 entwickelt.
3. Überprüfen Sie im video-Tracking-Viewer, um sicherzustellen, dass alle Larven auf dem Bildschirm sichtbar sind, dass nur eine einzelne Larve in jede Vertiefung vorhanden ist, und dass einzelne Brunnen innerhalb der Beobachtung Bereiche ausgerichtet sind, die in den Schritten 2.1.5 und 2.1.6 definiert wurden.
4. Klicken Sie auf "Experiment | Execute".
   Hinweis: Das System fordert den Benutzer, einen Namen und einen Speicherort für die Beobachtungsdaten anzugeben.
5. Einmal den Namen und Speicherort der Beobachtung Daten angegeben wurden, klicken Sie auf das Symbol "Mehrere Live-Bilder" markieren Sie alle vordefinierten Viewings
   Hinweis: Dieses Symbol befindet sich oben auf dem Computerbildschirm angezeigt und erscheint als eine Box in vier kleinere Quadrate unterteilt. Klicken Sie auf dieses Symbol, markieren Sie alle vordefinierten Viewings.
6. Schließen Sie das Fenster der Kammer Aufnahme und klicken Sie auf "Hintergrund | Start"auf dem Computer-Monitor.

4. Analyse von Verhaltensdaten

1. Larval Fish Aktivitätsdaten abzurufen, öffnen Sie die Tabelle, die wird automatisch von der Tracking-Software zusammengestellt und in den Ordner vom Benutzer vor Einleitung eines Verhaltens Studien (Schritt 3.4) angegeben ist.
2. Siehe Abbildungen 1A und 1 b für repräsentative Messungen der naiv lokomotorischen Tätigkeit der unbelichteten Zebrafisch und Fathead Elritze Larven, beziehungsweise. Finden Sie unter Zahlen 1 und 1D PMR Berechnungen, die das Ausmaß der Bewegung Unterschied zwischen hell, dunkel oder hell zu dunkel Übergänge effektiv zu untersuchen.

Abbildung 1: Beispiel der Grundlinie unbelichteten Zebrafisch (A und B) und Fathead Elritze (C und D). Der Mittelwert (± SEM) Abstand Schwamm für Zebrafisch (A) und Fathead Elritze (C) ist gegeben durch Punkte jede Vertretung einminütigen Abständen Aktivität. Zwei dunkle und zwei leichte Perioden der Photomotor Antworten werden gemessen. Die letzte (a, c, e und g) und erste (b, d, f und h) Minute jede Photoperiode dienen zum PMRs. Photomotor Reaktionen der Zebrafisch (B) berechnen und Fathead Elritze (D) werden gemessen, als die Veränderung der Mittelwert (±SEM) zurückgelegte Strecke zwischen der Last-Minute eine anfängliche Photoperiode und der ersten Minute der folgenden Periode. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Ergebnisse

Koffein Behandlung nicht merklich während der 96 h-Experimente mit Zebrafisch und Fathead Elritzen unterschiedlich. Tabelle 1 stellt analytisch geprüfte Konzentrationen des Levels Behandlung. Dieses Protokoll Wasserproben für Koffein Behandlung Ebenen von Isotop-Verdünnung Flüssigkeitschromatographie Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS/MS) in der Regel nach zuvor gemeldeten Methoden²⁸überprüft. Die Bildung von Paraxanthine, der primäre Metabolit von Koffein, wurde ebenfalls quantifiziert. Eine Beschreibung dieser analytischen Verfahren in der analytischen Zusatzinformationen. Aufgrund der Ähnlichkeiten zwischen nominal- und analytische Überprüfung der Behandlungen sind nominale Behandlung für den Rest des Manuskripts vorgestellt. Koffein verändert deutlich Zebrafisch und Fathead Elritze Verhaltensweisen. Zebrafisch Bewegungsapparates Antworten waren durchweg mehr empfindlich auf Koffein als Fathead Elritzen. Die empfindlichsten Verhaltens Endpunkte für Zebrafisch und Fathead Elritze Larven waren betroffen von Koffein in einer Konzentration von 0,039 mg/L. Tabelle 2 fasst niedrigste beobachtete Effekt Konzentrationen (LOECs) und keine beobachtete Effekt-Konzentrationen (NOECs) für jeden Verhaltens Endpunkt in beide Fisch-Modelle.

Zebrafisch			Fathead Elritze
Endpunkt	LOEC (mg/L)	NOEC (mg/L)	Endpunkt	LOEC (mg/L)	NOEC (mg/L)
Gesamtstrecke dunkel	0,412	0,039	Gesamtstrecke dunkel	−	56.38
Gesamtstrecke Licht	48.46	4.07	Gesamtstrecke Licht	−	56.38
Insgesamt zählt Dark	0,412	0,039	Insgesamt zählt Dark	−	56.38
Insgesamt zählt Licht	48.46	4.07	Insgesamt zählt Licht	−	56.38
Platzende Abstand dunkel	−	193.82	Platzende Abstand dunkel	−	56.38
Platzende Ferne Licht	193.82	48.46	Platzende Ferne Licht	−	56.38
Platzen zählt dunkel	193.82	48.46	Platzen zählt dunkel	−	56.38
Platzende zählt Licht	193.82	48.46	Platzende zählt Licht	−	56.38
Platzende Dauer dunkel	193.82	48.46	Platzende Dauer dunkel	−	56.38
Dauer Licht platzen	−	193.82	Dauer Licht platzen	−	56.38
Cruising Abstand dunkel	0,412	0,039	Cruising Abstand dunkel	−	56.38
Cruising Abstand Licht	48.46	4.07	Cruising Abstand Licht	−	56.38
Kreuzfahrt zählt dunkel	0,412	0,039	Kreuzfahrt zählt dunkel	−	56.38
Kreuzfahrt zählt Licht	48.46	4.07	Kreuzfahrt zählt Licht	−	56.38
Kreuzfahrt Dauer dunkel	0,412	0,039	Kreuzfahrt Dauer dunkel	−	56.38
Kreuzfahrt Dauer Licht	48.46	4.07	Kreuzfahrt Dauer Licht	−	56.38
Entfernung dunkle Einfrieren	0,412	0,039	Entfernung dunkle Einfrieren	0,039	0,001
Entfernung leicht Einfrieren	0,039	0,001	Entfernung leicht Einfrieren	−	56.38
Gefrierpunkt zählt dunkel	0,412	0,039	Gefrierpunkt zählt dunkel	−	56.38
Einfrierende zählt Licht	48.46	4.07	Einfrierende zählt Licht	−	56.38
Einfrieren von Dauer dunkel	−	193.82	Einfrieren von Dauer dunkel	56.38	14.10.
Dauer Licht Einfrieren	48.46	4.07	Dauer Licht Einfrieren	−	56.38
Dunkel 1 PMR	48.46	4.07	Dunkel 1 PMR	0,039	0,001
Licht 1 PMR	48.46	4.07	Licht 1 PMR	−	56.38
Dunkel 2 PMR	48.46	4.07	Dunkel 2 PMR	−	56.38
Licht 2 PMR	48.46	4.07	Licht 2 PMR	−	56.38
Platzende dunkel 1 PMR	−	193.82	Platzende dunkel 1 PMR	−	56.38
Platzen Licht 1 PMR	−	193.82	Platzen Licht 1 PMR	−	56.38
Dunkel 2 PMR platzen	193.82	48.46	Dunkel 2 PMR platzen	−	56.38
Platzen Licht 2 PMR	−	193.82	Platzen Licht 2 PMR	−	56.38
Cruising dunkel 1 PMR	48.46	4.07	Cruising dunkel 1 PMR	−	56.38
Kreuzfahrt Licht 1 PMR	48.46	4.07	Kreuzfahrt Licht 1 PMR	−	56.38
Cruising dunkel 2 PMR	48.46	4.07	Cruising dunkel 2 PMR	−	56.38
Cruising Light 2 PMR	193.82	48.46	Cruising Light 2 PMR	56.38	14.10.
Einfrieren von dunklen 1 PMR	48.46	4.07	Einfrieren von dunklen 1 PMR	−	56.38
Einfrieren von Licht 1 PMR	193.82	48.46	Einfrieren von Licht 1 PMR	−	56.38
Einfrieren von dunklen 2 PMR	48.46	4.07	Einfrieren von dunklen 2 PMR	−	56.38
Einfrieren von Licht 2 PMR	193.82	48.46	Einfrieren von Licht 2 PMR	−	56.38

Tabelle 2: Zebrafisch und Fathead Elritze behavioral NOECs und LOECs für Koffein. Keine beobachtete Effekt-Konzentration (NOEC) und niedrigste beobachtete Effekt Konzentration (LOEC) (mg/L) Werte für jede der hell/dunkel Schwimmen Aktivität Endpunkte und Photomotor Antworten für Zebrafisch und Fathead Elritzen Koffein ausgesetzt. Striche zeigen an, dass keine Auswirkungen auf einen bestimmten Endpunkt auf allen Ebenen der Behandlung beobachtet wurden.

Abbildung 2 zeigt Bewegungsorgane Gesamtaktivität und PMRs Zebrafisch und Fathead Elritze nach 96 h Exposition gegenüber Koffein. Fathead Elritze Larven, die durch Koffein auf den unteren Ebenen der Behandlung (0,038 mg/L) als Zebrafisch, aber eine deutlich größere Anzahl von Photomotor Endpunkte PMRs verändert wurden waren im Zebrafisch betroffen. Höchstmaß an Koffein (193,82 mg/L) Behandlung verändert PMR im Zebrafisch, in denen diese Reaktionen genau gegenüber waren von Steuerelementen. Auf dieser Ebene erhöhte Behandlung jedoch PMRs verringerte sich im Dunkeln und bei Licht erhöht.

Abbildung 2: Schwimmen-Aktivität und Photomotor Reaktionen der Zebrafisch (A und B) und Fathead Elritze (C und D) nach 96 h Exposition gegenüber Koffein. Der Mittelwert (± SEM) Abstand Schwamm für Zebrafisch (A) und Fathead Elritze (C) ist gegeben durch Punkte jede Vertretung 1-min Abständen von Aktivität. Photomotor Reaktionen der Zebrafisch (B) und Fathead Elritze (D) werden als die Veränderung der Mittelwert (± SE) insgesamt zurückgelegte Strecke zwischen der Last minutes von einer anfänglichen Photoperiode und der ersten Minute der folgenden Periode gemessen. Zwei dunkle und zwei leichte Periode Photomotor Antworten wurden gemessen. Insgesamt 24 Zebrafisch (4 Wiederholungen jeder 6 Larven) und 12 (3 Wiederholungen jeweils 4 Larven) Fathead Elritzen dienten für die Verhaltensbeobachtung. p < 0,10; p < 0,05; p < 0,01. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Neben der Messung Larven PMRs, war hell und dunkel lokomotorische Aktivität über drei Geschwindigkeit Schwellenwerte für Abstand verschoben, Anzahl der Bewegungen und die Dauer der Bewegungen analysiert. Diese Daten werden verwendet, um Verhaltensreaktion Profile für Koffein (Abbildung 3, Supplemental Abbildung 1) zu entwickeln. In beiden die Fisch-Modelle betroffen Koffein gehemmt Aktivität überhaupt deutlich Bewegungsorgane Endpunkte. Beide Fische Modelle nachgewiesenen erhöhten Aktivität bei der Bersten Geschwindigkeit Schwellen nach Exposition gegenüber Koffein, aber nicht signifikant. Ähnlich wie die Ergebnisse der Beobachtungen PMR, Koffein bewirkt eine größere Anzahl von Zebrafisch Bewegungsorgane Endpunkte. In der Tat verändert Koffein deutlich mehrere Bewegungsapparates Antworten unter dunklen Bedingungen bei ökologisch realistischen Werten unterhalb der THV. Fathead Elritze lokomotorischen Tätigkeit wurde unter Lichtverhältnissen von jeder Behandlung-Ebene jedoch nicht wesentlich beeinträchtigt.

Abbildung 3: Antwort Profile der Larven Zebrafisch und Fathead Elritzen nach 96 h Exposition gegenüber Koffein. Meine Zebrafisch dunkel (A) und Licht (B) schwimmen Aktivität im Vergleich zu Fathead Elritze dunkel (C) und Licht (D) Tätigkeit nach 96 h Exposition gegenüber Koffein bedeuten. Daten stellt Aktivität über zwei 10 min dunkle photoperioden und zwei 10 min leichte photoperioden für jedes Fisch-Modell dargestellt. Daten ist zu kontrollieren, normalisiert, die an der 0-Achse in jeder Figur vertreten sind. Verhaltensbezogene Parameter umfassen Distanz Schwamm, Anzahl der Bewegungen (Grafen) und Dauer eines jeden Satzes über 3 Geschwindigkeitsstufen, platzen (> 20 mm/s), Kreuzfahrt (5 – 20 mm/s), und Einfrieren (< 5 mm/s). Neben Bewegungsmuster bei jeder Geschwindigkeit Schwellen Gesamtstrecke geschwommen und Gesamtzahl der Bewegungen vertreten. ↑ stellt eine deutliche Steigerung in Aktivität im Vergleich zur Kontrolle und ↓ zeigt eine signifikante Abnahme der Aktivität im Vergleich zur Kontrolle. Insgesamt 24 Zebrafisch (4 Wiederholungen jeder 6 Larven) und 12 (3 Wiederholungen jeweils 4 Larven) Fathead Elritze Verwendungsnachweis in Verhaltensbeobachtungen für jede Gruppe. p < 0,10; p < 0,05; p < 0,01. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Ergänzende Abbildung 1: Photomotor Reaktionen der Zebrafisch (A und B) und Fathead Elritze (C und D) über drei Geschwindigkeit Schwellen. Zebrafisch (A, B und C) und Fathead Elritze Larven (D, E und F) Photomotor Antworten über drei Geschwindigkeit Schwellen (Einfrieren: 20 mm/s) nach 96 Stunden Exposition gegenüber Koffein. Photomotor Reaktionen der Zebrafisch und Fathead Elritze werden als die Abstandsänderung bedeuten (±SE) total reiste zwischen den Last minutes von einer anfänglichen Photoperiode und der ersten Minute der folgenden Periode gemessen. Zwei dunkle und zwei leichte Periode Photomotor Antworten wurden gemessen. Insgesamt 24 Zebrafisch (4 Wiederholungen jeder 6 Larven) und 12 (3 Wiederholungen von 4 Larven) Fathead Elritzen dienten für die Verhaltensbeobachtung. * p < 0,01 Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.

Diskussion

Bei der Auswahl der chemischen Behandlung Ebenen für Verhaltensstörungen toxikologischen Untersuchungen müssen mehrere Faktoren berücksichtigt werden. Coffein-Behandlung-Ebenen in der vorliegenden Studie wurden anhand der oberen Herz Werte für vorausgesagten ökologischen Expositionsszenarien aus Abwasser Abwasser¹⁶ausgewählt. Wenn möglich, wählen wir routinemäßig Behandlung Ebenen für aquatische Toxikologie Studien mit probabilistischen Expositionsabschätzungen ökologische Beobachtungen^19,20,21. Ein THV, die berechenbar für Arzneimittel ist, wurde auch als eine Behandlung-Ebene in der vorliegenden Studie aufgenommen. THV Werte (GL. 1)^22,23 als vorhergesagten Wasser-Konzentrationen führt zu menschlichen therapeutischen Dosen (Cmax) von Arzneimitteln in Fisch²³gelten, sind inspiriert vom ersten Plasma Modellierung Bemühungen²⁴und sind Blut: Wasser chemisch Partitionierung Koeffizienten (GL. 2)²⁵berechnet.

THV = C_max / log P_BW (GL. 1)

Log P_BW = Log [(10^{0,73. log Kow} · 0,16) + 0,84] (GL. 2)

Hier wählen wir zudem subletalen Behandlung Ebenen relativ Zebrafisch und Fathead Elritze LC50-Werte. Berücksichtigen wir diesen Ansatz ein nützliches benchmarking-Verfahren für Verhaltensreaktionen, insbesondere Schwellenwerte für spezifische Verhaltensweisen mit einem Fisch-Modell über mehrere Chemikalien zu vergleichen. Es ermöglicht weitere Berechnungen von akuten zu chronischen Verhältnisse, die in aquatische Toxikologie für mechanistische Studien und Evaluierungen diagnostisch hilfreich sein kann. LC50-Werte wurden von vorläufigen Toxizität Bioassays nach standardisierten Richtlinien gegeben in Schritt 2.1 erhalten.

In diesem Protokoll beschäftigen wir gemeinsamen experimentellen Designs und statistische Techniken von der US-EPA und OECD standardisierte Methoden zur toxikologischen Untersuchungen mit Fisch-Modelle empfohlen. Wenn wir p Werte melden (zB., < 0,01, < 0,05, < 0.10), signifikante Unterschiede (α = 0,10) Aktivität Ebenen werden identifiziert, unter Behandlungen mit Varianzanalyse (ANOVA), wenn Normalität und Gleichwertigkeit der Varianz Annahmen erfüllt sind. Die Dunnett oder Tukey HSD post-hoc-Tests werden durchgeführt, um die Behandlung Höhenunterschiede zu identifizieren. Wir wählen diese Alpha (α = 0,10) Wert zu reduzieren Typ II Fehler, insbesondere bei frühen Stufe Assays und wann ein Verständnis der biologisch wichtigen Effektgröße für erforschten Verhaltens Endpunkte und Modell Organismen²⁶, anstelle von begrenzt ist Verfahren immer häufiger in den biomedizinischen Wissenschaften für Mehrfachvergleiche beschäftigt (zB., Bonferroni-Korrektur für RNA-Seq Daten)²⁷.  Zukünftige Studien sind erforderlich, Variabilität der diese Verhaltensreaktionen zu verstehen und möglicherweise experimentellen Designs (z.B. Erhöhung der Replikation) entsprechend ändern.

Eine Reihe von Faktoren beeinflussen Verhalten von Larven Fischen neben Exposition gegenüber chemischen Stoffen. Beispiel: Zeit des Tages, Alter, gut Größe, Temperatur, unter welchen Lichtbedingungen und Volumen der Exposition Lösung in jedem gut repräsentieren wichtige Überlegungen^11,30. Aus diesen Gründen sollten Vorkehrungen getroffen werden, die Auswirkungen von externen Faktoren zu minimieren, die lokomotorische Verhalten der Larven Fische während der Experimente beeinflussen könnten. Verhaltensbeobachtungen sollte durchgeführt werden, in engen Zeitfenstern (3 bis 4 h) und über Zeiträume als Zeit des Tages Effekte werden voraussichtlich nur geringen Einfluss auf Larven lokomotorische Verhalten¹¹haben. Darüber hinaus sollten larval Fish bei einer konstanten Temperatur (28 ± 1 ° C für Zebrafisch) und 24 ± 1 ° C für FHM und auf einen definierten Hell/Dunkel-Zyklus in temperaturgesteuerten Inkubatoren während der Expositionszeit beibehalten werden. Darüber hinaus sollte die Temperatur des Labors wo Verhaltensweisen erfasst werden, Bedingungen, die Annäherung der Versuchsbedingungen, Temperatureinflüsse auf Verhaltensweisen zu vermeiden beibehalten werden. Darüber hinaus sollten Brunnen während Verhaltensbeobachtungen eingesetzt auf eine einheitliche Lautstärke für jeden einzelnen Fisch gehalten werden.

Larven und embryonalen Zebrafisch, die PMRs zuvor in den biomedizinischen Wissenschaften verwendet wurden, um mögliche therapeutische Ziele zu identifizieren, für Roman^12,13Verbindungen. Dieses Protokoll baut auf früheren Verhaltensforschung mit Zebrafisch durch die Verwendung von 38 Endpunkte untersuchen chemische Bioaktivität von Umweltschadstoffen. Obwohl Koffein eine gemeinsame aquatische Verunreinigung mit einem verständlichen Wirkmechanismus (MoA) ist, fehlt vielen Verbindungen im Handel wichtige mechanistische Daten. Daher kann dieses Protokoll Einblick von MoAs für Verbindungen fehlen Toxizitätsdaten, einschließlich kommerzielle Chemikalien³⁹eingesetzt werden. Darüber hinaus sieht das Protokoll Methoden für zwei der am häufigsten verwendeten Fisch-Modelle. Wie zuvor erwähnt, während der Zebrabärbling ist ein gemeinsames biomedizinische Fisch-Modell, das immer in Ökotoxikologie beliebter wird, Fathead Elritze dient häufig als ein ökologisches Modell für Umweltbewertung Anwendungen aber erhielt vergleichsweise weniger Aufmerksamkeit in Verhaltensstudien mit automatischen Systemen, im Vergleich zu der Zebrabärbling. Obwohl es keine standardisierten regulatorischen Methoden für Fisch Verhaltens toxikologischen Untersuchungen bleibt, bietet dieses Protokoll einen Ansatz zur zukünftigen Bemühungen zu unterstützen.

Koffein entlockte Verhaltensreaktionen aller Fisch-Modelle auf Ebenen, die in der aquatischen Umwelt¹⁶entdeckt wurden. Rodriguez-Gil Et Al. 2018 entwickelt globale Umweltexposition Verteilungen in aquatischen Systemen basierend auf Messwerten von Koffein¹⁶. Insbesondere würden 95 % der vorhergesagten Abwasser Abwasser-Konzentrationen der LOECs für die empfindlichsten Verhaltens Endpunkte der Zebrafisch und Fathead Elritze in der vorliegenden Studie (Tabelle 2) unterschritten werden. Obwohl mehrere Auswirkungen auf das Verhalten des Koffeins im Zebrafisch (besonders im Dunkeln) auf umweltrelevante Ebenen beobachtet wurden, ist unklar, ob diese Verhalten-Änderungen können in natürlichen Populationen auftreten oder führen ökologisch wichtige negative Ergebnisse. Obwohl für empfindliche diagnostische Screening Zwecke nützlich, möglicherweise larval Fish Verhaltens Schwellenwerte nicht Vertreter der anderen Lebensgeschichte Stufen oder Fische in natürlichen Populationen. Weiterer Forschung ist erforderlich um festzustellen, ob ähnliche Verhaltensreaktion Schwellen wäre in der Natur vorkommen und bezeichnend für negative Ergebnisse auf den Einzel- oder Bevölkerung Ebenen der biologischen Organisation.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
ViewPoint Zebrabox	ViewPoint		ZebraLab and ZebraLab platform for automated behavioral observations
Caffeine	Sigma-Aldrich	C0750-100G	Study chemical
Incubator	VWR	9110589	Maintains light/dark cycle and temperature for fathead minnow experiments
Incubator	Thermo Fisher Scientific	35824-636	Maintains light/dark cycle and temperature for zebrafish experiments
100 mL glass beakers	VWR	89000-200	Zebrafish exposure chambers
500 mL glass beakers	Pyrex	EW-34502-03	Fathead minnow exposure chambers
5,000 µL auto-pipette	Eppendorf	Research 5000	Used to fill individual wells in well plates
Transfer Pippettes	VWR	414-004-004	Used to transfer study organisms
48-well plates	Fisher Scientific	08-772-52	Larval zebrafish behavioral recording chambers
24-well plates	VWR	10062-896	Larval fathead minnow behavioral recording chambers
Calcium sulfate dihydrate	Sigma-Aldrich	C3771	For reconstituted hard water
Magnesium Sulfate	Sigma-Aldrich	M7506	For reconstituted hard water
Sodium Bicarbonate	Sigma-Aldrich	S5761	For reconstituted hard water
Potassium Chloride	Sigma-Aldrich	P9333	For reconstituted hard water
z-mod recirculating system	Marine Biotech Systems		Recirculating system to maintian zebrafish cultures
Statistical analysis software	Sigma Plot	Version 13.0	Used to analyze beahvioral data and produce figures
Statistical analysis software	Graphpad Prism	Prism 5	Used to produce figures
Autosampler/quaternary pumping system	Agilent Technologies	Infinity 1260 model	Analytical verification of caffeine treatment levels
Jet stream thermal gradient electrospray ionization source	Agilent Technologies		Analytical verification of caffeine treatment levels
Triple quadrupole mass analyzer	Agilent Technologies	Model 6420	Analytical verification of caffeine treatment levels
10 cm × 2.1 mm Poroshell 120 SB-AQ column (120Å, 2.7)	Agilent Technologies	685775-914T	Caffiene chromatography
MassHunter Optimizer Software	Agilent Technologies		Determine the ionization mode, monitored transitions, and instrumental parameters for caffeine/caffeine-d9 and paraxanthine/paraxanthine-d6