JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

والهدف من هذا الأسلوب إعداد ثقافة موتونيورونس الأولية (MNs) من الحبل الشوكي مورين التخصيب. لتقييم آثار الطفرات التي تسبب الأمراض مينيسوتا، يصف لنا هنا معزولة عزل هذه MNs وما تعداء من ماجنيتوفيكشن.

Abstract

نيوروديجينيريشن موتونيورونس العمود الفقري (MNs) المتورطة في طائفة واسعة من اضطرابات عصبية، بما في ذلك التصلب العضلي الجانبي ومرض شاركو-ماري الأسنان وضمور العضلات الشوكي، التي ترتبط كلها بضمور العضلات. الثقافات الأولية للعمود الفقري MNs استخدمت على نطاق واسع لإثبات تورط جينات محددة في مثل هذه الأمراض، وتميز بالآثار المترتبة على الطفرات الخلوية. هذا البروتوكول نماذج مينيسوتا أساسي الثقافة المستمدة من العمل المنوي هندرسون والزملاء منذ أكثر من عشرين عاماً. أولاً، أننا بالتفصيل طريقة تشريح قرون الأمامي من الحبل الشوكي من جنينا ماوس وعزل MNs من الخلايا باستخدام تدرج كثافة المجاورة. ثم، فإننا نقدم طريقة جديدة لكفاءة ترانسفيكتينج MNs مع البلازميدات التعبير باستخدام ماجنيتوفيكشن. أخيرا، نحن لتوضيح كيفية إصلاح وإيمونوستين الابتدائي MNs. استخدام الطفرات نيوروفيلامينت التي تسبب-شاركو ماري الأسنان المرض نوع 2، هذا البروتوكول يوضح نهجاً نوعيا للتعبير عن البروتينات للفائدة وتدرس مشاركتها في النمو MN، والصيانة، والبقاء على قيد الحياة.

Introduction

الأمراض العصبية العضلية تشمل مجموعة متنوعة من الأمراض سريرياً ووراثيا المتميزة التي تتميز بها تحوير العضلات و/أو الجهاز العصبي. وقد حددت مئات جينات المسؤولة عن هذه الاضطرابات النادرة بسبب التقدم في تكنولوجيا التسلسل، خلال العقد الماضي (قائمة متوفرة في مركز الأمراض نيوروموسكولار، http://neuromuscular.wustl.edu/index.html). مجموعة متنوعة الطفرات التي تم تحديدها ويشير إلى أن الطفرات المختلفة في جين واحد يمكن أن يسبب تعمل المختلفة والأمراض1،،من23 والتي يمكن أن تنتج الطفرات في جينات مختلفة تعمل مماثلة 4 , 5-وفي هذا السياق، هناك جهود تبذل لتطوير نماذج الخلوية التي يمكن أن تصبح أدوات قوية لتحليل آثار الطفرة والآليات المرضية.

MNs العمود الفقري لديها اتفاقات كبيرة تقع في قرون البطني الحبل الشوكي، شكل محاور عصبية طويلة لاستهداف ألياف العضلات الهيكلية، وتسمح بالانتقال الطوعي من خلال إطلاق سراح أستيل في الوصلات العصبية العضلية. ولما MNs تتأثر بأمراض الأعصاب مثل التصلب العضلي الجانبي، شاركو-ماري الأسنان المرض (CMT)، وضمور العضلات الشوكي، والدكتور هندرسون والزملاء وضع البروتوكول الأول6 يسمح بزراعة في المختبر MNs العمود الفقري واكتشاف نيوروتروفيك عامل جدنف7 (الخلية الدبقية مشتقة من نيوروتروفيك عامل). مكنت التحسينات التقنية منذ ذلك الحين لتنقية أكثر دقة MNs العمود الفقري والأنواع الفرعية الخاصة بها باستخدام نظام مراقبة الأصول الميدانية8، ولكن يظل الإثراء بالتدرج كثافة قوية والمستخدمة على نطاق واسع في المختبرات التي تعمل حاليا مع MNs العمود الفقري الأولية 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14-وفي وقت لاحق، من الممكن أيضا الحصول على أعلى درجة تنقية مينيسوتا عن طريق إيمونوبانينج بالاستفادة من السطح علامة p75(NTR)15،،من1617.

الحبل الشوكي يحتوي على أنواع فرعية مختلفة من MNs عنق الرحم والصدر وأسفل الظهر، فضلا عن الأعمدة موتور الوسطية والجانبية التي تختلف باختلاف مواقعها في القرن الأمامي على محور دورسو البطني ومن بين الأهداف التي يعصب8، 18-"مينيسوتا الأساسي" الثقافات يمكن استرداد كافة هذه الأنواع الفرعية مينيسوتا في نسب الفسيولوجية. القيد الرئيسي من هذا الأسلوب هو انخفاض عدد MNs تم الحصول عليها في نهاية الإجراء؛ في الواقع، فإنه يمكن توقع الحصول على حوالي 105 MNs من الأجنة الستة، ومناسبة للفحص المجهري ولكن الحد لتجارب الكيمياء الحيوية. للقيام بتجارب مع أكثر فرعية موحدة ووفرة MNs (> 106 خلايا)، الجنينية المستمدة من الخلايا الجذعية MNs ينبغي النظر في18.

تعداء المتسلسلات البرية-نوع/المسخ أو الجينات الذاتية ضربة قاضية إلى MNs الرئيسي أداة سريعة ومفيدة لفك رموز مسارات فيسيوباثولوجيكال، لا سيما عندما لا تتوفر نماذج الماوس. ماجنيتوفيكشن أسلوب واحد للعصبية الأولية ترانسفيكتينج، شبيه ليبوفيكشن دون السمية العصبية ذات الصلة. وعلاوة على ذلك، يمكن إجراء تعداء على الخلايا العصبية الناضجة بعد عدة أيام في المختبر، خلافا لتقنيات استناداً إلى انهانسر9. ومع ذلك، عيب واحد من هذه التقنية أن الخرز ربط الأحماض النووية في الثقافة، تسبب الضوضاء في وسم DAPI. العدوى الفيروسية المرجح هو الأسلوب الأكثر كفاءة ل MNs ترانسفيكتينج؛ ومع ذلك، لا يتطلب ماجنيتوفيكتيون بعض إجراءات السلامة اللازمة لإنتاج الفيروسية والعدوى الخلوية.

Protocol

وقبلت اللجنة الأخلاقية التابعة للمؤسسة كافة الإجراءات التي تنطوي على الحيوانات.

1-حل إعداد

  1. إعداد 10 مل من 4% دياليزيد جيش صرب البوسنة في المتوسط L-15.
    1. حل مسحوق ألبومين المصل البقري في 4% (w/v) في 10 مل من L-15 المتوسطة.
    2. إضافة الحل إلى كاسيت الغسيل الكلوي 20 مل مع وقف كاتشين 20. دياليزي ضد 500 مل متوسطة L-15 لمدة 3 أيام تحت التحريض في 4 درجات مئوية. تغيير L-15 المتوسط كل يوم.
    3. تصفية الحل من خلال 0.22 ميكرومتر الغشاء وقاسمه في أنابيب 15 مل. تخزين الأنابيب عند-20 درجة مئوية.
      ملاحظة: يستخدم هذا البروتوكول على المراجع التالية: غير معدلة المتوسطة L-15 الخام = L-15 المتوسطة، حمضية L-15 المتوسطة = pH L-15 والأساسية L-15 المتوسطة = L-15 بيكربونات.
  2. إعداد 200 مل من الأس الهيدروجيني L-15.
    1. ضبط الأس الهيدروجيني للوسط L-15: أولاً، ملء زجاجة المياه والصرف الصحي مع بعض قطع من الثلج الجاف. حقن الغاز (CO2) في المتوسط L-15 حتى يتحول اللون البرتقالي (~ الضغوط pH 6.4 و ~ 40). ويمكن تعديل درجة الحموضة أيضا مع مقياس الأس الهيدروجيني قياسي.
    2. تصفية المتوسطة من خلال 0.22 ميكرومتر الغشاء ومخزن في 4 درجات مئوية لمدة شهر واحد.
  3. تحضير 100 مل L-15 بيكربونات.
    1. إضافة 2.5 مل بيكربونات الصوديوم 7% لمل 97.5 من المتوسطة L-15 وتخزينها في 4 درجات مئوية.
  4. إعداد الملاحق IPCS (الأنسولين بوتريسسين كونالبومين سيلينيت).
    1. حل 2.5 ملغم للأنسولين في 0.5 مل من 0.1 M HCl. إضافة 4.5 مل من الماء المقطر مزدوجة.
    2. حل 8 ملغ بوتريسسيني في 5 مل من المحلول الملحي مخزنة الفوسفات (PBS).
    3. حل 100 مغ كونالبومين في 10 مل من برنامج تلفزيوني.
    4. حل 1 مغ سيلينيت الصوديوم في 19.3 مل من الماء، وضبط ال pH إلى 7.4، وتمييع الحل 10 إضعاف.
    5. الجمع بين 0.1 مل من حل سيلينيت الصوديوم للحصول على 3.1 مل من محلول الملحق IPCS، 1 مل من كونالبومين، 1 مل من محلول الأنسولين و 1 مل من محلول بوتريسسيني. مخزن الحل عند-20 درجة مئوية.
  5. تعد حلاً البروجسترون 0.02 مم.
    1. حل 1 مغ البروجسترون في 1.6 مل إيثانول 80%.
    2. تمييع إيثانول 100% في 100-fold الحل وتخزينها في-20 درجة مئوية.
  6. تحضير 100 مل من إكمال L-15 المتوسطة.
    1. إضافة 1.8 مل من محلول د-الجلوكوز (200 مغ/مل) لمل 92 من الأس الهيدروجيني L-15 للحصول على تركيز نهائي 3.5 ملغ/مل جلوكوز.
    2. الجمع بين 1 مل 100 × البنسلين والستربتوميسين (10,000 U/mL)، 2 مل مصل الحصان إبطال الحرارة ومل 3.1 من مزيج IPCS 0.1 مل من محلول البروجسترون (2 × 10-5 م).
    3. تصفية المتوسطة في غشاء 0.22 ميكرومتر وتخزينها في 4 درجات مئوية.
  7. إعداد 5 مل من محلول (تركيز الأخير من 5.5 في المائة) من كثافة متدرجة كل تجربة.
    1. إضافة ميليلتر 476 المتوسطة الكثافة 60% التدرج التجارية إلى 4524 ميليلتر من L-15 (إذا كان ذلك ممكناً، دون الفينول الأحمر لزيادة التباين المرئي في الطور البيني؛ نسبة التخفيف من 1:10. 5).
    2. تخزين الحل عند 4 درجة مئوية لمدة 2 أسابيع أو تجميدها عند-20 درجة مئوية.
  8. إعداد 10 مل وسائط الثقافة.
    1. إضافة 200 ميليلتر من الملحق المتوسطة إلى 9.6 مل من الخلايا العصبية الثقافة المتوسطة.
    2. إضافة 200 ميليلتر من مصل الحصان إبطال الحرارة (الذي يميل إلى التمييز بين السلائف الخلية الدبقية ويعمل ضد الانتشار) إلى 25 ميليلتر من الجلوتامين و 10 ميليلتر من 2-mercaptoethanol.
    3. تصفية وسائل الإعلام من خلال عامل تصفية 0.22 ميكرومتر.
    4. إضافة نيوروتروفيك العوامل التالية: عامل نيوروتروفيك الهدبية (كنتف) بتركيز نهائي 10 نانوغرام/مل، والدماغ نيوروتروفيك المشتقة عامل (BDNF) والخلايا الدبقية نيوروتروفيك المشتقة (جدنف) بتركيزات النهائي من 1 نانوغرام/مليلتر.
    5. تخزين الوسائط في 4 درجات مئوية.
  9. إعداد 50 مل من تشريح وسائط الإعلام.
    1. إضافة مل 2.25 الجلوكوز (200 مغ/مل) لمل 47.05 من حبس. إضافة ميليلتر 700 1 م حبيس مع درجة الحموضة 7.4. تخزين الوسائط في 4 درجات مئوية.
  10. إعداد حل منهاج عمل 4%.
    1. حل 20 غراما من منهاج عمل بيجين في 500 مل من برنامج تلفزيوني.
    2. تحت غطاء كيميائية، الحرارة الحل إلى 60 درجة مئوية وإضافة بضع قطرات من هيدروكسيد الصوديوم م 1 حتى يصبح الحل واضح.
    3. تصفية الحل عن طريق ورقة تصفية وضبط درجة الحموضة إلى 7.2. تخزينها في-20 درجة مئوية.
      ملاحظة: بدلاً من ذلك، حلول منهاج عمل تجارية أخرى يمكن استخدامها والمخفف بنسبة 4 في المائة في برنامج تلفزيوني.
  11. تنظيف أدوات التشريح بما في ذلك الملقط، والمقص، وأطباق سيليكون مع الإيثانول 70% قبل الاستخدام، ومع الصابون ومسح الماء بعد الاستخدام.

2-بولي-أورنيثيني/لامينين (ص. ب/لتر) طبق الطلاء

ملاحظة: وحدات التخزين يتم تكييفها لمعطف صفيحة 24-جيدا.

  1. إذا لزم الأمر، ضع ساترة عقيمة 12 مم في البئر.
  2. معطف الآبار مع 500 ميليلتر من 10 ميكروغرام/مل بولي-L-Ornithine الحل المذابة في الماء.
  3. واسمحوا الآبار التي تستقر عند درجة حرارة الغرفة ح 1.
  4. إزالة الحل بولي-L-Ornithine وأيردري لمدة 30 دقيقة.
  5. معطف الآبار بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية مع 500 ميليلتر من 3 ميكروغرام/مل لامينين في بيكربونات L-15.
    ملاحظة: يمكن تخزين آبار في 37 درجة مئوية لمدة 7 أيام في الحاضنة. إينكوبيشنز طويلة، مشيراً إلى برنامج تلفزيوني العقيمة بين الآبار يمكن أن يساعد على تجنب التبخر متوسطة.

3-تشريح

  1. التضحية بماوس حوامل عند الأجنة في المرحلة الجنينية E12.5. تنظيف البطن مع الإيثانول 70%.
  2. إزالة الرحم بقطع أوفيدوكتس اثنين والمهبل ووضعه في طبق بتري مليئة ببرنامج تلفزيوني الباردة (دون Ca2 + Mg2 +).
  3. جمع جميع الأجنة ونقلها إلى الطازجة، برنامج تلفزيوني الباردة (دون Ca2 + Mg2 +) في طبق بتري.
  4. وضع الجنين واحد في صحن المغلفة بالسيليكون ومليئة بالإعلام تشريح (مع هبس والجلوكوز 4.5 غرام/لتر، ومم 7 هيبيس الأس الهيدروجيني 7.4).
    ملاحظة: يتم إجراء تشريح الجنين تحت مجهر باستخدام الملقط غرامة نظيفة ومقص. وبدلاً من ذلك، يمكن استخدام طبق بيتري عادية دون سيليكون للتشريح.
  5. إزالة الرأس والذيل، والأحشاء، باستخدام الملقط كالمقص.
  6. الحفاظ على الجنين بالبطن ضد السيليكون بالملقط.
  7. مع زوج ثاني من الملقط، أدخل واحدة من النصائح في القناة المركزية للحبل الشوكي روسترال.
  8. إغلاق الملقط تمزق الأنسجة الظهرية بضعة ملليمترات.
  9. كرر هذه العملية نحو الجانب والذيلية حتى النخاع الشوكي كامل مفتوح (الشكل 1B).
  10. فصل الجزء روسترال من النخاع الشوكي (جذع المخ) من الجسم.
  11. دورة الجنين إلى الحفاظ على الحبل الشوكي مفتوحة ضد السيليكون.
  12. قرصه الجزء روسترال من الحبل الشوكي وسحب الجنين بالرأس لاستخراج النخاع الشوكي.
    ملاحظة: السحايا والعقد الجذرية الظهرية (باﻷسعار) ينبغي أن تظل متمسكة بالجنين. وبخلاف ذلك، بعناية سحب بعيداً أي باﻷسعار لا تزال تعلق على الحبل الشوكي والسحايا المتبقية. في هذه الخطوة، يمكن أيضا جمع باﻷسعار لثقافة العصبية الحساسة (انظر المناقشة).
  13. شد الحبل الشوكي على السيليكون وإزالة نصف الظهرية الحبل بالقطع على طول الوسط من كل جانب باستخدام مشرط. قص الجزء الأوسط إلى 10 أجزاء باستخدام مشرط، ونقل القطع إلى أنبوب جديد.

4-الحبل الشوكي تعليق خلية

  1. كرر هذا الإجراء تشريح للحبال الشوكي 6 إلى 8.
  2. واسمحوا الحبل الشوكي القطع جمع في الجزء السفلي من الأنبوب واستبدالها هبس 1 مل من لحم الخنزير-F10 المتوسطة.
  3. إضافة 10 ميليلتر من التربسين (2.5% w/v؛ تركيز نهائي 0.025%). احتضان الأنبوب لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية.
  4. لإيقاف عملية الهضم الأنزيمي، نقل الأجزاء إلى أنبوب 15 مل جديد يحتوي على 800 ميليلتر الكامل L-15 المتوسطة و 100 ميليلتر من 4% (w/v) جيش صرب البوسنة 100 ميليلتر من الدناز (1 ملغ/مل في المتوسط L-15).
  5. تريتوراتي مرتين من قبل يسفط 1 مل باستخدام ماصة P1000. الشظايا تسوية لجمع الحد الأدنى 2 المادة طافية في أنبوب جديد 15 مل.
  6. للشظايا، إضافة 900 ميليلتر الكامل L-15 المتوسطة و 100 ميليلتر من 4% (w/v) جيش صرب البوسنة و 100 ميليلتر من الدناز (1 ملغ/مل في المتوسط L-15).
  7. تريتوراتي 6 مرات من يسفط 1 مل باستخدام ماصة P1000. واسمحوا الشظايا تسوية للحد الأدنى 2 إضافة المادة طافية إلى أنبوب 15 مل التي تم الحصول عليها في الخطوة 4، 5.
  8. للشظايا، إضافة 900 ميليلتر الكامل L-15 المتوسطة و 100 ميليلتر من 4% (w/v) جيش صرب البوسنة و 100 ميليلتر من الدناز (1 ملغ/مل في المتوسط L-15).
  9. تريتوراتي 10 مرات من يسفط 1 مل باستخدام ماصة P1000. واسمحوا الشظايا تسوية للحد الأدنى 2 إضافة المادة طافية إلى أنبوب 15 مل التي تم الحصول عليها في الخطوة 4، 5. المضي قدما مع المادة طافية.
  10. بلطف باستخدام بيبيت P1000، ضع وسادة 4% (w/v) جيش صرب البوسنة 2 مل في الجزء السفلي من أنبوب طافية. الطرد المركزي في 470 x ز لمدة 5 دقائق.
  11. إزالة المادة طافية وريسوسبيند بيليه الخلية مع 2 مل من إكمال L-15 المتوسطة.

5-مينيسوتا الإثراء بكثافة التدرج

  1. تقسيم تعليق خلية في أنبوبين 15 مل (1 مل في كل). ثم أضف 2 مل من إكمال L-15 المتوسطة. إذا بدءاً من 6 أجنة، استخدم ما يعادل 3 أجنة كل أنبوب في 3 مل متوسطة.
  2. إضافة 2 مل من محلول التدرج كثافة بإضافة الحل ببطء إلى الجزء السفلي من كل أنبوبة للحصول على واجهة حادة.
  3. الطرد المركزي في 830 x ز لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد هذه الخطوة، يجب أن تكون خلايا صغيرة في الجزء السفلي من الأنبوب، بينما يجب أن تكون الخلايا الكبيرة مثل MNs في واجهة الحل المتدرجة والمتوسطة الكثافة.
  4. جمع الخلايا في الواجهة يسفط 1 أو 2 مل وتحويلها إلى أنبوب جديد 15 مل. ضبط حجم الصوت إلى 10 مل مع L-15 الأس الهيدروجيني المتوسطة.
  5. إضافة 2 مل وسادة جيش صرب البوسنة 4% إلى القيعان من أنابيب وأجهزة الطرد المركزي في 470 x ز لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  6. إزالة المادة طافية وريسوسبيند بيليه في 3 مل من إكمال L-15 المتوسطة.
  7. كرر الخطوة 5، 5.
  8. إزالة المادة طافية وريسوسبيند بيليه الخلية في 2 مل من إكمال الثقافة المتوسطة. حساب عدد الخلايا والبقاء تحت مجهر تباين المرحلة مع هيموسيتوميتير.
    ملاحظة: للحبال الشوكي 6، عدد الخلايا من المتوقع أن يكون حوالي 1 × 105 MNs.

6-مينيسوتا الثقافة

  1. تمييع MNs للكثافة المناسبة، عادة ما 5,000 إلى 10,000 الخلايا في 500 ميليلتر من المتوسطة الثقافة الواحدة وكذلك في لوحة 24-جيدا.
    ملاحظة: بذر الكثافة حول الخلايا 30,000 و 1500 6-96 جيدا ولوحات، على التوالي.
  2. إزالة الحل لامينين مع P1000.
  3. نقل على الفور MNs المخفف في الثقافة المتوسطة إلى لوحات طلاء لتجنب التجفيف.
  4. احتضان الثقافة لمدة يومين في 37 درجة مئوية.

7-ماجنيتوفيكشن MNs

ملاحظة: في الخطوات التالية، تختص بالكميات المستخدمة تعداء بئر واحدة من صفيحة 24-جيدا. الرجاء الرجوع إلى الشركة المصنعة على البروتوكول المتعلق بتنسيق آخر.

  1. لإعداد الحمض النووي، ريسوسبيند 1 ميكروغرام من الحمض النووي في 50 ميليلتر من الخلايا العصبية الثقافة المتوسطة ودوامه ل 5 ق.
  2. لإعداد أنبوب حبة، ريسوسبيند ميليلتر 1.5 من الخرز في 50 ميليلتر من الخلايا العصبية الثقافة المتوسطة.
  3. إضافة حل حبة 50 ميليلتر للحل الحمض النووي 50 ميليلتر واحتضان لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (الحجم الإجمالي = 100 ميليلتر).
  4. خلال هذه الحضانة، سحب 100 ميليلتر من مستنبت من البئر التي سوف تكون ترانسفيكتيد.
    ملاحظة: وضع لوحة مغناطيسية في الحاضنة الدافئة إلى 37 درجة مئوية.
  5. نقل 100 ميليلتر من مزيج الحمض النووي/حبة للبئر، واحتضان اللوحة 20 – 30 دقيقة على لوحة مغناطيسية عند 37 درجة مئوية.
  6. انتظر 24 ساعة على الأقل قبل الكشف عن التعبير كدنا.

8-تثبيت وتلطيخ

  1. أغسل ثقافة 2 مرات مع برنامج تلفزيوني.
  2. احتضان ثقافة لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في 4% PFA/برنامج تلفزيوني.
  3. أغسل ثقافة 2 مرات مع برنامج تلفزيوني.
  4. احتضان الثقافة في 500 ميليلتر من حظر المخزن المؤقت (برنامج تلفزيوني، جيش صرب البوسنة 4%، 2% طبيعية مصل، 0.3% X-100 تريتون، جليكاين م 0.1) ح 1 في درجة حرارة الغرفة.
    ملاحظة: ينبغي أن تستمد المصل العادي من نفس النوع كجسم الثانوية (مثلاً، مصل الماعز العادي).
  5. احتضان ثقافة بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية مع جسم الابتدائي المخفف في 250 ميليلتر من المخزن المؤقت لحظر.
    ملاحظة: على سبيل المثال، يستخدم TUJ1 في 1/1000، SMI32 يتم استخدام مبلغ 000 1/1، ويستخدم Lc3b في 1/200.
  6. أغسل ثقافة 3 مرات مع برنامج تلفزيوني.
  7. احتضان الثقافة مع الأضداد الثانوي مترافق fluorophore المخفف في 250 ميليلتر من المخزن المؤقت لحظر لمدة ساعة عند درجة حرارة الغرفة.
  8. أغسل ثقافة 3 مرات مع برنامج تلفزيوني.
  9. جبل على الشرائح الزجاجية باستخدام المتوسط المتصاعدة.

النتائج

بعد 24 ساعة في الثقافة، إبداء موتونيورونس (MNs) الفعل النمو محواري كبيرة (على الأقل 6 مرات أطول من حجم سوما). وفي الأيام التالية، محاور عصبية وينبغي أن تواصل نموها وعرض التفريع (الشكل 2). سوف يكون هناك مورفولوجيس مختلفة نظراً لخصوصيات النوع الفرعي. على سبيل الم?...

Discussion

واحدة من النقاط الحرجة في هذا البروتوكول أن يتم تشريح الأجنة الماوس في إطار زمني دقيق خلال التنمية (E12.5) لتحسين مقدار MNs تم الحصول عليها في النهاية. وبالإضافة إلى ذلك، للعائد الأمثل، ينبغي إجراء التشريح في الصباح أو بعد الظهر. قبل E12.5 (مثلاً، في E11.5)، تشريح الصعبة، لا سيما فيما يتعلق بالق...

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgements

ونود أن نشكر "الرابطة من أجل le neurogénétique de la التنمية" للدكتور جاككوير للزمالات وفؤاد-الحفل الخيري لدعمها من خلال الخطة الاستراتيجية ميونيورالب. كما نود أن نشكر الدكتور كريس هندرسون، الدكتور وليام Camu والدكتور بريجيت بيتمان، الدكتور سيدريك راؤول والدكتور جورج هاس، الذين شاركوا في تطوير وتحسين هذه التقنية ونشر هذه المعرفة.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Material
Silicone dissection dishLiving systems instrumentationDD-90-S-BLK-3PKSylgard
round coverslipNeuVitro, Knittel glassGG-12-Pre12 mm
Slide a Lyzer cassettesThermoFisher Scientific6603020,000 MWCO ; 30 mL
Filter unitMilliporeSCGVU02RE
GP Sterile Syringe FiltersMilliporeSLGP033RS
4 well plateThermoFisher Scientific167063Nunclon Delta treated plate
forcepsFST by Dumont11252-20#5 forceps
scissorFST by Dumont14060-10fine scissors
scalpelFST by Dumont10035-20curved blade
scalpelFST by Dumont10316-14micro-knife scalpel
Petri dishGreiner663102ø x h = 100 x 15 mm
15 mL polypropylene tubeFalcon352096
filter paperWatman1001125circle, 125 mm diameter
glass chamber slideLab-Tek1545264 chambers
Plasmid pCAGENAddgene#11160
NameCompanyCatalog NumberComments
Solutions and mediums
Bovine serum albuminSigma-AldrichA9418
L-15 mediumThermoFisher Scientific11415056
L-15 medium, no red phenolThermoFisher Scientific21083027
InsulinSigma-AldrichI6634
PutrescineSigma-AldrichP5780
ConalbuminSigma-AldrichC7786
Sodium seleniteSigma-AldrichS5261
ProgesteroneSigma-AldrichP8783
Poly-DL-OrnithineSigma-AldrichP8638
LamininSigma-AldrichL2020
trypsin 2.5%, 10xThermoFisher Scientific15090046
DNAseSigma-AldrichDN25
PBS w/o Ca MgThermoFisher Scientific14190144without Mg2+ Ca2+
sodium bicarbonateThermoFisher Scientific25080094
Neuron cell culture mediumThermoFisher ScientificA3582901Neurobasal Plus medium
HBSSSigma-AldrichH6648-500ML
HEPES buffer 1 MThermoFisher Scientific15630056
Density gradiant mediumSigma-AldrichD1556Optiprep
supplement mediumThermoFisher ScientificA3582801B-27 Plus
Horse serum heat inactivatedThermoFisher Scientific26050-088
L-Glutamine 200 mMThermoFisher Scientific25030024
2-mercaptoethanolThermoFisher Scientific31350010
penicilline/streptomycineThermoFisher Scientific1514012210,000 U/mL
NameCompanyCatalog NumberComments
Immuno fluorescence
PBS, 10xThermoFisher ScientificX0515without Mg2+ Ca2+
Paraformaldehyde (PFA)Sigma-Aldrich441244
normal goat serumSigma-AldrichG6767
glycineSigma-AldrichG7126
Triton X-100Sigma-AldrichT8787
Choline Acetyl Transferase (CHAT)ChemiconAb144P
Neurofilament H non phosphorylated (SMI32)BiolegendsSMI-32PIF at 1/1000
Islet-1DSHB40.2D6
Islet-2DSHB39.4D5
Hb9DSHB81.5C10
Vectashield mounting mediumVector LabH-1000
Beta3 tubulin (Tuj1 clone)Biolegends801201IF at 1/1000
Lc3bCell Signaling Technology#2775IF at 1/200

References

  1. Gonzalez, M. A., et al. A novel mutation in VCP causes Charcot-Marie-Tooth Type 2 disease. Brain. 137 (11), 2897-2902 (2014).
  2. Johnson, J. O., et al. Exome sequencing reveals VCP mutations as a cause of familial ALS. Neuron. 68 (5), 857-864 (2010).
  3. Watts, G. D. J., et al. Inclusion body myopathy associated with Paget disease of bone and frontotemporal dementia is caused by mutant valosin-containing protein. Nature Genetics. 36 (4), 377-381 (2004).
  4. Brown, R. H., Al-Chalabi, A. Amyotrophic Lateral Sclerosis. New England Journal of Medicine. 377 (2), 162-172 (2017).
  5. Taylor, J. P., Brown, R. H., Cleveland, D. W. Decoding ALS: from genes to mechanism. Nature. 539 (7628), 197-206 (2016).
  6. Henderson, C. E., Bloch-Gallego, E., Camu, W. Purified embryonic motoneurons. Nerve Cell Culture: A Practical Approach. , 69-81 (1995).
  7. Henderson, C. E., et al. GDNF: a potent survival factor for motoneurons present in peripheral nerve and muscle. Science. 266 (5187), 1062-1064 (1994).
  8. Schaller, S., et al. Novel combinatorial screening identifies neurotrophic factors for selective classes of motor neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (12), E2486-E2493 (2017).
  9. Jacquier, A., et al. Alsin/Rac1 signaling controls survival and growth of spinal motoneurons. Annals of Neurology. 60 (1), 105-117 (2006).
  10. Raoul, C., et al. Chronic activation in presymptomatic amyotrophic lateral sclerosis (ALS) mice of a feedback loop involving Fas, Daxx, and FasL. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (15), 6007-6012 (2006).
  11. Madji Hounoum, B., et al. Wildtype motoneurons, ALS-Linked SOD1 mutation and glutamate profoundly modify astrocyte metabolism and lactate shuttling. Glia. 65 (4), 592-605 (2017).
  12. Magrane, J., Sahawneh, M. A., Przedborski, S., Estevez, A. G., Manfredi, G. Mitochondrial Dynamics and Bioenergetic Dysfunction Is Associated with Synaptic Alterations in Mutant SOD1 Motor Neurons. Journal of Neuroscience. 32 (1), 229-242 (2012).
  13. Jacquier, A., et al. Cryptic amyloidogenic elements in mutant NEFH causing Charcot-Marie-Tooth 2 trigger aggresome formation and neuronal death. Acta Neuropathologica Communications. 5, (2017).
  14. Aebischer, J., et al. IFNγ triggers a LIGHT-dependent selective death of motoneurons contributing to the non-cell-autonomous effects of mutant SOD1. Cell Death and Differentiation. 18 (5), 754-768 (2011).
  15. Wiese, S., et al. Isolation and enrichment of embryonic mouse motoneurons from the lumbar spinal cord of individual mouse embryos. Nature Protocols. 5 (1), 31-38 (2010).
  16. Camu, W., Henderson, C. E. Purification of embryonic rat motoneurons by panning on a monoclonal antibody to the low-affinity NGF receptor. Journal of Neuroscience Methods. 44 (1), 59-70 (1992).
  17. Conrad, R., Jablonka, S., Sczepan, T., Sendtner, M., Wiese, S., Klausmeyer, A. Lectin-based Isolation and Culture of Mouse Embryonic Motoneurons. Journal of Visualized Experiments. (55), (2011).
  18. Wichterle, H., Lieberam, I., Porter, J. A., Jessell, T. M. Directed differentiation of embryonic stem cells into motor neurons. Cell. 110 (3), 385-397 (2002).
  19. Francius, C., Clotman, F. Generating spinal motor neuron diversity: a long quest for neuronal identity. Cellular and Molecular Life Sciences. 71 (5), 813-829 (2014).
  20. Neto, E., et al. Compartmentalized Microfluidic Platforms: The Unrivaled Breakthrough of In Vitro Tools for Neurobiological Research. The Journal of Neuroscience. 36 (46), 11573-11584 (2016).
  21. Matsuda, T., Cepko, C. L. Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (1), 16-22 (2004).
  22. Sleigh, J. N., Weir, G. A., Schiavo, G. A simple, step-by-step dissection protocol for the rapid isolation of mouse dorsal root ganglia. BMC Research Notes. 9, (2016).
  23. Yu, L., et al. Highly efficient method for gene delivery into mouse dorsal root ganglia neurons. Frontiers in Molecular Neuroscience. 8 (2), (2015).
  24. Malin, S. A., Davis, B. M., Molliver, D. C. Production of dissociated sensory neuron cultures and considerations for their use in studying neuronal function and plasticity. Nature Protocols. 2 (1), 152-160 (2007).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

143

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved