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  • Resumen
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  • Protocolo
  • Resultados
  • Discusión
  • Divulgaciones
  • Agradecimientos
  • Materiales
  • Referencias
  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

El objetivo de esta técnica es preparar una cultura altamente enriquecida de primarias motoneuronas (MNs) de murine de la médula espinal. Para evaluar las consecuencias de las mutaciones que causan enfermedades de MN, Describimos aquí el aislamiento de estos aislados MNs y su transfección por magnetofection.

Resumen

Neurodegeneración de espinales motoneuronas (MNs) está implicada en un amplio espectro de los trastornos neurológicos como esclerosis lateral amiotrófica, enfermedad de Charcot-Marie-Tooth, atrofia muscular, que son asociados con atrofia muscular. Cultivos primarios de MNs espinales se han utilizado extensamente para demostrar la implicación de genes específicos en este tipo de enfermedades y caracterizar las consecuencias celulares de sus mutaciones. Esta cultura de modelos un MN primaria protocolo deriva de la obra seminal de Henderson y colegas hace más de veinte años. En primer lugar, detalle un método de disección de los cuernos anteriores de la médula espinal de un embrión de ratón y aislar el MNs de los vecinos las células utilizando un gradiente de densidad. A continuación, presentamos una nueva forma de transferencia eficiente MNs con plásmidos de expresión utilizando magnetofection. Finalmente, ilustramos cómo solucionar y immunostain primaria que mns mediante mutaciones de neurofilamentos que causan la enfermedad de Charcot-Marie-Tooth tipo 2, este protocolo muestra un enfoque cualitativo a la expresión de proteínas de interés y estudiar su participación en MN el crecimiento, mantenimiento y supervivencia.

Introducción

Enfermedades neuromusculares abarcan una gran variedad de patologías clínicamente y genéticamente distintos que se caracterizan por la alteración del músculo o del sistema nervioso. Debido a los avances en tecnologías de secuenciación, se han identificado cientos de genes responsables de estas enfermedades raras durante la última década (lista disponible en el centro de enfermedad Neuromuscular, http://neuromuscular.wustl.edu/index.html). La variedad de mutaciones identificadas indica que diferentes mutaciones en un solo gen pueden producir diferentes fenotipos y enfermedades1,2,3 y que las mutaciones en distintos genes pueden producir fenotipos similares 4 , 5. en este contexto, hay esfuerzos para el desarrollo de modelos celulares que pueden convertirse en poderosas herramientas para el análisis de las consecuencias de la mutación y mecanismos patológicos.

MNs espinales tienen grandes somas en los cuernos ventrales de la médula espinal, axones largos forma a las fibras de músculo esqueléticas y permitir movimientos voluntarios a través de la liberación de acetilcolina en uniones neuromusculares. Desde MNs están afectados por enfermedades neuromusculares como esclerosis lateral amiotrófica, enfermedad de Charcot-Marie-Tooth (CMT), y la atrofia muscular espinal, Dr. Henderson y colegas desarrollaron el primer protocolo6 que permitió para el cultivo de in vitro espinales MNs y el descubrimiento de neurotrophic del factor GDNF7 (factor neurotrófico derivado de células gliales). Ajustes técnicos desde entonces han permitido la purificación más precisa de MNs espinales y sus subtipos utilizando FACS8y enriquecimiento por gradiente de densidad sigue siendo potente y ampliamente utilizado en laboratorios trabajando con MNs espinales primarias 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14. posteriormente, también es posible obtener un mayor grado de purificación de MN a través de immunopanning tomando ventaja del marcador superficial p75(NTR)15,16,17.

La médula espinal contiene diferentes subtipos de MNs cervicales, torácicas y lumbares, así como columnas motor medianas y lateral que difieren según su ubicación en el cuerno anterior en un eje dorsoventral y entre los blancos inervan8, 18. las culturas MN primaria pueden recuperar todos estos subtipos de MN en proporciones fisiológicas. La principal limitación de esta técnica es el bajo número de MNs obtenidos al final del procedimiento. de hecho, puede esperarse obtener alrededor de 105 MNs de seis embriones, que es conveniente para microscopía pero limitante para experimentos de bioquímica. Para llevar a cabo experimentos con subtipos más estandarizados y MNs abundante (> 106 células), embrionario MNs derivados de la célula de vástago deben ser considerados18.

Transfección de transgenes salvaje-tipo/mutante o precipitación genes endógenos en MNs primarias es una herramienta rápida y útil para descifrar las vías fisiopatológicas, especialmente cuando no están disponibles modelos de ratón. Magnetofection es una técnica de transferencia primaria las neuronas, similares a lipofection sin la neurotoxicidad relacionada. Además, transfección puede realizarse en neuronas maduras, después de varios días en vitro, a diferencia de técnicas de electroporación9. Sin embargo, una desventaja de esta técnica es que los granos unen los ácidos nucleicos en la cultura, causando ruido en el etiquetado de DAPI. Infección viral es probablemente la técnica más eficaz para transfectar MNs; sin embargo, magnetofection no requiere de ciertos procedimientos de seguridad necesarios para la producción viral y la infección celular.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran animales fueron aceptados por el Comité de ética de la institución.

1. preparación de la solución

  1. Preparar 10 mL de BSA dializaron en medio L-15 el 4%.
    1. Albúmina de suero bovino en polvo al 4% (w/v) se disuelven en 10 mL de medio de L-15.
    2. Añadir la solución en una casete de diálisis 20 mL con corte 20 kDa. Dializan contra 500 mL de medio de L-15 durante 3 días en agitación a 4 ° C. Cambiar el medio L-15 cada día.
    3. Filtrar la solución a través de 0,22 μm membrana y Alicuotar en tubos de 15 mL. Almacenar los tubos a-20 ° C.
      Nota: Este protocolo usa las siguientes referencias: medio de L-15 raw sin modificar = L-15 medio, ácido L-15 = pH L-15 y medio de L-15 base = L-15 bicarbonato.
  2. Preparar 200 mL de pH L-15.
    1. Ajustar el pH del medio L-15: en primer lugar, llenar una botella de lavado con algunos pedazos de hielo seco. Inyectar gas (CO2) en el medio de L-15 hasta que el color vuelve naranja (~ presiones pH 6.4 y ~ 40). El pH puede ajustarse también con un medidor de pH estándar.
    2. Filtrar el medio a través de un 0,22 μm membrana y almacenar a 4 ° C durante un mes.
  3. Preparar 100 mL de bicarbonato L-15.
    1. Añadir 2,5 mL de bicarbonato de sodio 7% a 97,5 mL de medio de L-15 y almacenar a 4 ° C.
  4. Preparar los suplementos de IPCS (insulina Putrescin Conalbumin selenita).
    1. Disolver 2,5 mg de insulina de 0,5 mL de 0.1 M HCl. agregar 4,5 mL de agua destilada doble.
    2. Disolver 8 mg de putrescina en 5 mL de solución salina tamponada con fosfato (PBS).
    3. Disolver 100 mg de conalbumin en 10 mL de PBS.
    4. Disolver 1 mg de selenito de sodio en 19,3 mL de agua, ajustar el pH a 7.4 y la solución diluida 10 veces.
    5. Mezclar 1 mL de solución de insulina, 1 mL de solución de putrescina, 1 mL de conalbumin y 0,1 mL de solución de selenito de sodio para obtener 3,1 mL de solución de suplemento de IPCS. La solución a-20 ° C.
  5. Preparar una solución de 0,02 mM progesterona.
    1. Disolver 1 mg de progesterona en 1,6 mL de etanol al 80%.
    2. Diluir la solución 100-fold en 100% de etanol y almacenar a-20 ° C.
  6. Preparar 100 mL de medio completo L-15.
    1. Agregue 1.8 mL de D-glucosa solución 200 mg/mL a 92 mL de pH L-15 para obtener una concentración final de 3,5 mg/mL glucosa.
    2. Combinar 1 mL de 100 x penicilina-estreptomicina (10.000 U/mL), 2 mL de suero de caballo inactivado con calor, 3,1 mL de mezcla IPCS y 0,1 mL de solución de progesterona (2 x 10-5 M).
    3. Filtrar el medio de una membrana de 0,22 μm y almacenar a 4 ° C.
  7. Preparar 5 mL de solución de gradiente de densidad (concentración final de 5,5%) por experimento.
    1. Añadir 476 μl del medio de gradiente de densidad 60% comercial a 4524 μl de L-15 (si es posible, sin rojo fenol para aumentar el contraste visual en la interfase; relación de dilución de 1:10. 5).
    2. Almacenar la solución a 4 ° C durante 2 semanas o congelar a-20 ° C.
  8. Preparar 10 mL de medio de cultivo.
    1. Añadir 200 μL de medio de suplemento a 9,6 mL de medio de cultivo celular de la neurona.
    2. Añadir 200 μL de suero de caballo inactivado con calor (que tiende a distinguir trabajos contra la proliferación y precursores de células gliales) en 25 μl de glutamina y 10 μl de 2-Mercaptoetanol.
    3. Filtro de los medios de comunicación a través de un filtro de 0,22 μm.
    4. Agregar los siguientes factores neurotróficos: factor neurotrófico ciliar (CNTF) a una concentración final de 10 ng/mL y el factor neurotrófico derivado de cerebro (BDNF) y el factor neurotrópico derivado de células gliales (GDNF) en concentraciones finales de 1 ng/mL.
    5. Almacenar los medios de comunicación a 4 ° C.
  9. Preparar 50 mL de medio de disección.
    1. Añadir 2.25 mL de glucosa (200 mg/mL) a 47,05 mL de HBSS. Añadir 700 μl de 1 M HEPES con pH 7,4. Almacenar los medios de comunicación a 4 ° C.
  10. Preparar una solución PFA 4%.
    1. Disolver 20 g de PFA en 500 mL de PBS.
    2. Debajo de una campana química, calentar la solución a 60 ° C y añadir unas gotas de 1 M NaOH hasta que la solución sea clara.
    3. La solución a través de un filtro de papel del filtro y ajustar el pH a 7.2. Almacenar a-20 ° C.
      Nota: Alternativamente, otras soluciones comerciales de PFA pueden ser utilizados y diluidos al 4% en PBS.
  11. Limpiar las herramientas de disección como el fórceps, tijeras y silicona platos con etanol al 70% antes de su uso y con jabón y agua limpia después del uso.

2. poly-ornitina/laminina (Po/L) plato capa

Nota: Volúmenes están adaptados para cubrir una placa de 24 pozos.

  1. Si es necesario, poner un cubreobjetos estéril 12 m m en el pozo.
  2. Cubrir los pocillos con 500 μl de solución de μg/mL Poly-L-ornitina 10 disuelto en agua.
  3. Que los pozos reposar 1 h a temperatura ambiente.
  4. Retirar la solución de la polivinílico-L-ornitina y deje secar al aire durante 30 minutos.
  5. Cubrir los pocillos durante la noche a 37 ° C con 500 μl de 3 μg/mL laminina en bicarbonato L-15.
    Nota: Pozos pueden almacenarse a 37 ° C por 7 días en la incubadora. Para incubaciones largas, añadir PBS estéril entre los pocillos puede ayudar a evitar la evaporación media.

3. disección

  1. Sacrificar un ratón embarazado cuando los embriones están en fase embrionaria E12.5. Limpiar el vientre con etanol al 70%.
  2. El útero cortando los dos oviductos y la vagina y colocarlos en una placa de Petri con PBS frío (sin Ca2 + Mg2 +).
  3. Recoger todos los embriones y transferirlos al fresco, PBS frío (sin Ca2 + Mg2 +) en una placa Petri.
  4. Poner un embrión en un plato cubierto con silicona y lleno de medios de disección (con HBSS, glucosa de 4.5 g/L y 7 mM HEPES pH 7.4).
    Nota: Disección de embriones se realiza bajo el microscopio utilizando tijeras y pinzas limpias bien. Alternativamente, puede utilizarse un plato de Petri regular sin silicona para disección.
  5. Quitar la cabeza, cola y vísceras, con unas pinzas como tijeras.
  6. Mantener el embrión con el vientre contra la silicona con el fórceps.
  7. Con un segundo par de pinzas, inserte uno de los consejos en el canal central de la médula espinal rostral.
  8. Cerrar las pinzas para romper el tejido dorsal unos milímetros.
  9. Repetir esta operación hacia el lado caudal hasta la médula espinal entera (figura 1B).
  10. Separar la parte rostral de la médula espinal (tronco cerebral) del cuerpo.
  11. Gire el embrión para mantener la médula espinal abierta contra la silicona.
  12. Pellizque la parte rostral de la médula espinal y tirando la cabeza para extraer la médula espinal del embrión.
    Nota: Meninges y ganglios de raíz dorsal (GRD) deben permanecer pegados al embrión. De lo contrario, cuidadosamente separe cualquier resto de meninges y GRD todavía unido a la médula espinal. En este paso, GRD también se recaudaban para cultura sensible neurona (ver discusión).
  13. Aplanar la médula espinal en la silicona y sacar la mitad dorsal de la médula por el corte a lo largo de cada lado con un bisturí. Corte la parte media en 10 trozos con un bisturí y transferir las piezas a un tubo nuevo.

4. médula espinal células suspensión

  1. Repita este procedimiento de disección en médulas espinales de 6 a 8.
  2. Que la médula espinal recoge en la parte inferior del tubo y reemplazar la HBSS con 1 mL de medio de jamón-F10.
  3. Añadir 10 μl de la tripsina (2.5% p/v; 0.025% de concentración final). Incubar los tubos durante 10 min a 37 ° C.
  4. Para detener la digestión enzimática, transferencia de los fragmentos a un nuevo tubo de 15 mL que contiene 800 μl de medio completo L-15, 100 μl de 4% (w/v) BSA y 100 μl de DNasa (1 mg/mL en medio L-15).
  5. Triturate aspirando dos veces 1 mL con una pipeta P1000. Que los fragmentos reposar 2 minutos recoger el sobrenadante en un nuevo tubo 15 mL.
  6. A los fragmentos, agregar 900 μl de medio completo L-15, 100 μl de 4% (w/v) BSA y 100 μl de DNasa (1 mg/mL en medio L-15).
  7. Triturate 6 veces aspirando 1 mL con una pipeta P1000. Que los fragmentos reposar 2 minutos añadir el sobrenadante en el tubo de 15 mL obtenido en el paso 4.5.
  8. A los fragmentos, agregar 900 μl de medio completo L-15, 100 μl de 4% (w/v) BSA y 100 μl de DNasa (1 mg/mL en medio L-15).
  9. Triturate 10 veces por aspirar 1 mL con una pipeta P1000. Que los fragmentos reposar 2 minutos añadir el sobrenadante en el tubo de 15 mL obtenido en el paso 4.5. Proceder con el sobrenadante.
  10. Utilizando una pipeta P1000, Coloque suavemente un cojín de 4% (w/v) 2 mL BSA en la parte inferior del tubo flotante. Centrifugue a 470 x g durante 5 minutos.
  11. Quite el sobrenadante y resuspender el precipitado de células con 2 mL de medio completo L-15.

5. MN enriquecimiento por gradiente de densidad

  1. La suspensión de células se dividió en dos tubos de 15 mL (1 mL). Luego, agregar 2 mL de medio completo L-15. Si a partir de 6 embriones, utilizar el equivalente de 3 embriones por tubo en 3 mL de medio.
  2. Añadir 2 mL de solución de gradiente de densidad agregando lentamente la solución a la parte inferior de cada tubo para obtener una interfaz de sharp.
  3. Centrifugue a 830 x g durante 15 min a temperatura ambiente. Después de este paso, pequeñas células deben ser en la parte inferior del tubo, que conviene células grandes como MNs en la interfaz de media solución gradiente de densidad.
  4. Recoger las células en la interfase por aspiración 1 o 2 mL y transferir a un nuevo tubo 15 mL. Ajustar el volumen a 10 mL con medio de pH L-15.
  5. Añadir 2 mL de la almohadilla de BSA de 4% a los fondos del tubo y centrifugar a 470 x g durante 5 min a temperatura ambiente.
  6. Quite el sobrenadante y resuspender el precipitado en 3 mL de medio completo L-15.
  7. Repita el paso 5.5.
  8. Quite el sobrenadante y resuspender el precipitado de células en 2 mL de medio de cultivo completo. Cuenta el numero de celular y viabilidad bajo un microscopio de contraste de fase con un hemocitómetro.
    Nota: Para 6 cables de espinal, el número de células se espera que sea alrededor de 1 x 105 MNs.

6. MN cultura

  1. Diluir el MNs a la densidad adecuada, generalmente de 5.000 a 10.000 células en 500 μl de medio de cultivo por pozo en una placa de 24 pozos.
    Nota: Densidad de siembra es alrededor 1.500 y 30.000 células para placas de 6 y 96 pocillos, respectivamente.
  2. Retirar la solución de laminina con una P1000.
  3. Transferir inmediatamente el MNs diluidos en medio de cultivo en las placas de revestimiento para evitar que se sequen.
  4. Incubar el cultivo durante 2 días a 37 ° C.

7. Magnetofection de MNs

Nota: En los pasos siguientes, las cantidades utilizadas sirven para la transfección de un pozo de una placa de 24 pocillos. Consulte el protocolo del fabricante para otro formato.

  1. Para la preparación de ADN, resuspender 1 μg de ADN en 50 μl de medio de cultivo neuronal y de vortex durante 5 s.
  2. Para la preparación del tubo de grano, resuspender 1,5 μl de granos en 50 μl de medio de cultivo neuronal.
  3. Añadir la solución de grano 50 μl de la solución de ADN de 50 μl e incubar por 20 min a temperatura ambiente (volumen total = 100 μL).
  4. Durante la incubación, retirar 100 μl de medio de cultivo del pozo que se transfectadas.
    Nota: Coloque la placa magnética en la incubadora para calentar a 37 ° C.
  5. Transferir 100 μl de la mezcla de ADN/tira al pozo e incubar la placa 20-30 min en la placa magnética a 37 ° C.
  6. Espere al menos 24 h antes de la detección de la expresión de cDNA.

8. fijación y tinción

  1. Lave la cultura 2 veces con PBS.
  2. Incubar el cultivo por 20 min a temperatura ambiente en 4% PFA/PBS.
  3. Lave la cultura 2 veces con PBS.
  4. Incubar el cultivo en 500 μl de solución amortiguadora de bloqueo (PBS BSA 4%, 2% de suero normal, 0,3% Tritón X-100, 0,1 M glicina) por 1 h a temperatura ambiente.
    Nota: Suero Normal debe derivarse de la misma especie que el anticuerpo secundario (p. ej., suero de cabra Normal).
  5. Incubar el cultivo durante la noche a 4 ° C con anticuerpo primario diluido en 250 μl de solución amortiguadora de bloqueo.
    Nota: por ejemplo, TUJ1 se utiliza en 1/1000, SMI32 se utiliza en 1/1.000 y Lc3b se utiliza a 1/200.
  6. Lave la cultura 3 veces con PBS.
  7. Incubar el cultivo con anticuerpos secundarios conjugados fluoróforo diluidos en 250 μl de solución amortiguadora de bloqueo durante 1 hora a temperatura ambiente.
  8. Lave la cultura 3 veces con PBS.
  9. Montar en portaobjetos de vidrio con medio de montaje.

Resultados

Después de 24 horas en la cultura, motoneuronas (MNs) ya deben mostrar un crecimiento axonal importante (por lo menos 6 veces más que el tamaño del soma). En los días siguientes, axones deben seguir creciendo y la exhibición de ramificación (figura 2). Habrá diferentes morfologías debido a las especificidades del subtipo. Por ejemplo, media columna MNs que inervan los músculos axiales tienen axones más cortos y más ramificadas que columna lateral m...

Discusión

Uno de los puntos críticos de este protocolo es que se disecan los embriones de ratón en una ventana de tiempo preciso durante el desarrollo (E12.5) para optimizar la cantidad de MNs obtenida al final. Además, para un rendimiento óptimo, la disección debe realizarse por la mañana o temprano por la tarde. Antes de E12.5 (por ejemplo, en E11.5), la disección es difícil, especialmente con respecto a la eliminación de las meninges. Después de E12.5, el número de MNs obtenidas cae significativamente. Para ...

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Nos gustaría agradecer a la "Association pour le développement de la neurogénétique" para la beca Dr. Jacquier y AFM Telethon por su apoyo a través del plan estratégico MyoNeurAlp. También nos gustaría agradecer al Dr. Chris Henderson, Dr. William Camu, Dr. Brigitte Pettmann, Dr. Cedric Raoul y Dr. Georg Haase, que participaron en el desarrollo y mejora de la técnica y difundir sus conocimientos.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
Material
Silicone dissection dishLiving systems instrumentationDD-90-S-BLK-3PKSylgard
round coverslipNeuVitro, Knittel glassGG-12-Pre12 mm
Slide a Lyzer cassettesThermoFisher Scientific6603020,000 MWCO ; 30 mL
Filter unitMilliporeSCGVU02RE
GP Sterile Syringe FiltersMilliporeSLGP033RS
4 well plateThermoFisher Scientific167063Nunclon Delta treated plate
forcepsFST by Dumont11252-20#5 forceps
scissorFST by Dumont14060-10fine scissors
scalpelFST by Dumont10035-20curved blade
scalpelFST by Dumont10316-14micro-knife scalpel
Petri dishGreiner663102ø x h = 100 x 15 mm
15 mL polypropylene tubeFalcon352096
filter paperWatman1001125circle, 125 mm diameter
glass chamber slideLab-Tek1545264 chambers
Plasmid pCAGENAddgene#11160
NameCompanyCatalog NumberComments
Solutions and mediums
Bovine serum albuminSigma-AldrichA9418
L-15 mediumThermoFisher Scientific11415056
L-15 medium, no red phenolThermoFisher Scientific21083027
InsulinSigma-AldrichI6634
PutrescineSigma-AldrichP5780
ConalbuminSigma-AldrichC7786
Sodium seleniteSigma-AldrichS5261
ProgesteroneSigma-AldrichP8783
Poly-DL-OrnithineSigma-AldrichP8638
LamininSigma-AldrichL2020
trypsin 2.5%, 10xThermoFisher Scientific15090046
DNAseSigma-AldrichDN25
PBS w/o Ca MgThermoFisher Scientific14190144without Mg2+ Ca2+
sodium bicarbonateThermoFisher Scientific25080094
Neuron cell culture mediumThermoFisher ScientificA3582901Neurobasal Plus medium
HBSSSigma-AldrichH6648-500ML
HEPES buffer 1 MThermoFisher Scientific15630056
Density gradiant mediumSigma-AldrichD1556Optiprep
supplement mediumThermoFisher ScientificA3582801B-27 Plus
Horse serum heat inactivatedThermoFisher Scientific26050-088
L-Glutamine 200 mMThermoFisher Scientific25030024
2-mercaptoethanolThermoFisher Scientific31350010
penicilline/streptomycineThermoFisher Scientific1514012210,000 U/mL
NameCompanyCatalog NumberComments
Immuno fluorescence
PBS, 10xThermoFisher ScientificX0515without Mg2+ Ca2+
Paraformaldehyde (PFA)Sigma-Aldrich441244
normal goat serumSigma-AldrichG6767
glycineSigma-AldrichG7126
Triton X-100Sigma-AldrichT8787
Choline Acetyl Transferase (CHAT)ChemiconAb144P
Neurofilament H non phosphorylated (SMI32)BiolegendsSMI-32PIF at 1/1000
Islet-1DSHB40.2D6
Islet-2DSHB39.4D5
Hb9DSHB81.5C10
Vectashield mounting mediumVector LabH-1000
Beta3 tubulin (Tuj1 clone)Biolegends801201IF at 1/1000
Lc3bCell Signaling Technology#2775IF at 1/200

Referencias

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