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Resumo

O objetivo desta técnica é preparar uma cultura altamente enriquecida de motoneurônios primários (MNs) de murino da medula espinhal. Para avaliar as consequências das mutações causadoras de doenças MN, descrevemos aqui o isolamento destes isolados MNs e seu transfeccao por magnetofection.

Resumo

Neurodegeneração de motoneurônios da coluna vertebral (MNs) está implicada em um grande espectro de doenças neurológicas, incluindo a esclerose lateral amiotrófica, doença de Charcot-Marie-Tooth e atrofia muscular espinhal, que são todos associados com atrofia muscular. Culturas primárias de MNs espinhais têm sido usadas amplamente para demonstrar o envolvimento de genes específicos em tais doenças e caracterizar as consequências celulares de suas mutações. Esta cultura de modelos um primário MN protocolo derivada do trabalho seminal de Henderson e colegas há mais de vinte anos. Primeiro, detalhamos um método de dissecar os cornos anteriores da medula espinhal de um embrião de rato e isolando os MNs de vizinhas células usando um gradiente de densidade. Em seguida, apresentamos uma nova forma de forma eficiente transfecting MNs com plasmídeo de expressão usando magnetofection. Finalmente, ilustramos como corrigir e delgados primário que MNS. usando mutações de Neurofilamento que causam a doença de Charcot-Marie-Tooth tipo 2, este protocolo demonstra uma abordagem qualitativa para expressar proteínas de interesse e estudar o seu envolvimento em Crescimento de MN, manutenção e sobrevivência.

Introdução

Doenças neuromusculares englobam uma variedade de patologias clinicamente e geneticamente distintas que caracterizam-se pela alteração do músculo e/ou o sistema nervoso. Devido aos avanços nas tecnologias de sequenciamento, centenas de genes responsáveis por estas doenças raras foram identificadas durante a última década (lista disponível no centro de doença Neuromuscular, http://neuromuscular.wustl.edu/index.html). A variedade de mutações identificadas indica que diferentes mutações em um único gene podem causar diferentes fenótipos e doenças1,2,3 e que mutações em genes diferentes podem produzir fenótipos similares 4 , 5. neste contexto, há esforços para desenvolver modelos de celulares que podem se tornar poderosas ferramentas para analisar as consequências de mutação e mecanismos patológicos.

MNs espinhais tem grandes somas localizados nos cornos ventrais da medula espinhal, axônios longos de formulário de fibras musculares esqueléticas de destino e permitir movimentos voluntários através da liberação de acetilcolina na junção neuromuscular. Desde MNs são afetados por doenças neuromusculares como esclerose lateral amiotrófica, doença de Charcot-Marie-Tooth (CMT), e atrofia muscular espinhal, Dr. Henderson e colegas desenvolveram o primeiro protocolo6 permitidos para cultivo de in vitro MNs da coluna vertebral e a descoberta de neurotrophic factor GDNF7 (fator neurotrófico derivado de célula glial). Refinamentos técnicos desde então têm permitido para purificação mais precisa de MNs da coluna vertebral e seus subtipos usando FACS8, mas o enriquecimento por gradiente de densidade permanece poderosa e amplamente utilizado em laboratórios, atualmente trabalhando com MNs espinhais primários 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14. posteriormente, também é possível obter um maior grau de purificação MN através de immunopanning, tirando proveito do marcador de superfície p75(NTR)15,16,17.

A medula espinhal contém diferentes subtipos de MNs cervicais, torácicas e lombares, bem como medianos e laterais motor as colunas que diferem entre sua localização no Corno anterior em um eixo dorso-ventral e entre os alvos que eles inervam8, 18. culturas primárias MN podem recuperar todos esses subtipos de MN em proporções fisiológicas. A principal limitação dessa técnica é o baixo número de MNs obtidos ao final do procedimento; na verdade, pode presumir-se obter em torno de 105 MNs de seis embriões, que é apropriada para a microscopia, mas limitando para experimentos de bioquímica. A realizar experimentos com mais padronizados subtipos e MNs abundantes (> 106 células), embrionárias MNs de células-tronco derivadas devem ser considerados18.

Transfection do selvagem-tipo/mutante transgenes ou knockdown genes endógenos em MNs primários é uma ferramenta rápida e útil para decifrar vias fisiopatológicas, especialmente quando modelos de rato não estão disponíveis. Magnetofection é uma técnica para transfecting os neurônios primários, semelhantes ao lipofection sem a neurotoxicidade relacionada. Além disso, transfecção pode ser executada em neurônios maduros depois de vários dias em vitro, ao contrário de técnicas baseadas em electroporation9. No entanto, uma desvantagem dessa técnica é que os grânulos ligam a ácidos nucleicos na cultura, causando barulho na rotulagem de DAPI. Infecção viral é provavelmente a técnica mais eficiente para MNs transfecting; no entanto, magnetofection não requer determinados procedimentos de segurança necessários para a produção viral e infecção celular.

Protocolo

Todos os procedimentos que envolvam animais foram aceites pelo Comité de ético da instituição.

1. preparação da solução

  1. Prepare-se 10 mL de 4% de que BSA diálise no meio de L-15.
    1. Dissolva o pó de albumina de soro bovino em 4% (p/v) em 10 mL de meio de L-15.
    2. Adicione a solução para uma gaveta de diálise de 20 mL com um disco de corte 20 kDa. Dialize contra 500 mL do meio de L-15 por 3 dias sob agitação a 4 ° C. Altere o meio de L-15 todos os dias.
    3. Filtre a solução através de um 0,22 µm membrana e alíquota em tubos de 15 mL. Armazenar os tubos a-20 ° C.
      Nota: Este protocolo utiliza as seguintes referências: cru sem modificações L-15 médio = L-15 médio, meio ácido L-15 = pH L-15 e meio L-15 básico = bicarbonato L-15.
  2. Prepare 200 mL de pH L-15.
    1. Ajustar o pH do meio L-15: primeiro, encha um frasco de lavagem com alguns pedaços de gelo seco. Injetar gás (CO2) no meio de L-15, até que a cor se laranja (~ pressões pH 6,4 e ~ 40). O pH pode também ser ajustado com um medidor de pH padrão.
    2. Filtro de médio porte e um 0,22 µm membrana e loja a 4 ° C por um mês.
  3. Prepare 100 mL de bicarbonato de L-15.
    1. Adicionar 2,5 mL de bicarbonato de sódio de 7% a 97,5 mL do meio de L-15 e armazenar a 4 ° C.
  4. Prepare os suplementos de IPCS (Selenito de Conalbumin de Putrescin de insulina).
    1. Dissolva 2,5 mg de insulina em 0,5 mL de 0.1 M HCl. Add 4,5 mL de água bidestilada.
    2. Dissolva 8 mg de putrescina em 5 mL de tampão fosfato salino (PBS).
    3. Dissolva 100 mg de conalbumin em 10 mL de PBS.
    4. Dissolver 1 mg de Selenito de sódio em 19,3 mL de água, ajustar o pH para 7,4 e diluir a solução 10-fold.
    5. Combinam-se 1 mL de solução de insulina, 1ml de solução de putrescina, 1 mL de conalbumin e 0,1 mL de solução de Selenito de sódio para obter 3,1 mL da solução de suplemento de IPCS. Armazenar a solução a-20 ° C.
  5. Prepare uma solução de progesterona de 0,02 mM.
    1. Dissolva 1 mg de progesterona em 1,6 mL de etanol a 80%.
    2. Diluir a solução 100 vezes em 100% de etanol e armazená-lo a-20 ° C.
  6. Prepare 100 mL de meio de L-15 completo.
    1. Adicione 1,8 mL de solução de D-glicose (200 mg/mL) para 92 mL de pH L-15 para obter uma concentração final de 3,5 mg/mL de glicose.
    2. Combinar a 1 mL de 100 x penicilina-estreptomicina (10.000 U/mL), 2 mL de soro de cavalo inactivados por calor, 3,1 mL da mistura IPCS e 0,1 mL de solução de progesterona (2 x 10-5 M).
    3. Filtrar o meio numa membrana de 0,22 µm e armazená-lo em 4 ° C.
  7. Prepare-se 5 mL da solução de gradiente de densidade (concentração final de 5,5%) por experiência.
    1. Adicionar 476 µ l do meio gradiente de densidade 60% comercial 4524 µ l de L-15 (se possível, sem fenol vermelho para aumentar o contraste visual no período do intérfase; razão de diluição de 1:10. 5).
    2. Armazenar a solução a 4 ° C por 2 semanas ou congelar a-20 ° C.
  8. Prepare-se 10 mL de meio de cultura.
    1. Adicione 200 µ l de meio de suplemento de 9,6 mL de meio de cultura celular de neurônio.
    2. Adicione 200 µ l de soro de cavalo inactivadas pelo calor (que tende a diferenciar a célula glial precursores e obras contra proliferação) de 25 µ l de glutamina e 10 µ l de 2-Mercaptoetanol.
    3. Os meios de filtro através de um filtro de 0,22 µm.
    4. Adicionar os seguintes fatores neurotróficos: fator neurotrófico ciliar (CNTF) em uma concentração final de 10 ng/mL e fator de neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) e células gliais derivada o fator neurotrophic (GDNF) em concentrações finais de 1 ng/mL.
    5. Armazenar a mídia a 4 ° C.
  9. Prepare 50 mL de mídia de dissecação.
    1. Adicionem 47,05 mL de HBSS 2,25 mL de glicose (200 mg/mL). Adicione 700 µ l de 1m HEPES pH 7,4. Armazenar a mídia a 4 ° C.
  10. Prepare uma solução PFA 4%.
    1. Dissolva 20 g de PFA em 500 mL de PBS.
    2. Sob uma capa de química, aquecer a solução a 60 ° C e adicionar algumas gotas de 1 M de NaOH até que a solução torna-se claro.
    3. Filtrar a solução através de um filtro de papel e ajustar o pH para 7.2. Armazená-lo a-20 ° C.
      Nota: Como alternativa, outras soluções comerciais de PFA podem ser usadas e diluídas a 4% em PBS.
  11. Limpar as ferramentas de dissecação, incluindo a pinça, tesoura e pratos do silicone com etanol a 70% antes do uso e com sabão e água limpa após o uso.

2. revestimento do prato poli-ornitina/laminina (Po/L)

Nota: Volumes são adaptados para revestir uma placa de 24.

  1. Se necessário, colocar uma lamela de 12mm estéril no poço.
  2. Revestimento de poços com 500 µ l de 10 µ g/mL poli-L-ornitina solução dissolvida em água.
  3. Deixe os poços contentar 1h à temperatura ambiente.
  4. Remover a solução de poli-L-ornitina e secar ao ar durante 30 min.
  5. Revestimento dos poços durante a noite a 37 ° C, com 500 µ l de 3 µ g/mL laminina em bicarbonato L-15.
    Nota: Poços podem ser armazenados a 37 ° C por 7 dias na incubadora. Para incubação do tempo, adicionar PBS estéril entre os poços pode ajudar a evitar a evaporação média.

3. dissecação

  1. Sacrifica um rato grávido quando os embriões estão em fase embrionária, E12.5. Limpe a barriga com etanol a 70%.
  2. Remover o útero cortando os dois ovidutos e o vagina e colocá-lo em uma placa de Petri preenchida com PBS frio (sem o Ca2 + Mg2 +).
  3. Coletar todos os embriões e transferí-los para fresco, frio PBS (sem o Ca2 + Mg2 +) em uma placa de Petri.
  4. Coloque um embrião em um prato cheio de mídia de dissecação (com HBSS, glicose de 4,5 g/L e 7 mM HEPES pH 7,4) e revestido com silicone.
    Nota: Dissecação do embrião é realizada sob um microscópio usando uma tesoura e pinça limpa bem. Como alternativa, um prato de Petri regular sem silicone pode ser usado para dissecação.
  5. Retire a cabeça, cauda e vísceras, usando fórceps como tesouras.
  6. Manter o embrião com a barriga contra o silicone com fórceps.
  7. Com um segundo par de pinças, insira uma das pontas do canal central da medula espinhal rostral.
  8. Feche a pinça para rasgar o tecido dorsal alguns milímetros.
  9. Repita esta operação em direção ao lado caudal até a medula espinhal inteira está aberta (figura 1B).
  10. Retire a parte rostral da medula espinhal (tronco cerebral) do corpo.
  11. Vire o embrião para manter a medula espinhal aberta contra o silicone.
  12. Aperte a parte rostral da medula espinhal... e puxe o embrião pela cabeça para extrair a medula espinhal.
    Nota: Meninges e gânglios da raiz dorsal (DRGs) devem permanecer anexados para o embrião. Caso contrário, cuidadosamente afastar qualquer restantes meninges e DRGs ainda presas à medula espinhal. Neste passo, DRGs também poderiam ser coletadas para cultura de neurônio sensíveis (ver discussão).
  13. Achate a medula espinhal em silicone e remover a metade dorsal da medula por corte ao longo do meio de cada lado usando um bisturi. Corte a parte do meio em 10 pedaços usando um bisturi e transferir as peças para um novo tubo.

4. suspensão de células de medula de

  1. Repita este procedimento de dissecação para 6 a 8 espinais.
  2. Deixa a medula espinhal peças coletar no fundo do tubo e substituir o HBSS com 1 mL de meio de presunto-F10.
  3. Adicione 10 µ l de tripsina (2,5% p/v; concentração final 0.025%). Incubar o tubo durante 10 minutos a 37 ° C.
  4. Para parar a digestão enzimática, transferi os fragmentos para um novo tubo de 15 mL contendo 800 µ l de meio L-15 completo, 100 µ l de 4% (p/v) BSA e 100 µ l de DNase (1 mg/mL em meio de L-15).
  5. Triture duas vezes por aspirar 1 mL com uma pipeta P1000. Deixe os fragmentos se contentar com 2 min. recolher o sobrenadante em um tubo 15 mL.
  6. Aos fragmentos, adicione 900 µ l de meio L-15 completo, 100 µ l de 4% (p/v) BSA e 100 µ l de DNase (1 mg/mL em meio de L-15).
  7. Triture 6 vezes por aspirar 1 mL com uma pipeta P1000. Deixe os fragmentos se contentar com 2 min. Adicionar o sobrenadante no tubo de 15 mL obtido na etapa 4.5.
  8. Aos fragmentos, adicione 900 µ l de meio L-15 completo, 100 µ l de 4% (p/v) BSA e 100 µ l de DNase (1 mg/mL em meio de L-15).
  9. Triture 10 vezes por aspirar 1 mL com uma pipeta P1000. Deixe os fragmentos se contentar com 2 min. Adicionar o sobrenadante no tubo de 15 mL obtido na etapa 4.5. Prossiga com o sobrenadante.
  10. Usando uma pipeta P1000, coloque delicadamente um coxim de 4% (p/v) 2 mL BSA na parte inferior do tubo de sobrenadante. Centrifugar a 470 x g durante 5 min.
  11. Remover o sobrenadante e ressuspender as células com 2 mL de meio de L-15 completo.

5. MN enriquecimento pela densidade gradiente

  1. Dividi a suspensão de células em dois tubos de 15 mL (1 mL cada uma). Em seguida, adicione 2 mL de meio de L-15 completo. Se começar com 6 embriões, uso o equivalente a 3 embriões pelo tubo em 3 mL de meio.
  2. Adicione 2 mL de solução de gradiente de densidade adicionando lentamente a solução no fundo de cada tubo para obter uma interface afiada.
  3. Centrifugar a 830 x g durante 15 minutos à temperatura ambiente. Após esta etapa, pequenas células devem ser na parte inferior do tubo, que convém células grandes como MNs na interface de solução/médio gradiente de densidade.
  4. Coletar as células na interface por aspiração 1 ou 2 mL e transfira para um tubo 15 mL. Ajuste o volume para 10ml com médias de pH L-15.
  5. Adicione 2 mL da almofada da BSA 4% para o fundo do tubo e centrifugar 470 x g por 5 min à temperatura ambiente.
  6. Remover o sobrenadante e ressuspender o precipitado em 3 mL de meio de L-15 completo.
  7. Repita a etapa 5.5.
  8. Remover o sobrenadante e ressuspender as células em 2 mL de meio de cultura completo. Conte o número de telemóvel e viabilidade sob um microscópio de contraste de fase com um hemocytometer.
    Nota: Para 6 espinais, o número de células está previsto para ser em torno de 1 x 105 MNs.

6. MN cultura

  1. Dilua os MNs para a densidade adequada, normalmente de 5.000 a 10.000 células em 500 µ l do meio de cultura por bem em uma placa de 24.
    Nota: Densidade de semeadura é em torno de 30.000 e 1.500 células para placas de 96 e 6 --bem, respectivamente.
  2. Remova a solução de laminina com um P1000.
  3. Transferi imediatamente os MNs diluídos em meio de cultura para as placas de revestimento para evitar a secagem.
  4. Incubar a cultura 2 dias a 37 ° C.

7. Magnetofection de MNs

Nota: Nas etapas a seguir, as quantidades utilizadas são destinadas o transfeccao de um poço de uma placa de 24. Refira por favor o protocolo do fabricante para outro formato.

  1. Para a preparação de DNA, resuspenda 1 µ g/ml de DNA 50 µ l de meio de cultura neuronal e vórtice para 5 s.
  2. Para a preparação do tubo do grânulo, resuspenda 1,5 µ l de grânulos em 50 µ l de meio de cultura neuronal.
  3. Adicionar a solução de grânulo de 50 µ l da solução de DNA de 50 µ l e incubar durante 20 min em temperatura ambiente (total volume = 100 µ l).
  4. Durante esta incubação, retire o poço que será transfected em 100 µ l de meio de cultura.
    Nota: Colocar a placa magnética na incubadora para aquecê-lo a 37 ° C.
  5. Transferir 100 µ l do mix DNA/pérola para o poço e incubar a placa de 20 a 30 min na placa magnética a 37 ° C.
  6. Espere pelo menos 24 h antes da detecção da expressão do cDNA.

8. fixação e coloração

  1. Lave a cultura 2 vezes com PBS.
  2. Incubar a cultura por 20 min em temperatura ambiente em 4% PFA/PBS.
  3. Lave a cultura 2 vezes com PBS.
  4. Incube a cultura em 500 µ l de tampão de bloqueio (PBS, BSA 4%, 2% de soro normal, 0,3% Triton X-100, glicina 0,1 M) por 1h à temperatura ambiente.
    Nota: Soro Normal deve ser proveniente da mesma espécie que o anticorpo secundário (por exemplo, soro de cabra Normal).
  5. Incube a cultura durante a noite a 4 ° C com anticorpo primário diluído em 250 µ l de tampão de bloqueio.
    Nota: por exemplo, TUJ1 é usado em 1/1000, SMI32 é usado em 1/1.000 e Lc3b é usado em 1/200.
  6. Lave a cultura 3 vezes com PBS.
  7. Incube a cultura com anticorpos secundarios conjugados fluoróforo diluídos em 250 µ l de tampão de bloqueio por 1 hora em temperatura ambiente.
  8. Lave a cultura 3 vezes com PBS.
  9. Montagem em lâminas de vidro usando o meio de montagem.

Resultados

Depois de 24 horas na cultura, motoneurônios (MNs) já devem mostrar significativo crescimento axonal (pelo menos 6 vezes mais do que o tamanho da soma). Nos dias seguintes, axônios devem continuar a crescer e exibir ramificação (Figura 2). Vai haver diferentes morfologias devido às especificidades do subtipo. Por exemplo, coluna mediana MNs que inervam músculos axiais têm axônios mais curtos e mais ramificados do que a coluna lateral motor MNs que in...

Discussão

Um dos pontos críticos no presente protocolo é que os embriões de rato são dissecados em uma janela de tempo preciso durante o desenvolvimento (E12.5) para otimizar a quantidade de MNs obtidos no final. Além disso, para um rendimento ideal, a dissecação deve ser realizada pela manhã ou no início da tarde. Antes de E12.5 (por exemplo, em E11.5), a dissecação é difícil, principalmente no que tange a eliminação das meninges. Depois de E12.5, o número de MNs obtidos cai significativamente. Para contr...

Divulgações

Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

Gostaríamos de agradecer a "Association pour le développement de la neurogénétique" para comunhão e AFM-Teleton do Dr. Jacquier seu apoio através do plano estratégico de MyoNeurAlp. Também gostaríamos de agradecer o Dr. Chris Henderson, Dr. William Camu, Dr. Brigitte Pettmann, Dr. Cedric Raoul e Dr. Georg Haase, que participaram de desenvolver e melhorar a técnica e difundir seus conhecimentos.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
Material
Silicone dissection dishLiving systems instrumentationDD-90-S-BLK-3PKSylgard
round coverslipNeuVitro, Knittel glassGG-12-Pre12 mm
Slide a Lyzer cassettesThermoFisher Scientific6603020,000 MWCO ; 30 mL
Filter unitMilliporeSCGVU02RE
GP Sterile Syringe FiltersMilliporeSLGP033RS
4 well plateThermoFisher Scientific167063Nunclon Delta treated plate
forcepsFST by Dumont11252-20#5 forceps
scissorFST by Dumont14060-10fine scissors
scalpelFST by Dumont10035-20curved blade
scalpelFST by Dumont10316-14micro-knife scalpel
Petri dishGreiner663102ø x h = 100 x 15 mm
15 mL polypropylene tubeFalcon352096
filter paperWatman1001125circle, 125 mm diameter
glass chamber slideLab-Tek1545264 chambers
Plasmid pCAGENAddgene#11160
NameCompanyCatalog NumberComments
Solutions and mediums
Bovine serum albuminSigma-AldrichA9418
L-15 mediumThermoFisher Scientific11415056
L-15 medium, no red phenolThermoFisher Scientific21083027
InsulinSigma-AldrichI6634
PutrescineSigma-AldrichP5780
ConalbuminSigma-AldrichC7786
Sodium seleniteSigma-AldrichS5261
ProgesteroneSigma-AldrichP8783
Poly-DL-OrnithineSigma-AldrichP8638
LamininSigma-AldrichL2020
trypsin 2.5%, 10xThermoFisher Scientific15090046
DNAseSigma-AldrichDN25
PBS w/o Ca MgThermoFisher Scientific14190144without Mg2+ Ca2+
sodium bicarbonateThermoFisher Scientific25080094
Neuron cell culture mediumThermoFisher ScientificA3582901Neurobasal Plus medium
HBSSSigma-AldrichH6648-500ML
HEPES buffer 1 MThermoFisher Scientific15630056
Density gradiant mediumSigma-AldrichD1556Optiprep
supplement mediumThermoFisher ScientificA3582801B-27 Plus
Horse serum heat inactivatedThermoFisher Scientific26050-088
L-Glutamine 200 mMThermoFisher Scientific25030024
2-mercaptoethanolThermoFisher Scientific31350010
penicilline/streptomycineThermoFisher Scientific1514012210,000 U/mL
NameCompanyCatalog NumberComments
Immuno fluorescence
PBS, 10xThermoFisher ScientificX0515without Mg2+ Ca2+
Paraformaldehyde (PFA)Sigma-Aldrich441244
normal goat serumSigma-AldrichG6767
glycineSigma-AldrichG7126
Triton X-100Sigma-AldrichT8787
Choline Acetyl Transferase (CHAT)ChemiconAb144P
Neurofilament H non phosphorylated (SMI32)BiolegendsSMI-32PIF at 1/1000
Islet-1DSHB40.2D6
Islet-2DSHB39.4D5
Hb9DSHB81.5C10
Vectashield mounting mediumVector LabH-1000
Beta3 tubulin (Tuj1 clone)Biolegends801201IF at 1/1000
Lc3bCell Signaling Technology#2775IF at 1/200

Referências

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