JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Цель этой методики – подготовить высокообогащенного культуры первичной мотонейронов (MNs) из мышиных спинного мозга. Чтобы оценить последствия мутации, вызывая заболевания MN, мы опишем здесь изоляции эти изолированные MNs и их transfection magnetofection.

Аннотация

Нейродегенеративные мотонейронов спинного мозга (MNs) причастны широкого спектра неврологических расстройств, включая боковой амиотрофический склероз, болезнь Шарко-Мари-зуб и спинальной мышечной атрофии, которые все связаны с мышечной атрофии. Основной культуры позвоночника МНБ использовали широко продемонстрировать участие конкретных генов в таких заболеваний и характеризуют сотовой последствия их мутаций. Эта культура модели первичной MN протокол производным от семенных работы Хендерсон и коллег более двадцати лет назад. Во-первых мы подробно метод рассечения передней рогах спинного мозга от зародыша мыши и изолировать MNs из соседних клеток, с использованием градиента плотности. Затем мы представляем новый способ эффективно transfecting MNs с плазмид выражение, с помощью magnetofection. Наконец мы показываем, как исправить и имунноконтраст первичной MNs. Использование neurofilament мутации, которые вызывают болезнь Шарко-Мари-зуб типа 2, этот протокол свидетельствует качественный подход к выражением протеинов интереса и изучение их участие в MN роста, техническое обслуживание и выживания.

Введение

Нервно-мышечные заболевания охватывают разнообразные клинически и генетически различных патологий, которые характеризуются изменения мышц и нервной системы. Из-за достижения в области технологий виртуализации, сотни генов, ответственных за эти редкие заболевания были выявлены в ходе последнего десятилетия (список доступных в центре нейромышечные болезнь, http://neuromuscular.wustl.edu/index.html). Разнообразие выявленных мутаций указывает, что различные мутации одного гена может привести к разному фенотипы и болезней1,2,3 и что мутации в различных генов может производить аналогичные фенотипов 4 , 5. в этом контексте, являются усилия по развитию сотовой модели, которые могут стать мощные инструменты для анализа последствий мутации и патологических механизмов.

Позвоночника MNs имеют большие СОСМ, расположенный в вентральной рогов спинного мозга, длинные аксоны форме скелетных мышечных волокон, и позволяют добровольных движений через освобождение ацетилхолина в нервно-мышечных соединениях. Так как MNs страдают от нервно-мышечных заболеваний, таких как боковой амиотрофический склероз, болезнь Шарко-Мари-зуб (CMT), и спинальной мышечной атрофии, д-р Хендерсон и коллеги разработали первый протокол6 , что позволило для выращивания в пробирке позвоночника MNs и открытие нейротрофических факторов GDNF7 (глиальных клеток производных нейротрофических факторов). Технические усовершенствования тех пор позволило для более точной очистки позвоночника MNs и их подтипы, использование СУИМ8, но обогащения градиент плотности остается мощным и широко используется в лабораториях, в настоящее время работает с основной позвоночника МНБ 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14. Впоследствии, это также возможно для получения более высокого класса очистки MN через immunopanning, воспользовавшись поверхности маркер p75(НТР)15,16,17.

Спинной мозг содержит различные подтипы шейного, грудного и поясничного отдела МНБ, а также средний и боковые мотор столбцы, которые отличаются среди их расположение в передней рога на оси dorso вентральной и среди целей они иннервируют8, 18. основной MN культур можно восстановить все эти подтипы MN в физиологических пропорциях. Основным ограничением этой методики является низкое количество МНБ, полученные в конце процедуры; в самом деле можно ожидать, чтобы получить около 105 MNs из шести эмбрионов, которая подходит для микроскопии, но ограничения для биохимии экспериментов. Для выполнения экспериментов с более стандартизированной подтипы и обильные MNs (> 106 клеток), эмбриональных стволовых клеток, полученных MNs следует рассматривать18.

Трансфекция диких тип/мутант трансгенов или эндогенных генов нокдаун в первичной MNs является быстрый и полезный инструмент для расшифровки выкидышей пути, особенно когда мышь модели недоступны. Magnetofection является методика transfecting первичной нейронов, похож на липофекция без соответствующих нейротоксичности. Кроме того transfection может выполняться на зрелых нейронов после нескольких дней в пробирке, в отличие от методов, основанных на электропорации9. Однако один из недостатков этого метода является бисер привязать нуклеиновых кислот в культуре, вызывая шум в маркировке DAPI. Вирусная инфекция, вероятно, наиболее эффективным методом для transfecting МНС; Однако magnetofection не требует определенных процедур обеспечения безопасности, необходимые для вирусных производства и клеточных инфекции.

протокол

Все процедуры с участием животных были приняты этического комитета учреждения.

1. решение подготовка

  1. Подготовка 10 мл 4% BSA dialyzed в L-15 среде.
    1. Альбумина bovine сыворотки порошок на 4% (w/v) растворяют в 10 мл L-15 среды.
    2. Добавьте решение в 20 мл диализа кассету с 20 кДа отсечения. Dialyze против 500 мл L-15 среды для 3 дней при агитации на 4 ° C. Изменение среднего L-15 каждый день.
    3. Фильтр решение через 0,22 мкм мембраны и Алиготе в 15 мл пробирок. Хранить трубы при-20 ° C.
      Примечание: Этот протокол использует следующие ссылки: неизмененном сырья среднего L-15 = Средний L-15, кислой среде L-15 = pH L-15 и основные L-15 Средний = бикарбоната L-15.
  2. Подготовка 200 мл рН L-15.
    1. Отрегулируйте рН среды L-15: во-первых, заполнить мыть бутылку с некоторыми частями сухого льда. Придать L-15 среднего газа (CO2), до тех пор, пока цвет превращает оранжевый (~ давления pH 6.4 и ~ 40). PH можно также отрегулировать с стандартный pH метр.
    2. Фильтр средних 0,22 мкм мембраны и хранить при 4 ° C на один месяц.
  3. Подготовка 100 мл L-15 бикарбоната.
    1. Добавьте 2.5 мл 7% бикарбоната натрия 97,5 мл L-15 среды и хранить при 4 ° C.
  4. Подготовьте МПХБ (инсулин Putrescin Conalbumin селенит) добавки.
    1. Растворите 2,5 мг инсулина в 0,5 мл 0,1 М HCl. добавить 4,5 мл двойной дистиллированной воды.
    2. Растворите 8 мг путресцин в 5 мл физиологического раствора фосфатного буфера (PBS).
    3. Растворите 100 мг conalbumin в 10 мл ФСБ.
    4. Растворить 1 мг натрия селенит в 19,3 мл воды, скорректировать рН 7,4 и разбавить раствор 10 раз.
    5. 1 мл раствора инсулина, 1 мл раствора путресцин, 1 мл conalbumin и 0,1 мл раствора натрия селенит для получения 3.1 мл раствора дополнение МПХБ объединяйте. Хранят раствор при температуре-20 ° C.
  5. Приготовляют раствор прогестерона 0,02 мм.
    1. Растворите 1 мг прогестерона в 1,6 мл 80% этанола.
    2. Разбавить раствор 100-кратного в 100% этанола и хранить его при-20 ° C.
  6. Подготовка 100 мл полного среднего L-15.
    1. Добавьте 1.8 мл раствора D-глюкозы (200 мг/мл) 92 мл рН L-15 для получения окончательного концентрация составляет 3,5 мг/мл глюкозы.
    2. Объединить 1 мл 100 x пенициллин-стрептомицином (10000 ед/мл), 2 мл сыворотки тепла инактивированная лошадь, 3.1 мл смеси МПХБ и 0,1 мл раствора прогестерона (2 x 10-5 М).
    3. Фильтр средство на 0,22 мкм мембраны и хранить при 4 ° C.
  7. Подготовьте 5 мл раствора (конечная концентрация 5,5%) плотность градиента в эксперимент.
    1. 476 мкл коммерческой среды градиента 60% плотность 4524 мкл L-15 (если это возможно, без красных фенола увеличить визуальный контраст в интерфазе; коэффициент разрежения 1:10. 5).
    2. Хранят раствор при температуре 4 ° C на 2 недели или заморозить его при-20 ° C.
  8. Подготовка 10 мл культуры средств массовой информации.
    1. Добавьте 200 мкл дополнения средних 9,6 мл среды культуры клетки нейрона.
    2. Добавьте 200 мкл тепла инактивированная лошадь сыворотки (которая стремится дифференцировать глиальных клеток прекурсоров и работает против распространения) 25 мкл глутамина и 10 мкл 2-меркаптоэтанол.
    3. Фильтр СМИ через фильтр 0,22 мкм.
    4. Добавьте следующие нейротрофических факторов: цилиарной нейротрофических факторов (CNTF) в конечной концентрации 10 нг/мл и мозг производных нейротрофических фактора (BDNF) и фактор производных нейротрофических глиальных клеток (GDNF) на окончательный концентрации 1 нг/мл.
    5. Хранить при 4 ° C.
  9. Подготовка 50 мл рассечение средств массовой информации.
    1. Добавление 47.05 мл HBSS 2,25 мл глюкозы (200 мг/мл). 700 мкл 1 м HEPES с рН 7,4. Хранить при 4 ° C.
  10. Приготовляют раствор 4% PFA.
    1. Растворяют 20 g ПФА в 500 мл ФСБ.
    2. Под капотом химического тепло раствора до 60 ° C и добавить несколько капель 1 M NaOH до тех пор, пока решение становится ясно.
    3. Фильтр решение через фильтровальную бумагу и скорректировать рН 7,2. Хранить при температуре от-20 ° C.
      Примечание: в качестве альтернативы, другие коммерческие решения PFA может использоваться и разбавляют до 4% в PBS.
  11. Очистите инструменты рассечение, включая щипцы, ножницы и силиконовые блюда с 70% этанол перед использованием и с мылом и чистой водой после использования.

2. поли орнитина/Ламинин (Po/Л) блюдо покрытие

Примечание: Объемы адаптированы к Пальто плиты 24-хорошо.

  1. При необходимости, положите стерильные 12 мм coverslip в скважине.
  2. Герб скважин с 500 мкл раствора 10 мкг/мл поли-L-орнитин, растворенных в воде.
  3. Пусть скважин довольствуйтесь 1 ч при комнатной температуре.
  4. Удаление решения поли-L-орнитин и просушите на 30 мин.
  5. Герб скважин на ночь при 37 ° C с 500 мкл 3 мкг/мл Ламинин в бикарбонат L-15.
    Примечание: Скважины может храниться при 37 ° C в течение 7 дней в инкубаторе. Для длительного использования инкубаторов добавив стерильные PBS между скважин может помочь избежать средних испарения.

3. рассечение

  1. Жертву беременной мыши, когда эмбрионы находятся на начальной стадии E12.5. Очистите живот с 70% этиловом спирте.
  2. Удаление матки путем разрезания два яйцеводов и влагалище и положить его в чашку Петри, наполненный холодной PBS (без Ca2 + Mg2 +).
  3. Собрать все эмбрионы и передавать их на свежий, холодный PBS в чашке Петри (без Ca2 + Mg2 +).
  4. Положите одного эмбриона в блюдо, покрытая силиконом и полон рассечение СМИ (HBSS, 4,5 г/Л глюкозы и 7 мм HEPES рН 7,4).
    Примечание: Рассечение эмбрионов выполняется под микроскопом, с использованием чистой тонкой щипцами и ножницы. Кроме того регулярные Петри блюдо без силикона может использоваться для рассечения.
  5. Удалите головы, хвоста и внутренностей, используя пинцет как ножницы.
  6. Поддерживать эмбриона с животом против силикона с щипцами.
  7. Вторая пара щипцами вставьте один из советов в Центральный канал спинного мозга Ростральных.
  8. Закройте щипцы рвать спинной ткани в несколько миллиметров.
  9. Повторите эту операцию хвостового сторону до тех пор, пока весь спинной открыт (рис. 1B).
  10. Отсоедините ростральной части спинного мозга (церебральный хобот) от тела.
  11. Поверните эмбриона для поддержания открытых спинного против силикона.
  12. Щепотка ростральной части спинного мозга и потяните эмбриона руководителем для извлечения спинного мозга.
    Примечание: Мозговых оболочек и спинной корень ганглиев (ДРГ) должна оставаться прикрепленной к эмбриона. В противном случае тщательно тронуться оставшиеся мозговых оболочек и ДРГ еще привязаны к спинного мозга. На этом шаге, ГДК также могут быть собраны для чувствительных нейрон культуры (см. обсуждение).
  13. Придавить спинном на силиконовой и удалять спинной части шнур, разрезания вдоль середины каждой стороны с помощью скальпеля. Нарезать средней части 10 с помощью скальпеля и передача части к новой пробке.

4. суспензию клеток спинного мозга

  1. Повторите эту процедуру диссекции для 6-8 спинного шнуры.
  2. Пусть спинного куски собирать в нижней части трубы и заменить HBSS 1 мл среды Хэм-F10.
  3. 10 мкл трипсина (2,5% w/v; конечная концентрация 0,025%). Инкубировать трубки для 10 минут при 37 ° C.
  4. Чтобы остановить ферментативного пищеварения, передачи фрагментов новых 15 мл трубки, содержащий 800 мкл полного среднего L-15, 100 мкл 4% (w/v) BSA и 100 мкл DNase (1 мг/мл в L-15 среде).
  5. Нарезанных дважды по 1 мл, с помощью пипетки P1000 аспирационных. Пусть фрагменты поселиться на 2 мин сбор супернатант в свежий 15 мл.
  6. Фрагменты добавьте 900 мкл полного среднего L-15, 100 мкл 4% (w/v) BSA и 100 мкл DNase (1 мг/мл в L-15 среде).
  7. Нарезанных 6 раз по 1 мл, с помощью пипетки P1000 аспирационных. Пусть фрагменты поселиться на 2 мин добавить супернатант в 15 мл полученного на шаге 4.5.
  8. Фрагменты добавьте 900 мкл полного среднего L-15, 100 мкл 4% (w/v) BSA и 100 мкл DNase (1 мг/мл в L-15 среде).
  9. Нарезанных 10 раз , аспирационных 1 мл с помощью пипетки P1000. Пусть фрагменты поселиться на 2 мин добавить супернатант в 15 мл полученного на шаге 4.5. Продолжите супернатант.
  10. С помощью пипетки P1000, осторожно поместите подушку 4% (w/v) 2 мл BSA в нижней части супернатанта трубки. Центрифуга на 470 x g за 5 мин.
  11. Удалить супернатант и Ресуспензируйте клетки лепешка с 2 мл полного среднего L-15.

5. MN обогащение градиента плотности

  1. Суспензию клеток разделен на две трубы 15 мл (1 мл). Затем добавьте 2 мл полного среднего L-15. Если начиная с 6 эмбрионов, используйте эквивалент 3 эмбрионов в метро в 3 мл среды.
  2. Добавьте 2 мл раствора градиент плотности, медленно добавляя решение в нижней части каждой трубы для получения резкого интерфейса.
  3. Центрифуга на 830 x g 15 мин при комнатной температуре. После этого шага небольшие клетки должно быть в нижней части трубки, тогда как большие клетки, такие как MNs должно быть в интерфейсе градиентного раствора/средняя плотность.
  4. Собрать клетки на стыке аспирационных 1 или 2 мл и передавать их на свежий 15 мл. Отрегулируйте громкость до 10 мл с L-15 рН среды.
  5. Добавьте 2 мл 4% BSA подушки в дно трубки и центрифуги на 470 x g 5 мин при комнатной температуре.
  6. Удалить супернатант и Ресуспензируйте гранулы в 3 мл полного среднего L-15.
  7. Повторите шаг 5.5.
  8. Удалить супернатант и Ресуспензируйте Пелле клеток в 2 мл полной питательной среды. Подсчет количества клеток и жизнеспособности под микроскопом фазы контраст с Горяева.
    Примечание: Для 6 спинного шнуры, номер ячейки ожидается около 1 х 105 MNs.

6. MN культура

  1. Разбавьте MNs соответствующей плотности, обычно 5000 до 10000 клетки в 500 мкл питательной среды на хорошо в пластине 24-хорошо.
    Примечание: Заполнение плотность составляет около 30000 и 1500 клеток для 6 - и 96-луночных планшетов, соответственно.
  2. Удаление решения Ламинин с P1000.
  3. Сразу передача МНБ, разводят в культурной среде в покрытие плит во избежание высыхания.
  4. Инкубировать культуры для 2 дней при температуре 37 ° C.

7. Magnetofection МНБ

Примечание: В следующих шагах, использованных количествах предназначены для transfection одной скважиной 24-ну плиты. Пожалуйста, обратитесь к производителя протокол на другой формат.

  1. Для подготовки ДНК, Ресуспензируйте 1 мкг ДНК в 50 мкл нейрональных питательной среды и вихревые для 5 s.
  2. Для подготовки труб из бисера Ресуспензируйте 1.5 мкл бисера в 50 мкл нейрональных питательной среды.
  3. Добавьте 50 мкл шарик решение решение ДНК 50 мкл и проинкубируйте втечение 20 мин при комнатной температуре (суммарный объем = 100 мкл).
  4. Во время этой инкубации снять 100 мкл питательной среды из колодца, который будет transfected.
    Примечание: Положите магнитные пластины в инкубатор, чтобы нагреть его до 37 ° C.
  5. Передачи 100 мкл ДНК/шарик смесь хорошо и инкубировать пластины 20 – 30 мин на магнитные пластины при 37 ° C.
  6. Подождите, по крайней мере за 24 часа до обнаружения выражения cDNA.

8. фиксации и окраски

  1. Вымойте культуры 2 раза с PBS.
  2. Инкубировать культуру для 20 мин при комнатной температуре в 4% PFA/PBS.
  3. Вымойте культуры 2 раза с PBS.
  4. Инкубируйте культуры в 500 мкл блокировки буфера (PBS, BSA 4%, 2% нормальной сыворотки, 0,3% Тритон X-100, 0,1 М глицин) за 1 ч при комнатной температуре.
    Примечание: Нормальной сыворотке должен быть производным от того же вида, как вторичное антитело (например, обычный козьего сыворотки).
  5. Проинкубируйте культуры на ночь при 4 ° C с основного антитела, разводят в 250 мкл блокировки буфера.
    Примечание: К примеру, TUJ1 используется в 1/1000, SMI32 используется в 1/1000, и Lc3b используется на 1/200.
  6. Вымойте культуры 3 раза с PBS.
  7. Проинкубируйте культуры с Флюорофор конъюгированных вторичные антитела, разводят в 250 мкл блокирующий буфер за 1 час при комнатной температуре.
  8. Вымойте культуры 3 раза с PBS.
  9. Смонтировать на стеклянных вставках, с помощью установки среды.

Результаты

После 24 часов в культуре мотонейронов (MNs) следует уже показывают значительный рост аксональное (по крайней мере 6 раз больше, чем размер сома). В последующие дни аксоны следует продолжать расти и отображения ветвления (рис. 2). Будут существовать различны...

Обсуждение

Одним из критических точек в этот протокол является, что эмбрионов мыши разделяются на точное время окна во время разработки (E12.5), чтобы оптимизировать количество МНБ, полученные в конце. Кроме того для оптимальной урожайности, вскрытие должно выполняться утром или в начале второй поло...

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Мы хотели бы поблагодарить «Ассоциация le développement de la neurogénétique» доктор Жакье стипендий и AFM-Телетон за его поддержку через MyoNeurAlp стратегического плана. Мы также хотели бы поблагодарить д-р Крис Хендерсон, д-р Уильям Camu, доктор Brigitte Pettmann, Raoul Седрик д-р и д-р Георг Haase, кто участвовал в развитии и совершенствовании техники и распространения их знаний.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Material
Silicone dissection dishLiving systems instrumentationDD-90-S-BLK-3PKSylgard
round coverslipNeuVitro, Knittel glassGG-12-Pre12 mm
Slide a Lyzer cassettesThermoFisher Scientific6603020,000 MWCO ; 30 mL
Filter unitMilliporeSCGVU02RE
GP Sterile Syringe FiltersMilliporeSLGP033RS
4 well plateThermoFisher Scientific167063Nunclon Delta treated plate
forcepsFST by Dumont11252-20#5 forceps
scissorFST by Dumont14060-10fine scissors
scalpelFST by Dumont10035-20curved blade
scalpelFST by Dumont10316-14micro-knife scalpel
Petri dishGreiner663102ø x h = 100 x 15 mm
15 mL polypropylene tubeFalcon352096
filter paperWatman1001125circle, 125 mm diameter
glass chamber slideLab-Tek1545264 chambers
Plasmid pCAGENAddgene#11160
NameCompanyCatalog NumberComments
Solutions and mediums
Bovine serum albuminSigma-AldrichA9418
L-15 mediumThermoFisher Scientific11415056
L-15 medium, no red phenolThermoFisher Scientific21083027
InsulinSigma-AldrichI6634
PutrescineSigma-AldrichP5780
ConalbuminSigma-AldrichC7786
Sodium seleniteSigma-AldrichS5261
ProgesteroneSigma-AldrichP8783
Poly-DL-OrnithineSigma-AldrichP8638
LamininSigma-AldrichL2020
trypsin 2.5%, 10xThermoFisher Scientific15090046
DNAseSigma-AldrichDN25
PBS w/o Ca MgThermoFisher Scientific14190144without Mg2+ Ca2+
sodium bicarbonateThermoFisher Scientific25080094
Neuron cell culture mediumThermoFisher ScientificA3582901Neurobasal Plus medium
HBSSSigma-AldrichH6648-500ML
HEPES buffer 1 MThermoFisher Scientific15630056
Density gradiant mediumSigma-AldrichD1556Optiprep
supplement mediumThermoFisher ScientificA3582801B-27 Plus
Horse serum heat inactivatedThermoFisher Scientific26050-088
L-Glutamine 200 mMThermoFisher Scientific25030024
2-mercaptoethanolThermoFisher Scientific31350010
penicilline/streptomycineThermoFisher Scientific1514012210,000 U/mL
NameCompanyCatalog NumberComments
Immuno fluorescence
PBS, 10xThermoFisher ScientificX0515without Mg2+ Ca2+
Paraformaldehyde (PFA)Sigma-Aldrich441244
normal goat serumSigma-AldrichG6767
glycineSigma-AldrichG7126
Triton X-100Sigma-AldrichT8787
Choline Acetyl Transferase (CHAT)ChemiconAb144P
Neurofilament H non phosphorylated (SMI32)BiolegendsSMI-32PIF at 1/1000
Islet-1DSHB40.2D6
Islet-2DSHB39.4D5
Hb9DSHB81.5C10
Vectashield mounting mediumVector LabH-1000
Beta3 tubulin (Tuj1 clone)Biolegends801201IF at 1/1000
Lc3bCell Signaling Technology#2775IF at 1/200

Ссылки

  1. Gonzalez, M. A., et al. A novel mutation in VCP causes Charcot-Marie-Tooth Type 2 disease. Brain. 137 (11), 2897-2902 (2014).
  2. Johnson, J. O., et al. Exome sequencing reveals VCP mutations as a cause of familial ALS. Neuron. 68 (5), 857-864 (2010).
  3. Watts, G. D. J., et al. Inclusion body myopathy associated with Paget disease of bone and frontotemporal dementia is caused by mutant valosin-containing protein. Nature Genetics. 36 (4), 377-381 (2004).
  4. Brown, R. H., Al-Chalabi, A. Amyotrophic Lateral Sclerosis. New England Journal of Medicine. 377 (2), 162-172 (2017).
  5. Taylor, J. P., Brown, R. H., Cleveland, D. W. Decoding ALS: from genes to mechanism. Nature. 539 (7628), 197-206 (2016).
  6. Henderson, C. E., Bloch-Gallego, E., Camu, W. Purified embryonic motoneurons. Nerve Cell Culture: A Practical Approach. , 69-81 (1995).
  7. Henderson, C. E., et al. GDNF: a potent survival factor for motoneurons present in peripheral nerve and muscle. Science. 266 (5187), 1062-1064 (1994).
  8. Schaller, S., et al. Novel combinatorial screening identifies neurotrophic factors for selective classes of motor neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (12), E2486-E2493 (2017).
  9. Jacquier, A., et al. Alsin/Rac1 signaling controls survival and growth of spinal motoneurons. Annals of Neurology. 60 (1), 105-117 (2006).
  10. Raoul, C., et al. Chronic activation in presymptomatic amyotrophic lateral sclerosis (ALS) mice of a feedback loop involving Fas, Daxx, and FasL. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (15), 6007-6012 (2006).
  11. Madji Hounoum, B., et al. Wildtype motoneurons, ALS-Linked SOD1 mutation and glutamate profoundly modify astrocyte metabolism and lactate shuttling. Glia. 65 (4), 592-605 (2017).
  12. Magrane, J., Sahawneh, M. A., Przedborski, S., Estevez, A. G., Manfredi, G. Mitochondrial Dynamics and Bioenergetic Dysfunction Is Associated with Synaptic Alterations in Mutant SOD1 Motor Neurons. Journal of Neuroscience. 32 (1), 229-242 (2012).
  13. Jacquier, A., et al. Cryptic amyloidogenic elements in mutant NEFH causing Charcot-Marie-Tooth 2 trigger aggresome formation and neuronal death. Acta Neuropathologica Communications. 5, (2017).
  14. Aebischer, J., et al. IFNγ triggers a LIGHT-dependent selective death of motoneurons contributing to the non-cell-autonomous effects of mutant SOD1. Cell Death and Differentiation. 18 (5), 754-768 (2011).
  15. Wiese, S., et al. Isolation and enrichment of embryonic mouse motoneurons from the lumbar spinal cord of individual mouse embryos. Nature Protocols. 5 (1), 31-38 (2010).
  16. Camu, W., Henderson, C. E. Purification of embryonic rat motoneurons by panning on a monoclonal antibody to the low-affinity NGF receptor. Journal of Neuroscience Methods. 44 (1), 59-70 (1992).
  17. Conrad, R., Jablonka, S., Sczepan, T., Sendtner, M., Wiese, S., Klausmeyer, A. Lectin-based Isolation and Culture of Mouse Embryonic Motoneurons. Journal of Visualized Experiments. (55), (2011).
  18. Wichterle, H., Lieberam, I., Porter, J. A., Jessell, T. M. Directed differentiation of embryonic stem cells into motor neurons. Cell. 110 (3), 385-397 (2002).
  19. Francius, C., Clotman, F. Generating spinal motor neuron diversity: a long quest for neuronal identity. Cellular and Molecular Life Sciences. 71 (5), 813-829 (2014).
  20. Neto, E., et al. Compartmentalized Microfluidic Platforms: The Unrivaled Breakthrough of In Vitro Tools for Neurobiological Research. The Journal of Neuroscience. 36 (46), 11573-11584 (2016).
  21. Matsuda, T., Cepko, C. L. Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (1), 16-22 (2004).
  22. Sleigh, J. N., Weir, G. A., Schiavo, G. A simple, step-by-step dissection protocol for the rapid isolation of mouse dorsal root ganglia. BMC Research Notes. 9, (2016).
  23. Yu, L., et al. Highly efficient method for gene delivery into mouse dorsal root ganglia neurons. Frontiers in Molecular Neuroscience. 8 (2), (2015).
  24. Malin, S. A., Davis, B. M., Molliver, D. C. Production of dissociated sensory neuron cultures and considerations for their use in studying neuronal function and plasticity. Nature Protocols. 2 (1), 152-160 (2007).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

143neurofilamentmagnetofection

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены