小鼠原代多元体的体外模拟？

摘要

这项技术的目的是准备一种高度丰富的来自小鼠脊髓的原发运动神经元 (mns) 培养。为了评估引起 mn 疾病的突变的后果, 我们在这里描述了这些孤立的 m2 的隔离和它们通过磁光的转染。

摘要

脊髓运动神经元 (mns) 的神经退行性变与大量的神经疾病有关, 包括肌萎缩侧索硬化症、夏科-玛丽-牙齿疾病和脊髓肌肉萎缩, 这些疾病都与肌肉萎缩有关。脊髓 mns 的初级培养已被广泛用于证明特定基因在这类疾病中的参与, 并描述其突变的细胞后果。该协议模拟了一种源自亨德森和他的同事们20多年前的开创性工作的主要 mn 文化。首先, 我们详细介绍了一种从小鼠胚胎中解剖脊髓前角并使用密度梯度从邻近细胞中分离 ms 的方法。然后, 我们提出了一种利用磁光法高效地转换具有表达质粒的 mns 的新方法。最后, 我们说明了如何固定和免疫控制原发性 mns. 利用导致夏科-玛丽-牙齿疾病2型的神经纤维突变, 该协议演示了一种定性的方法来表达感兴趣的蛋白质, 并研究它们的参与mn 的生长、维护和生存。

引言

神经肌肉疾病包括各种临床和基因上不同的疾病, 其特点是肌肉和/或神经系统的改变。由于测序技术的进步, 在过去十年中发现了数百种导致这些罕见疾病的基因 (可在神经肌肉疾病中心查阅的名单, http://neuromuscular.wustl.edu/index.html)。识别突变的多样性表明, 单个基因中的不同突变会导致不同的表型和疾病^1、2、3,不同基因的突变会产生相似的表型^{4 个,5}. 在这方面, 正在努力开发能够成为分析突变后果和病理机制的有力工具的细胞模型。

脊髓 mns 有一个大的 somas 位于脊髓的腹侧角, 形成长轴突, 以骨骼肌纤维为目标, 并允许自愿运动, 通过释放乙酰胆碱在神经肌肉交界处。由于 mns 受到肌萎缩侧索硬化症、夏科-玛丽-牙齿疾病 (cmt) 和脊髓肌肉萎缩等神经肌肉疾病的影响, 亨德森博士和他的同事们制定了第一个方案⁶ , 允许种植体外脊髓 mns 和神经营养因子 gdnf7 (胶质细胞衍生的神经营养因子) 的发现。自那时以来, 技术改进使脊柱 mnm^及其亚型能够使用几十年化骨联8进行更准确的纯化, 但密度梯度的浓缩仍然很强大, 并在目前与初级脊柱 mns 合作的实验室中得到广泛使用^{9,10,11,12,13,14}. 随后, 还可以利用表面标记 p75^{(ntr)15、16、17}, 通过免疫调节获得更高的 mn 纯化级。

脊髓包含不同类型的颈椎, 胸椎, 腰椎 m2, 以及中位和侧向运动柱, 不同的位置在前角的背腹轴和目标之间, 他们支配 8^,18. 初级 mn 培养可以按生理比例恢复所有这些 mn 亚型。这种技术的主要局限性是在程序结束时获得的 mb 数量少;事实上, 它可以预期从六个胚胎中获得大约^{10个 5个}ms, 这适用于显微镜, 但限制了生物化学实验。为了对更标准化的亚型和丰富的 ms (& gt;10⁶细胞) 进行实验, 胚胎干细胞衍生的 ms 应被考虑^{到 18}。

将野生类型突变基因转染或将内源基因分解为初级 mms 是破译生理病理途径的一种快速而有益的工具, 尤其是在没有小鼠模型的情况下。磁染是一种转染原代神经元的技术, 类似于没有相关神经毒性的脂切。此外, 转染可以在成熟的神经元进行几天后, 在体外, 不同于基于电穿孔⁹的技术。然而, 这种技术的一个缺点是, 珠子结合核酸的培养, 造成噪音的 dapi 标签。病毒感染可能是最有效的转染 mn 的技术;然而, 磁光化不需要病毒生产和细胞感染所需的某些安全程序。

研究方案

所有涉及动物的程序都被该机构的道德委员会接受。

1. 解决方案准备

1. 在 l-15 培养基中制备 4% bsa 透析的10毫升。
   1. 将牛血清白蛋白粉在 l-15 培养基10毫升中, 以 4% (w/v) 的速度溶解。
   2. 将溶液添加到20毫升的透析盒式磁带上, 并提供 20 kda 截止。在4°c 搅拌下, 对 l-15 培养基的500毫升进行透析3天。每天更换 l-15 介质。
   3. 通过0.22μm 膜过滤溶液, 并在 15 ml 管中过滤。将管材存放在-20°c。
      注: 本协议使用以下参考: 未经修饰的原料 l-15 介质 = l-15 介质, 酸性 l-15 介质 = ph l-15, 基本 l-15 介质 = 碳酸盐 l-15。
2. 准备200毫升的 ph 值 l-15。
   1. 调整 l-15 介质的 ph 值: 首先, 在洗脸瓶中填充一些干冰片。将气体 (co2) 注入 l-15 介质, 直到颜色变为橙色 (~ ph 值6.4 和 ~ 40 压力)。ph 值也可以通过标准 ph 计进行调整。
   2. 通过0.22μm 膜过滤培养基, 并在4°c 下储存一个月。
3. 准备100毫升的碳酸氢盐 l-15。
   1. 将2.5% 的7% 碳酸氢钠加入 l-15 培养基的97.5 毫升, 存放在4°c。
4. 准备国际化学品安全方案 (胰岛素 pure星 conalbumin selenite) 补充剂。
   1. 在 0.1 m hcl 的 0.5 ml 中溶解2.5 毫克的胰岛素, 加入 4.5 ml 的双蒸馏水。
   2. 溶解8毫克的磷化盐 (pbs) 5 毫升。
   3. 在 pbs 10 毫升中溶解100毫克的圆锥白蛋白。
   4. 在19.3 毫升的水中溶解1毫克的硒酸钠, 将 ph 值调整到 7.4, 并将溶液稀释10倍。
   5. 将胰岛素溶液1毫升、泥质溶液1毫升、丙白蛋白1毫升、硒酸钠溶液0.1 毫升结合起来, 得到国际化学品安全方案补充溶液的3.1 毫升。将溶液存放在-20°c。
5. 准备 0.02 mm 黄体酮溶液。
   1. 在乙醇的 1.6 ml 中溶解1毫克黄体酮。
   2. 将溶液在100% 乙醇中稀释 100倍, 并将其储存在-20°c。
6. 准备100毫升的完整 l-15 介质。
   1. 将 1.8 ml 的 d-葡萄糖溶液 (200 mg/ml) 加入 ph l-15 的92毫升, 最终获得 3.5 mg/ml 葡萄糖的浓度。
   2. 合成100x 青霉素-链霉素 (10, 000 u/ml) 的1毫升、热灭活马血清的2毫升、国际化学品安全方案的 3.1 ml 混合和0.1 毫升的黄体酮溶液 (2 x^10-5 m)。
   3. 将介质过滤在0.22μm 的膜上, 并将其存储在4°c。
7. 每个实验制备5毫升密度梯度溶液 (最终浓度为 5.5%)。
   1. 加入476μl 的商业60% 密度梯度介质到4524μl 的 l-15 (如有可能, 在没有红酚的情况下, 增加间相的视觉对比度; 稀释率为 1:10.5)。
   2. 将溶液在4°c 下存放 2周, 或将其冷冻在-20°c。
8. 准备10毫升的培养基。
   1. 加入200μl 补活培养基至9.6 毫升神经元细胞培养培养基。
   2. 加入200μl 的热失活马血清 (倾向于区分胶质细胞前体, 并防止增殖) 到25μl 的谷氨酰的谷氨酰和10μl 的 2-硫醇。
   3. 通过0.22μm 过滤器对介质进行过滤。
   4. 添加以下神经营养因子: 最终浓度为 10 ng/ml 的睫毛神经营养因子 (cntf) 和最终浓度为 1 ng/ml 的脑源性神经营养因子 (bdnf) 和胶质细胞衍生的神经营养因子 (gdnf)。
   5. 将介质存放在4°c。
9. 准备50毫升的解剖介质。
   1. 在 hbss 的47:05 中加入2.25 毫升葡萄糖 (200 mg/ml)。加入低 ph 值7.4 的 1 m hepes 的700μl。将介质存放在4°c。
10. 准备4% 的 pfa 解决方案。
    1. 在500毫升的 pbs 中溶解20克的 pfa。
    2. 在化学引擎盖下, 将溶液加热到 60°c, 并加入几滴 1 m naoh, 直到溶液变得清晰。
    3. 通过滤纸过滤溶液, 并将 ph 值调整为7.2。将其存放在-20°c。
       注: 或者, 其他商业 pfa 溶液可以在 pbs 中使用并稀释到4%。
11. 使用前使用70% 乙醇, 使用后用肥皂和清水清洁解剖工具, 包括钳子、剪刀和硅胶餐具。

2. 聚鸟/拉米宁 (po l) 盘涂料

注: 卷适用于覆盖24孔板。

1. 如果需要, 在井里放一张12毫米的无菌盖板。
2. 在井上涂上500μml 聚-l-鸟氨酸溶液, 溶解在水中。
3. 让水井在室温下沉淀1小时。
4. 取出多-l-鸟氨酸溶液, 风干30分钟。
5. 在37°c 下隔夜涂上油井, 在碳酸氢盐 l-15 中用500μl 的3μgl 层压蛋白。
   注: 井可以在37°c 下在孵化器中储存7天。对于长时间的孵育, 在井间添加无菌 pbs 有助于避免介质蒸发。

3. 解剖

1. 当胚胎处于 e12.5 胚胎阶段时, 牺牲怀孕的老鼠。用70% 的乙醇清洁腹部。
2. 通过切割两个输卵管和阴道取出子宫, 并将其放入充满冷 pbs (不含 ca^{2 +} mg^{2 +}) 的培养皿中。
3. 收集所有的胚胎, 并将它们转移到新鲜的, 冷的 pbs^{(没有 ca 2 +} mg2⁺) 在培养皿中。
4. 将一个胚胎放入涂有有机硅和充满解剖介质的盘子中 (含 hbss、4.5 gl 葡萄糖和 7 mm hepes ph 7.4)。
   注: 胚胎解剖是在显微镜下使用干净的细钳和剪刀。或者, 不含硅胶的普通培养皿也可用于解剖。
5. 取下头部、尾部和内脏, 用钳子作为剪刀。
6. 用钳子保持胚胎的腹部对硅胶。
7. 用第二对钳子, 将其中一个尖头插入脊髓中央管中。
8. 关闭钳子, 撕开背部组织几毫米。
9. 对尾侧重复此操作, 直到整个脊髓打开 (图 1b)。
10. 从身体中分离脊髓 (脑干) 的左部分。
11. 转动胚胎, 使脊髓保持开放, 对抗硅胶。
12. 夹紧脊髓的左侧部分, 用头部拉动胚胎以提取脊髓。
    注: 脑膜和背根神经节 (drg) 应保持附着在胚胎上。否则, 请小心地拔出任何剩余的脑膜和 drg 仍然附着在脊髓上。在此步骤中, 还可以收集用于敏感神经元培养的 drg (请参阅讨论)。
13. 用手术刀沿着两侧的中部切割, 将脊髓压平硅胶, 并将其背侧的一半切除。用手术刀将中间部分切割成 1 0 块, 并将这些碎片转移到新的管中。

4. 脊髓细胞悬浮液

1. 对6至8根脊髓重复此解剖程序。
2. 让脊髓碎片聚集在试管底部, 用 ham-f10 培养基的1毫升取代 hbss。
3. 加入10μl 的胰蛋白酶 (2.5% wv; 最终浓度 0.025)。在37°c 下将试管孵化10分钟。
4. 为了阻止酶消化, 将碎片转移到一个新的 15 ml 管中, 其中含有800μl 的完整 l-15 介质、100μl 的 4% (w/v) bsa 和100μl 的 dnase (l-15 介质中的 1 mg/ml)。
5. 通过使用 p1000 移液器吸气1毫升, 进行两次气管化。让碎片沉淀 2分钟, 在一个新鲜的15毫升管中收集上清液。
6. 在片段中, 加入100μl 的完整 l-15 介质, 100μl 的 4% (w/v) bsa, 100μl 的 dnase (l-15 介质中的 1 mg/ml)。
7. 通过使用 p1000 移液器吸气1毫升, 进行6次滴管。让碎片沉淀 2分钟, 将上清液加入到步骤4.5 中获得的 15 ml 管中。
8. 在片段中, 加入100μl 的完整 l-15 介质, 100μl 的 4% (w/v) bsa, 100μl 的 dnase (l-15 介质中的 1 mg/ml)。
9. 通过使用 p1000 移液器吸气1毫升, 将其滴管 10次. 让碎片沉淀 2分钟, 将上清液加入到步骤4.5 中获得的 15 ml 管中。继续上清液。
10. 使用 p1000 管, 轻轻地将2毫升 bsa 4% (wv) 垫放在上清液管底部。在 470 x 克离心5分钟。
11. 取出上清液, 用全新的 l-15 培养基重新悬浮细胞颗粒。

5. 梯度密度的 mn 浓缩

1. 将细胞悬浮液分成两个15毫升管 (每个管1毫升)。然后, 添加2毫升的完整 l-15 介质。如果从6个胚胎开始, 在3毫升的培养基中使用相当于每个管3个胚胎的胚胎。
2. 通过在每个管的底部慢慢添加溶液, 以获得一个尖锐的界面, 加入2毫升的密度梯度解。
3. 在 830 x 克离心时, 室温下15分钟。在这一步之后, 小细胞应该在管的底部, 而大的细胞, 如 ms 应该在密度梯度溶液/介质界面。
4. 通过吸气1或2毫升收集细胞在接口, 并将其转移到一个新鲜的15毫升管。使用 l-15 ph 介质将音量调整为10毫升。
5. 在室温下 5分钟, 将 4% bsa 垫的2毫升加入到 470 x 克的管和离心机底部。
6. 取出上清液, 在全 l-15 培养基的3毫升中重新悬浮颗粒。
7. 重复步骤5.5。
8. 去除上清液, 在培养基2毫升中重新悬浮细胞颗粒。用血细胞仪在相对照显微镜下计数细胞数量和活力。
   注: 对于6条脊髓, 细胞号预计约为 1 x¹⁰ 5 ms。

6. mn 文化

1. 将 mml 稀释到适当的密度, 通常在每个孔的24孔板中500μl 培养基中的 5, 000 至 10, 000个细胞。
   注: 6 和96孔板的播种密度分别约为 30, 000个和 1, 500个。
2. 用 p1000 去除层压蛋白溶液。
3. 立即将培养基中稀释的 m2 转移到涂层板中, 以避免干燥。
4. 在37°c 下培养2天。

7. mn 的磁通

注: 在以下步骤中, 所使用的数量用于24孔板的一口井的转染。有关另一种格式, 请参阅制造商的协议。

1. 对于 dna 制备, 在50μl 的神经元培养基和 5 s 的涡旋中重新悬浮1μg 的 dna。
2. 对于珠管制备, 在50μl 的神经元培养基中重新悬浮1.5 μl 的珠子。
3. 将50μl 珠溶液加入 50μl dna 溶液, 在室温下孵育 20分钟 (总体积 = 100μl)。
4. 在此孵育过程中, 从将转染的井中提取100μl 培养基。
   注: 将磁板放入孵化器, 将其加热至37°c。
5. 将 dna/珠混合物的100μl 输送到井中, 并在37°c 的磁板上孵育20-30分钟。
6. 等待至少24小时后再检测到 cdna 表达。

8. 固定和染色

1. 用 pbs 清洗培养方法2次。
2. 在室温下将培养物培养成 4% pafa pbs。
3. 用 pbs 清洗培养方法2次。
4. 在500μl 的阻滞缓冲液 (pbs, 4% bsa, 2% 正常血清, 0.3% triton x-100, 0.1 m 甘氨酸) 中培养1小时。
   注: 正常血清应来自与二级抗体相同的物种 (例如,正常山羊血清)。
5. 在4°c 条件下, 用25μl 的阻滞缓冲液稀释原代抗体将培养物隔夜培养。
   注: 例如, tuj1 在 1.5 1000 时使用, 在1/1000 时使用 smi32, 在1200时使用 lc3b。
6. 用 pbs 清洗培养方法3次。
7. 在室温下, 用25μl 的阻滞缓冲液稀释的氟共轭二级抗体将培养物培养1小时。
8. 用 pbs 清洗培养方法3次。
9. 使用安装介质将其安装在玻璃滑块上。

结果

在培养24小时后, 运动神经元 (mn) 应该已经显示出显著的轴突生长 (至少比 soma 大小长 6倍)。在接下来的几天里, 轴突应该继续生长并显示分支 (图 2)。由于子类型的特殊性, 会有不同的形态。例如, 神经性轴向肌肉的中位柱 mn 比侧向运动柱 mn 具有更短和更多的分支轴突, 而侧向运动柱 mn 则为支配肢体肌肉¹⁸。

讨论

该协议的关键点之一是, 在开发过程中, 在精确的时间窗口 (e12.5) 对小鼠胚胎进行解剖, 以优化最终获得的 mn 量。此外, 为了获得最佳产量, 解剖应在上午或下午早些时候进行。在 e12.5 之前 (例如e11.5), 解剖是困难的, 特别是在消除脑膜方面。e12.5 后, 获得的 m2 数量显著下降。为了控制胚胎发育阶段, 成年女性和男性在一天结束时首先被放在一起。第二天早上, 成年人被分开, 女性被检查是否有?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Material
Silicone dissection dish	Living systems instrumentation	DD-90-S-BLK-3PK	Sylgard
round coverslip	NeuVitro, Knittel glass	GG-12-Pre	12 mm
Slide a Lyzer cassettes	ThermoFisher Scientific	66030	20,000 MWCO ; 30 mL
Filter unit	Millipore	SCGVU02RE
GP Sterile Syringe Filters	Millipore	SLGP033RS
4 well plate	ThermoFisher Scientific	167063	Nunclon Delta treated plate
forceps	FST by Dumont	11252-20	#5 forceps
scissor	FST by Dumont	14060-10	fine scissors
scalpel	FST by Dumont	10035-20	curved blade
scalpel	FST by Dumont	10316-14	micro-knife scalpel
Petri dish	Greiner	663102	ø x h = 100 x 15 mm
15 mL polypropylene tube	Falcon	352096
filter paper	Watman	1001125	circle, 125 mm diameter
glass chamber slide	Lab-Tek	154526	4 chambers
Plasmid pCAGEN	Addgene	#11160
Name	Company	Catalog Number	Comments
Solutions and mediums
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A9418
L-15 medium	ThermoFisher Scientific	11415056
L-15 medium, no red phenol	ThermoFisher Scientific	21083027
Insulin	Sigma-Aldrich	I6634
Putrescine	Sigma-Aldrich	P5780
Conalbumin	Sigma-Aldrich	C7786
Sodium selenite	Sigma-Aldrich	S5261
Progesterone	Sigma-Aldrich	P8783
Poly-DL-Ornithine	Sigma-Aldrich	P8638
Laminin	Sigma-Aldrich	L2020
trypsin 2.5%, 10x	ThermoFisher Scientific	15090046
DNAse	Sigma-Aldrich	DN25
PBS w/o Ca Mg	ThermoFisher Scientific	14190144	without Mg2+ Ca2+
sodium bicarbonate	ThermoFisher Scientific	25080094
Neuron cell culture medium	ThermoFisher Scientific	A3582901	Neurobasal Plus medium
HBSS	Sigma-Aldrich	H6648-500ML
HEPES buffer 1 M	ThermoFisher Scientific	15630056
Density gradiant medium	Sigma-Aldrich	D1556	Optiprep
supplement medium	ThermoFisher Scientific	A3582801	B-27 Plus
Horse serum heat inactivated	ThermoFisher Scientific	26050-088
L-Glutamine 200 mM	ThermoFisher Scientific	25030024
2-mercaptoethanol	ThermoFisher Scientific	31350010
penicilline/streptomycine	ThermoFisher Scientific	15140122	10,000 U/mL
Name	Company	Catalog Number	Comments
Immuno fluorescence
PBS, 10x	ThermoFisher Scientific	X0515	without Mg2+ Ca2+
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma-Aldrich	441244
normal goat serum	Sigma-Aldrich	G6767
glycine	Sigma-Aldrich	G7126
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787
Choline Acetyl Transferase (CHAT)	Chemicon	Ab144P
Neurofilament H non phosphorylated (SMI32)	Biolegends	SMI-32P	IF at 1/1000
Islet-1	DSHB	40.2D6
Islet-2	DSHB	39.4D5
Hb9	DSHB	81.5C10
Vectashield mounting medium	Vector Lab	H-1000
Beta3 tubulin (Tuj1 clone)	Biolegends	801201	IF at 1/1000
Lc3b	Cell Signaling Technology	#2775	IF at 1/200