في المختبر تشكيل الكلاب العَدلات فخ خارج الخلية: التحليل الكمي ودينامية بالفحص المجهري الأسفار

Summary

ونحن تصف الأساليب عزل الكلاب العَدلات من الدم كله، ووضع تصور لتشكيل الصافية في العَدلات حية باستخدام مجهر الأسفار. ووصف أيضا بروتوكولات التحديد الكمي لتشكيل الصافية وهيستون سيتروليناتيد H3 التعبير (citH3) باستخدام مجهر الفلورة.

Abstract

ردا على غزو العوامل الممرضة، حرر العَدلات العَدلات الفخاخ خارج الخلية (شبكات)، وشبكات خارج الخلية للحمض النووي مزينة هيستونيس والبروتينات المضادة للميكروبات. الإفراط في تشكيل الصافي (نيتسيس) والإفراج عن citH3 خلال الانتان يرتبط بالخلل في الجهاز ووفيات في الفئران والبشر متعددة ولكن آثارها في الكلاب غير معروفة. وهنا، يصف لنا تقنية لعزل الكلاب العَدلات من الدم كله للمراقبة والقياس الكمي نيتوسيس. يتم فصل البلازما الغنية بالكريات البيض، التي تم إنشاؤها بواسطة الترسب ديكستران، وسائل الإعلام فصل التدرج الكثافة المتاحة تجارياً وجمعت المحببة لخلية العد واختبار جدوى. لمراقبة نيتسيس في الوقت الحقيقي في العَدلات الحية، الخلية بيرمينت والبقع إيمبيرمينت الحمض النووي الفلورسنت خلية تضاف إلى العَدلات المنشط أما بواسطة lipopolysaccharide (LPS) أو phorbol 12-ميريستاتي 13-خلات (سلطة النقد الفلسطينية). التغييرات في مورفولوجيا النووية وتشكيل صافي لاحظها مجهرية الأسفار على مر الزمن. في المختبر كذلك يتميز نيتوسيس co-كولوكاليزاتيون خالية من خلايا الحمض النووي (كفدنا)، ميلوبيروكسيداسي (الخطة الرئيسية للعمليات) وهيستون سيتروليناتيد H3 (citH3) باستخدام بروتوكول تعديل مزدوج-إيمونولابيلينج. وكمياً موضوعيا تشكيل الصافية والتعبير citH3 باستخدام مجهر الأسفار، الشباك citH3-إيجابية الخلايا كمياً بشكل أعمى باستخدام البرمجيات المتاحة. هذا الأسلوب مقايسة محددة لتقييم القدرات في المختبر من العَدلات الكلاب البوليسية للخضوع نيتسيس.

Introduction

العَدلات هي المسؤولة عن الدفاع الأولية ضد غزو العوامل الممرضة لم تدم طويلاً المحببة. العَدلات، المعينين إلى موقع الإصابة، القضاء على الكائنات الحية الدقيقة التي البلعمه، وتحبب، وتوليد الأكسجين التفاعلية الأنواع (روس)¹. وجود البكتيريا أو اندوتوكسينس، العَدلات الإصدار العَدلات خارج الخلية الفخاخ (شبكات)، تتألف من الكروماتين خارج الخلية مزينة هيستونيس والبروتينات الحبيبية مثل الاستاسي وميلوبيروكسيداسي (الخطة الرئيسية للعمليات)². على الرغم من أن شبكات لها خصائص مضادات الميكروبات لا غنى عنه، تزايد الأدلة التجريبية والسريرية تشير إلى أن تشكيل صافي مفرط خلال الانتان قد يؤدي إلى عدة الجهاز خلل ووفاة^{3،4، 5 , 6}.

نظراً لأن شبكات قد تلعب دوراً الفيزيولوجية المرضية مشابهة في الكلاب، تصلح التدخلات العلاجية التي تمنع أو تقلل من تكوين شبكة استراتيجيات العلاج الرواية في الحيوانات التعفين. لهذا السبب، هناك حاجة لتقنية موثوقة لتقييم وتقدير حجم نيتسيس ومكونات صافي في الكلاب. سابقا قد تم تقييم صافي مكونات بما في ذلك الخلية الحرة الحمض النووي (كفدنا) ونوكليوسوميس في العَدلات الكلاب والبلازما من الكلاب السريرية^7،،من⁸⁹. استخدام فحوصات الأسفار، جوجس وليتيندري وجدت أن الكلاب الانتانية لديها مستويات أعلى من كفدنا من الكلاب صحية⁸. على الرغم من أن هذه التقنيات موضوعية للغاية والكمية، يتم قياس كفدنا ونوكليوسوميس كعلامات نيتسيس غير محددة نظراً لأنها يمكن أن يستمد من الخلايا نخرية خلاف العَدلات نيتوسينج. هنا يصف لنا أسلوب الذي يستخدم fluorescence الفحص المجهري لدراسة سلوك العيش نيتوسينج العَدلات. ونحن أيضا بالتفصيل بروتوكول تعديل استخدام مزدوج-إيمونولابيلينج لقياس ذاتي الشباك ومكوناتها، مثل الخطة الرئيسية للعمليات و citH3 في العَدلات الكلاب¹⁰.

Protocol

وقد أقر جميع الأساليب الموصوفة هنا برعاية الحيوان المؤسسية واستخدام اللجنة في جامعة كاليفورنيا، ديفيس (البروتوكول رقم: 18338).

1. جمع الدم

1. رسم 10 مل دم أما في الاتجاه الرأسي أو جوجولار استخدام إبرة ز 21 بتطلع حقنه.
2. لتجنب الضغط المفرط على القص، إزالة الإبرة من المحاقن قبل نقل الدم إلى tube(s) التي تحتوي على صوديوم الهيبارين (75 جامعة جنوب المحيط الهادئ). برفق عكس الأنابيب عدة مرات لضمان خلط كافية تخثر الدم والدم. التحقق من وجود أدلة من جلطات أو المجاميع الخلية الحمراء قبل وضع العينات في الثلج.

2-العَدلات العزلة

1. تمييع الدم أنتيكواجولاتيد مع حجم متساوية من مخزنة الفوسفات المالحة المثلج دوبيككو (دببس) (الرقم الهيدروجيني 7.4، دون الكاتيونات ديفالينت). نقل 8 مل دم المخفف في أنبوب 50 مل مخروطية البوليبروبيلين التي تحتوي على 25 مل ديكستران 3 في المائة (من نستقه spp. المذابة في محلول كلوريد الصوديوم 0.9%). ضع الأنبوب رأسي في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة للسماح للتجميع وترسب الكريات الحمراء.
2. طبقة 5 مل بلازما الغنية بالكريات البيض (الشكل 1) بعناية على رأس 5 مل من كثافة وسائل الإعلام التدرج في أنبوب أسفل جولة 14 مل البوليبروبيلين. احرص على عدم خلط الحلول 2¹¹.
3. الطرد المركزي هذه الأنابيب في 400 x ز مع التسارع/التباطؤ (A/D) تعيين إلى 0 (لا الفرامل) لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
4. استخدام 5 مل بيبيت المصلية جمع طبقة الخلية المحببات بتجاوز بالبلازما والدم المحيطي طبقات الخلايا وحيدات النوى (PBMC) (الشكل 1). استخدام بيبيت من جديد في كل مرة للتقليل من التلوث.
5. ضع 4 إلى 6 مل طبقة الخلايا بوليمورفنوكلير (المجنحة) في أنبوب 50 مل مخروطية البوليبروبيلين. منذ قد يستنشق كمية صغيرة من المجاميع كرات الدم الحمراء جنبا إلى جنب مع الطبقة المجنحة، استخدام بيبيت مصلية 1 مل لإزالة الركام كرات الدم الحمراء التي تمت تسويتها في الجزء السفلي من الأنبوب بلطف.
6. الكريات الحمراء المتبقية مع 20 مل مياه الباردة عالي النقاوة. بلطف قلب الأنبوبة عدة مرات عن 30 إلى 60 ثانية لضمان ليسينج الكافية قبل إضافة وحدة تخزين متساوية من محلول كلوريد الصوديوم 1.8% المثلج.
7. الطرد المركزي في 112 x ز 10 دقيقة في 4 درجات مئوية، ومجموعة A/D إلى 0.
8. كرر الخطوة تحلل كرات الدم الحمراء إذا ظهر هذا بيليه أحمر. تجاهل المادة طافية بعناية مع بيبيت مصلية ولطف ريسوسبيند بيليه في 100 ميليلتر من دببس (0.9 مم مجكل₂، الدكستروز 5 مم والبومين المصل البقري 1%، 7.3 درجة الحموضة، 1.9 مم كاكل₂ ). دمج كافة الخلايا ريسوسبينديد ووضع على الجليد.
9. أداء عدد خلايا استخدام محلل خلية الآلي والتحقق من العدد من هيموسيتوميتير. إذا لزم الأمر، يركز بمنس على شريحة زجاج استخدام سيتوسينتريفوجي (1,000 لفة في الدقيقة، 5 دقيقة) وتحديد نسبة العَدلات بإحصاء عدد العَدلات من أصل العدد الإجمالي للخلايا.
10. تحديد صلاحية العَدلات عن طريق إجراء اختبار استبعاد تريبان أزرق كما حددها ستروبر et al. ¹² العزلة الناجحة ينبغي أن يعود جدوى من 95 إلى 100%، وينبغي أن يكون العَدلات أكثر من 95%.
11. تحديد تركيز العَدلات بضرب عدد خلايا الكلي مع بقاء نسبة ونسبة العَدلات. العزل الناجحة ينبغي أن تسفر عن تركيز العَدلات من 1.5 إلى 6 × 10⁶/mL.
12. تمييع العَدلات بتركيز 1 × 10⁶/mL نهائي مع دببس التي تحتوي على 0.9 مم مجكل₂و 1.9 مم كاكل₂، 5 ملم سكر العنب والبومين المصل البقري 1% مع تعديل إلى 7.3 درجة الحموضة.

3. فلوري مجهرية من العَدلات لايف

1. مكان 200 إلى 400 ميكروليتر من العَدلات (1 × 10⁶/mL) في كل بئر من بولي-L-يسين المغلفة صفيحة الثقافة 12-جيدا. السماح العَدلات على التمسك بالجزء السفلي من الآبار التي تفرخ الخلايا في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
2. تسمية الأحماض النووية مع 1 ميكرومتر واحد من اثنين الحمض النووي الأصباغ وأن البقع في الخلايا مع أغشية سالمة وأن البقع في الخلايا مع الأغشية المسامية (انظر الجدول للمواد)، لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
3. تفعيل العَدلات مع 100 ميكروغرام/مل lipopolysaccharide (LPS) (O55كولاي . B5)، 100 نانومتر phorbol 12-ميريستاتي 13-خلات (سلطة النقد الفلسطينية) كمراقبة إيجابية، أو ما يعادل حجم دببس كمراقبة سلبية لمدة 180 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
4. الحصول على الصور باستخدام التجارة والنقل (الإثارة: 470/22 نانومتر، الانبعاثات: 525/50 نانومتر) وقنوات "الأحمر تكساس" (الإثارة: 585/29 نانومتر، الانبعاثات: 628/32 نانومتر) المعني الفحص المجهري fluorescence في 40 X التكبير في النقاط الزمنية التالية: 30 و 90، 120 و 180 دقيقة.

4-صافي التقييم الكمي، والكشف عن مكونات صافي استخدام الفلورة

1. بعناية وضع كشوف الغطاء بولي-د-يسين مغلفة بقطر 18 ملم في آبار لوحة الثقافة 12-جيدا. قم بتسمية الآبار على نحو ملائم.
2. البذور 100 إلى 200 ميكروليتر من عزلة العَدلات (1 × 10⁶/mL) مباشرة على كوفيرسليبس والسماح العَدلات على التمسك بكشوف الغطاء التي تفرخ الخلايا في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
3. تفعيل العَدلات كما هو موضح في 3.3. تحول دون تشكيل الصافية تقشير العَدلات مع 200 µΜ Cl-أميديني (15 دقيقة، 37 درجة مئوية) قبل التنشيط كما سبق وصف لي et al. ¹³ ضمان إدراج عنصر التحكم السليم مركبة ([دمس]) في التجربة.
4. بعناية إزالة الغطاء كشوف بالملقط غرامة. طبقة ورقة بارافين فيلم أكثر من موقف أنبوبة الاختبار إنشاء الآبار الضحلة ووضع 2 إلى 3 قطرات 4% منهاج عمل بيجين في كل جيدا¹⁰. تسمية الآبار على نحو مناسب ولطف وضع كشوف الغطاء رأسا على عقب على الآبار مملوءة بمنهاج عمل بيجين. السماح للخلايا لتكون ثابتة عند درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة.
5. تغسل الخلايا 3 مرات في دببس لمدة 5 دقائق، بنقلها من بئر واحدة إلى التالية.
6. إذا كان لا يمكن إجراء إيمونولابيلينج بعد وقت قصير من تفعيل العَدلات والتثبيت، السماح بكشوف غطاء أن يكون الهواء المجفف بوضع كشوف غطاء الوجه إلى أعلى على قطعة من الورق امتصاص. يمكن تخزين كشوف غطاء ليصل إلى 1 في الأسبوع الوجه الأعلى في لوحة توسم 12-بئر ثقافة في 4 درجات مئوية حتى إجراء مزيد من التحليل. تغسل الخلايا 3 مرات في دببس لمدة 1 دقيقة باستخدام نفس الأسلوب كما هو موضح في 4.4 قبل المتابعة إلى الخطوة التالية.
7. إلى بيرميبيليزي الخلايا، بلطف وتكمن بكشف الغطاء رأسا على عقب على نسبة انخفاض قدرها 1% NP-40 لمدة 1 دقيقة باستخدام الأسلوب الموصوفة في 4.4. أغسل 3 مرات في دببس لمدة 1 دقيقة على الروك.
8. عشوائياً تعيين كل عينة لعدد واستخدام علامة نقطة الماس لتسمية كوفيرسليبس تبعاً لذلك.
9. إعداد وأطباق بتري الفردي تسمية اصطف مع الفيلم البارافين ومكان 100 إلى 200 ميكروليتر من مصل الماعز 5% على الفيلم (حجب المخزن المؤقت). تكمن في كوفيرسليبس رأسا في المخزن المؤقت حظر. مكان على الروك واحتضانها ح 1 في 37 درجة مئوية.
10. أغسل 3 مرات في دببس لمدة 5 دقائق في الروك.
11. تضعف جسم الأولية (1: 400 الأرنب سيتروليناتيد مكافحة [بولكلونل] هيستون H3 (citH3) في مصل الماعز 5%). احتضان الخلايا في أطباق بتري المسمى اصطف مع الفيلم البارافين. وضع كل كشف الغطاء رأسا على 50 إلى 100 ميكروليتر من الحل جسم المخفف. مكان على الروك واحتضانها ح 1 في 37 درجة مئوية.
12. أغسل 3 مرات في دببس لمدة 5 دقائق في الروك.
13. مترافق مخفف من الجسم المضاد الثانوي إلى فلوروفوري (1: 200) في مصل الماعز 5%. احتضان الخلايا في أطباق بتري المسمى اصطف مع الفيلم البارافين. وضع كل كشف الغطاء رأسا على 50 إلى 100 ميكروليتر من الحل جسم المخفف. مكان على الروك واحتضان ح 1 في 37 درجة مئوية في الظلام.
14. أغسل 3 مرات في دببس لمدة 5 دقائق على الروك في الظلام.
15. للكشف عن ميلوبيروكسيداسي (الخطة الرئيسية للعمليات) المتزامنة اتبع الخطوات التالية لوضع بروتوكول تعديل إيمونولابيلينج مزدوجة كما وصفها لي et al. ¹³
16. احتضان الخلايا في أطباق بتري المسمى اصطف مع الفيلم البارافين. وضع كل كشف الغطاء رأسا على عقب على 100 إلى 200 ميكروليتر من الأرانب 10% مصل تحت هزاز لطيف (بين عشية وضحاها، 4 درجة مئوية، في الظلام).
17. أغسل 3 مرات في دببس لمدة 5 دقائق على الروك في الظلام.
18. احتضان خلايا في 50 ميكروغرام/مل unconjugated الماعز الأرنب المضادة القوات المسلحة البوروندية وشظايا ح 2 في درجة حرارة الغرفة على الروك في الظلام.
19. أغسل 3 مرات في دببس لمدة 5 دقائق على الروك في الظلام.
20. تضعف جسم الأولية (1: 200 أرنب [بولكلونل] الإنسان المضادة الخطة الرئيسية للعمليات جسم) في مصل الماعز 5%. احتضان الخلايا في أطباق بتري المسمى اصطف مع الفيلم البارافين. وضع كل كشف الغطاء رأسا على 50 إلى 100 ميكروليتر من الحل جسم المخفف. مكان على الروك واحتضان ح 1 في 37 درجة مئوية في الظلام.
21. تضعف جسم الثانوي مترافق فلوروفوري في مصل الماعز 5% واحتضان كما هو موضح في 4.8
22. أغسل 3 مرات في دببس لمدة 5 دقائق على الروك في الظلام.
23. وينبغي إعداد ضوابط التدخل باستثناء الاحتضان مع أما الأجسام الأولية في الخطوة الثانية الوسم المناعي.
24. وصمة عار الحمض النووي مع 300 نانومتر من 4 ', 6-دياميديون-2-فينيليندولي، هيدروكلوريد (DAPI) لمدة 5 دقائق في الظلام في درجة حرارة الغرفة.
25. أغسل 3 مرات في دببس لمدة 1 دقيقة على الروك في الظلام.
26. تطبيق قطره (~ 50 ميكروليتر) من مونتانت أنتيفادي إلى شريحة زجاج. اضغط برفق حافة ساترة على ورقة ماصة لإزالة الزائدة المخزن المؤقت قبل تركيب ساترة مع الخلايا رأسا على عقب. وينبغي أن تشكل المتوسطة تصاعد طبقة رقيقة بين ساترة والشريحة الزجاجية. لإزالة فقاعات الهواء، بلطف جداً اضغط على ساترة مع الملقط غرامة.
27. تسمح العينات لعلاج بين عشية وضحاها في الظلام في 4 درجات مئوية. وينبغي أن تتصلب المتوسطة المتصاعدة للتحليل المجهري مع عدسات الغمر. تخزين العينات في 4 درجات مئوية في الظلام.

5-العَدلات خارج الخلية فخ الكمي

1. أعمى منقولة اكتساب وتحليل صور المجهر للظروف التجريبية.
2. استخدام مجهر الأسفار في 40 X التكبير، تأخذ الصور 10 عشوائياً من مناطق مختلفة من كل ساترة في تجربة تحت القنوات الخاصة بكل منها. ضمان الإبقاء زمن التعرض للضوء والسطوع والتباين لكل قناة ثابتاً في الحصول على الصور.
3. تحليل الصور باستخدام البرمجيات المتاحة مثل إيماجيج (المعاهد الوطنية للصحة). التعرف على شبكات استناداً إلى الترجمة المشارك كفدنا، citH3، والخطة الرئيسية للعمليات (الشكل 3 أ، ب). التحديد الكمي للعدد من شبكات والعدلات في 10 حقول عشوائية لكل حالة تجريبية. أرقام شباك صدر يمكن التعبير عنها كنسبة (عدد من شبكات: إجمالي عدد العَدلات) لكل حالة تجريبية.
4. لتقييم آثار المعالجة على التعبير citH3 داخل الخلايا، عد عدد العَدلات مع citH3 داخل الخلايا وعدد العَدلات دون citH3 داخل الخلايا في 10 حقول عشوائية في 40 X التكبير تحت كل القنوات ( 3 الرقم، الأسهم الحمراء). ويمكن التعبير عن التعبير citH3 داخل الخلايا كالنسبة عدد العَدلات مع citH3 داخل الخلايا لعدد العَدلات دون citH3 داخل الخلايا.

النتائج

باستخدام هذا البروتوكول لتصوير الخلايا الحية، يمكن مراقبة المحققين مورفولوجيا النووية وسلامة غشاء البلازما ووجود كفدنا في العَدلات الحية. صبغة خلية نووية إيمبيرمينت البقع الأحماض نويات حمراء في الخلايا التي تحتوي على أغشية الخلايا التالفة. تسميات أخرى صبغ الخلية بيرم...

Discussion

نحن الحاضرين هنا بروتوكولا لمراقبة التغييرات في الإصدار نويات المطابقة وكفدنا في العَدلات الكلاب الحية باستخدام صبغة بيرميانت خلية وصبغة إيمبيرميانت خلية. والميزة الرئيسية لهذا التحليل أنه يسمح للكشف عن تكوين NET في الوقت الحقيقي بالفحص المجهري عالية الدقة في العَدلات العيش دون تثبيت ال...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dextran from Leuconostoc spp.	Sigma	31392	Molecular weight 450,000 – 650,000
Ficoll-Paque PLUS	GE Life Sciences	17144002
Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline	ThermoFisher Scientific	A1285801	With divalent cations
Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline	ThermoFisher Scientific	14190136	Without divalent cations
E. coli O55:B5	InvivoGen
SYTOX Orange Fluorescent Nucleic Acid Stain	ThermoFisher Scientific	S11368	5 mM in DMSO; stains in cells with permeable membranes
SYTO Green 16 Fluorescent Nucleic Acid Stain	ThermoFisher Scientific	S7578	1 mM in DMSO; stains in cells with intact membranes
Surface-Amps NP-40	Pierce	28324
Poly-D-Lysine coated coverslips	neuVitro	H-12-pdl	12 mm diameter
Anti-citrullinated histone H3 antibody	Abcam	Ab5103
Unconjugated goat anti-rabbit Fab fragments	Jackson ImmunoResearch	111-007-003	Specificity: IgG (H+L)
Anti- Myeloperoxidase antibody	Dako	A0398
4,6-Diamidino-2-phenylin (DAPI)	Life Technologies Corporation	D1306