Vitro Köpek nötrofil hücre dışı tuzak oluşumu: Floresans mikroskobu dinamik ve nicel analiz

Özet

Biz tam kan gelen köpek nötrofil yalıtmak ve NET canlı nötrofil floresans mikroskobu kullanılarak oluşumunda görselleştirmek için yöntemleri açıklanmaktadır. Ayrıca açıklanan NET oluşumu ve citrullinated histon H3 ölçmek için iletişim kurallarıdır ayirt mikroskobu kullanarak (citH3) ifade.

Özet

Patojenler istila yanıt olarak, nötrofil histon ve antimikrobiyal proteinler ile dekore edilmiş DNA hücre dışı ağları olan ekstraselüler nötrofil tuzakları (ağlar), serbest bırakın. Aşırı NET formasyonu (NETosis) ve citH3 yayın sepsis sırasında birden fazla organ fonksiyon bozukluğu ve fareler ve insanlar mortalite ile ilişkili ama köpeklerde olan etkileri bilinmemektedir. Burada, tam kan gözlem ve NETosis miktar üzerinden köpek nötrofil yalıtmak için bir teknik açıklar. Lökosit açısından zengin plazma dextran sedimantasyon tarafından oluşturulan, piyasada bulunan yoğunluk gradient ayrılık medya tarafından ayrılmış ve granülosit toplanan hücre sayımı ve Viabilite test. Canlı nötrofil içinde gerçek zamanlı NETosis gözlemlemek için hücre permeant ve hücre impermeant floresan nükleik asit lekeleri nötrofil lipopolysaccharide (LPS) veya phorbol 12-myristate 13-asetat (PMA) tarafından aktive eklenir. Nükleer Morfoloji ve NET oluşumu değişiklikler zamanla floresans mikroskobu tarafından gözlenir. Vitro NETosis daha fazla co-değiştirilmiş bir çift-immunolabelling iletişim kuralı kullanılarak colocalization tarafından boş hücre DNA'ın (cfDNA), myeloperoxidase (MPO) ve citrullinated histon H3 (citH3) ile karakterizedir. Objektif olarak NET oluşumu ve citH3 ifade floresans mikroskobu, kullanarak ölçmek için ağlar ve citH3 pozitif hücreleri mevcut yazılım kullanarak kör bir şekilde sayılabilir. Bu teknik NETosis geçmesi köpek nötrofil vitro kapasitesini değerlendirmek için belirli bir tahlil olduğunu.

Giriş

Nötrofil kısa ömürlü granülosit patojenler istila karşı ilk savunma sorumlu vardır. Nötrofiller, enfeksiyon, siteye işe mikroorganizmalar tarafından fagositoz, degranulation ve reaktif oksijen türleri (ROS)¹nesil ortadan kaldırmak. Bakteri veya endotoxins huzurunda, nötrofil yayın nötrofil hücre dışı tuzakları (ağlar), hücre dışı kromatin oluşan histon ve elastase ve myeloperoxidase gibi taneli proteinler (MPO)²süslenmiş. NETs vazgeçilmez antimikrobiyal özellikleri olsa da, deneysel ve klinik kanıt artan hevesli NET oluşumu sepsis sırasında birden fazla organ fonksiyon bozukluğu ve ölüm^3,4' e^, neden olabilir gösteriyor ^{5 , 6}.

NETs köpeklerde benzer bir patofizyolojik rol oynayabilir çünkü önlemek veya azaltmak NET oluşumu tedavi müdahaleler roman tedavi stratejileri septik hayvanlarda olarak hizmet verebilir. Bu nedenle, güvenilir bir teknik NETosis ve köpeklerde NET bileşenler ölçmek ve değerlendirmek için bir ihtiyaç vardır. NET bileşenleri boş hücre DNA (cfDNA) ve oluşturarlar dahil olmak üzere daha önce köpek nötrofil ve plazma klinik köpekler^7,8,9değerlendirilir. Floresans deneyleri kullanarak, Goggs ve Letendre septik köpeklerin cfDNA yüksek düzeyde sağlıklı köpekler⁸' den vardır bulundu. Bu teknikler son derece objektif ve nicel olmakla birlikte, onlar NETosing nötrofil dışında nekrotik hücrelerden elde edilebilir bu yana oluşturarlar ve cfDNA NETosis işaretleri olarak non-spesifik ölçümdür. Burada floresans mikroskobu canlı NETosing nötrofil davranışları incelemek için kullanan bir tekniğini tanımlamak. Biz de subjektif ağlar ve bileşenlerinin MPO ve citH3 köpek nötrofil¹⁰gibi ölçmek için çift-immunolabeling kullanan bir değiştirilmiş Protokolü ayrıntı.

Protokol

Tüm yöntem tanımlamak burada kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi Kaliforniya Üniversitesi Davis tarafından kabul edildi (protokol numarası: 18338).

1. kan toplama

1. 10 mL kan ya 21 G iğne şırınga aspirasyon tarafından kullanarak sefalik veya şah damarı çizin.
2. Aşırı kesme stres önlemek için kan sodyum heparin (75 USP) içeren tüpler aktarmadan önce iğneyi şırıngadan çıkarın. Tüpler birkaç kez yavaşça tersine çevirin yeterli antikoagülan ve kan karıştırma sağlamak için. Pıhtı veya kırmızı hücre toplamları kanıtı için buza örnekleri yerleştirmeden önce kontrol edin.

2. nötrofil yalıtım

1. Anticoagulated kan ile buz gibi Dubecco'nın fosfat tamponlu tuz (DPBS) (pH 7.4, divalent katyonlar olmadan) eşit bir güç oranında seyreltin. Seyreltilmiş kan 8 mL 25 mL % 3 dextran (üzerinden % 0,9 sodyum klorür çözümde çözünmüş Leuconostoc spp.) içeren bir 50 mL polipropilen konik tüp içine aktarın. Tüp dik toplama ve eritrositler sedimantasyon izin vermek 30 dakika oda sıcaklığında yerleştirin.
2. Dikkatle lökosit açısından zengin plazma (Şekil 1) 5 mL 5 mL de bir 14 mL polipropilen yuvarlak alt tüp yoğunluğu degrade medyada üzerine katman. 2 çözümleri¹¹karıştırmak değil dikkatli olun.
3. 400 x g hızlanma/yavaşlama (A/D) ayarlamak için 0 (fren yok), oda sıcaklığında 30 dakika ile de tüpler santrifüj kapasitesi.
4. 5 mL kullanarak serolojik damlalıklı plazma ve periferik kan mononükleer hücre (PBMC) katmanları (Şekil 1) atlayarak granülosit hücre katmanı toplamak. Yeni damlalıklı kirlenme en aza indirmek için her zaman kullanın.
5. 4-6 mL 50 mL polipropilen konik tüp içinde polymorphnuclear (PMN) hücre tabakasının bir yer. Eritrosit toplamları az miktarda PMN katmanla birlikte Aspire beri 1 mL serolojik damlalıklı yavaşça tüp alt kısmında yerleşmiş eritrosit toplamları kaldırmak için kullanın.
6. 20 mL soğuk Ultrasaf Su ile kalan eritrositler parçalayıcı. 30-60 için birden çok kez tüpü yavaşça tersine çevirin s yeterli eşit bir buz gibi %1.8 sodyum klorür çözeltisi hacmi eklemeden önce lysing emin olmak için.
7. 112 x g 4 ° C'de 10 dakika, A/D 0 olarak ayarlanırsa, santrifüj kapasitesi.
8. Bu Pelet kırmızı görüntülenirse eritrosit lizis adımı tekrarlayın. Süpernatant dikkatle ile serolojik damlalıklı atın ve yavaşça Pelet DPBS (5 mM dekstroz, 0.9 mM MgCl₂, 1.9 mM CaCl₂ ve %1 sığır serum albümin, pH 7.3) 100 µL içinde resuspend. Tüm resuspended hücreleri birleştirmek ve buza koyun.
9. Bir otomatik hücre Çözümleyicisi kullanan bir hücre sayısı gerçekleştirmek ve bir hemasitometre tarafından Kont doğrulayın. Gerekirse, bir cytocentrifuge (1000 rpm, 5 min) kullanarak bir cam slayt PMNs konsantre ve nötrofil hücrelerinin toplam sayısı dışında sayısını sayarak nötrofil yüzdesini belirlemek.
10. Strober ve ark. tarafından belirtildiği gibi bir trypan mavi dışlama test gerçekleştirerek nötrofil canlılığı belirlemek ¹² başarılı yalıtım bir canlılık % 100 95 verim ve nötrofil % 95'den büyük olmalıdır.
11. Nötrofil konsantrasyonu yüzde canlılığı ve yüzde nötrofil ile toplam hücre sayısı çarpılarak belirler. Başarılı yalıtım bir konsantrasyon nötrofil 6 x 10⁶/mL için 1.5 ile verim.
12. 1 x 10⁶/mL son bir konsantrasyon için nötrofil 7,3 için ayarlanır pH 5 mM dekstroz, 0.9 mM MgCl₂, 1.9 mM CaCl₂ve %1 sığır serum albümin içeren DPBS ile oranında seyreltin.

3. Floresan Mikroskobu canlı nötrofil

1. Yer 200'e 400 μL nötrofil (1 x 10⁶/mL) bir poli-L-lizin her kuyuya 12-şey kültür plaka kaplı. Nötrofil kuyu dibine 30 dk 37 ° C'de hücreler kuluçka tarafından bağlı kalmak izin verir.
2. Nükleik asitler iki nükleik asit boyalar biri, bir o sağlam Membranlar ile hücrelerdeki lekeleri ve bir oda sıcaklığında 10 dakika için (bkz. Tablo reçetesi) geçirgen Membranlar ile hücrelerdeki lekeleri 1 mikron ile etiketleyin.
3. Nötrofil 100 μg/mL lipopolysaccharide (LPS) (E. coli O55. ile etkinleştirmek B5), 100 nM phorbol 12-myristate 13-asetat (PMA) olumlu denetim veya DPBS olarak 37 ° C'de 180 dk için negatif kontrol eşdeğer hacmi olarak
4. GFP kullanarak görüntüleri (uyarma: 470/22 nm, emisyon: 525/50 nm) ve Texas kırmızı kanalları (uyarma: 585/29 nm, emisyon: 628/32 nm) aşağıdaki zaman noktalarda 40 X büyütme, floresans mikroskobu Tarih: 30, 90, 120 ve 180 dk.

4. NET miktar ve NET bileşenler ayirt kullanarak tespiti

1. Dikkatle 18 mm çap Poly-D-lizin kaplı kapak paket fişi 12-şey kültür plaka kuyu yerleştirin. Kuyuları uygun şekilde etiketleyin.
2. Tohum 100-200 μL, nötrofil (1 x 10⁶/mL) doğrudan coverslips izole ve nötrofil kapak irsaliyeleri için 30 dk 37 ° C'de hücreler kuluçka tarafından bağlı kalmak izin.
3. Nötrofil 3.3 içinde açıklandığı gibi etkinleştirin. NET oluşumu ile 200 µΜ nötrofil pretreating tarafından inhibe Cl-amidine (15 dk, 37 ° C) daha önce Li vd tarafından açıklandığı gibi harekete geçirmek önce ¹³ uygun araç kontrol (DMSO) denemeye dahil emin olun.
4. Dikkatli bir şekilde kapak paket fişi ile iyi forseps çıkarın. Parafin film sayfası sığ kuyular oluşturmak ve 2-3 damla % 4'lük yerleştirmek için bir test tüpü sandalyesinden katman her iyi¹⁰PFA. Kuyuları uygun şekilde etiketleyin ve yavaşça kapak paket fişi ters İngiltere'de yılın dolu kuyu yatıyordu. Hücreleri 20 dk için oda sıcaklığında düzeltilmesi için izin.
5. Hücreleri DPBS 5 dk, 3 kez bir kuyudan diğerine taşıyarak yıkayın.
6. İmmunolabelling kısa bir süre sonra nötrofil harekete geçirmek ve fiksasyon gerçekleştirilemez, kapak absorbans kağıda kapak paket fişi yüz-up yerleştirerek kuru hava olmaya makbuzları olanak verir. Kapak paket fişi en fazla 1 hafta yüz-up 4 ° C'de bir etiketli 12-şey kültür plaka için daha fazla çözümleme kadar saklanabilir. Hücreleri 3 kez DPBS için 1dk 4.4 sonraki adıma devam etmeden önce açıklandığı gibi aynı tekniği kullanarak yıkayın.
7. Hücreleri permeabilize için yavaşça kapak notu baş aşağı bir damla %1 4.4 içinde NP-40 için 1dk tekniği kullanarak açıklanan yatıyordu. 3 kez DPBS içinde bir rocker üzerinde 1 dakika yıkayın.
8. Rastgele her örnek için bir numara atamak ve bir elmas noktası işaretçisi coverslips buna göre etiketlemek için kullanın.
9. Hazırlamak ve etiket bireysel Petri yemekler parafin film ile kaplı ve 100-200 μL %5 keçi serum (arabellek kütük parçası) film üzerine yerleştirin. Coverslips baş aşağı engelleme arabellek üzerinde yatıyordu. Bir rocker üzerinde yerleştirin ve 37 ° C'de 1 h için kuluçkaya
10. 3 kez DPBS içinde bir rocker üzerinde 5 dakika yıkayın.
11. Birincil antikor seyreltik (1: 400 tavşan poliklonal anti-citrullinated histon H3 (citH3) % 5 keçi serumda). Hücreleri etiketli Petri yemeklerinde parafin film ile kaplı kuluçkaya. Her kapak notu baş aşağı seyreltilmiş antikor çözüm 50 ila 100 μL üzerinde yatıyordu. Bir rocker üzerinde yerleştirin ve 37 ° C'de 1 h için kuluçkaya
12. 3 kez DPBS içinde bir rocker üzerinde 5 dakika yıkayın.
13. Seyreltik ikincil antikor %5 keçi serumda fluorophore (1: 200) için Birleşik. Hücreleri etiketli Petri yemeklerinde parafin film ile kaplı kuluçkaya. Her kapak notu baş aşağı seyreltilmiş antikor çözüm 50 ila 100 μL üzerinde yatıyordu. Bir rocker üzerinde yerleştirin ve karanlıkta 37 ° C'de 1 h kuluçkaya.
14. 3 kez DPBS içinde karanlık bir rocker üzerinde 5 dakika yıkayın.
15. Myeloperoxidase (MPO) eşzamanlı tespiti için Li vd tarafından açıklandığı gibi değiştirilmiş Çift Kişilik immunolabeling iletişim kuralı için aşağıdaki adımları izleyin ¹³
16. Hücreleri etiketli Petri yemeklerinde parafin film ile kaplı kuluçkaya. Her kapak notu baş aşağı (bir gecede, 4 ° C, karanlıkta) hafif sallanan altında serum % 10 tavşan 100-200 μL üzerinde yatıyordu.
17. 3 kez DPBS içinde karanlık bir rocker üzerinde 5 dakika yıkayın.
18. Karanlıkta bir rocker üzerinde oda sıcaklığında 2 h için anti-tavşan Fab parçaları 50 μg/mL çekimsiz keçi hücrelerde kuluçkaya.
19. 3 kez DPBS içinde karanlık bir rocker üzerinde 5 dakika yıkayın.
20. Birincil antikor (1: 200 tavşan poliklonal anti-insan MPO antikor) % 5 keçi serumda sulandırmak. Hücreleri etiketli Petri yemeklerinde parafin film ile kaplı kuluçkaya. Her kapak notu baş aşağı seyreltilmiş antikor çözüm 50 ila 100 μL üzerinde yatıyordu. Bir rocker üzerinde yerleştirin ve karanlıkta 37 ° C'de 1 h kuluçkaya.
21. İkincil antikor %5 keçi serumda fluorophore için Birleşik sulandırmak ve 4,8 içinde açıklandığı gibi kuluçkaya
22. 3 kez DPBS içinde karanlık bir rocker üzerinde 5 dakika yıkayın.
23. Parazit kontrolleri ile her iki birincil antikorlar bağışıklık etiketleme ikinci adımda kuluçka hariç tutarak hazırlanmalıdır.
24. DNA ile 300 leke nM 4', 6-Diamidion-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI) içinde belgili tanımlık karanlık oda sıcaklığında 5 min için.
25. 3 kez karanlık bir rocker üzerinde 1 dk DPBS içinde yıkayın.
26. Antifade mountant bir cam slayt üzerine bir damla (~ 50 μl) uygulanır. Yavaşça ters coverslip hücreleri ile montaj önce aşırı arabellek kaldırmak için bir emici kağıt üzerine coverslip kenarına dokunun. Montaj orta coverslip ve cam slayt arasındaki ince bir tabaka oluşturmalıdır. Hava kabarcıkları kaldırmak için çok yavaşça coverslip üzerinde iyi forseps ile tuşuna basın.
27. Örnekleri 4 ° C'de karanlık gecede tedavi etmek izin Montaj orta daldırma lensler ile mikroskopik analiz için sertleşmesine. Örnekleri karanlıkta 4 ° C'de depolayın.

5. nötrofil hücre dışı tuzak miktar

1. Edinme ve deneysel koşullar mikroskop resimlere analiz operator(s) kör.
2. Bir floresan mikroskop 40 X büyütme oranında kullanarak, 10 resim Rastgele her coverslip bir deneyde ilgili kanalları altında farklı bölgelerinden al. Çekim hızı, parlaklık ve kontrast her kanal görüntüleri edinimi tutarlı tutulmasını sağlamak.
3. Mevcut yazılım gibi ImageJ (NIH) kullanarak görüntüleri analiz. CfDNA, citH3 ve MPO (Şekil 3A, B) Co yerelleştirilmesini tabanlı ağlar tanımlamak. Ağlar ve deneysel her koşul için 10 rasgele alan nötrofil sayısı ölçmek. Yayımlanan ağlar numaraları bir oranı olarak ifade (ağlar sayısı: nötrofil sayısı) deneysel her koşul için.
4. Hücre içi citH3 ifade tedavi etkisini değerlendirmek için nötrofil ile hücre içi citH3 ve nötrofil hücre içi citH3 ilgili kanalları ( altında 40 X büyütme, 10 rasgele alan olmadan sayısını saymak Şekil 3, kırmızı oklar). Hücre içi citH3 ifade ile hücre içi citH3 nötrofil hücre içi citH3 olmadan sayıda nötrofil sayısı oranı olarak ifade edilebilir.

Sonuçlar

Canlı hücre görüntüleme bu iletişim kuralını kullanan, müfettişler nükleer morfoloji, plazma membran bütünlüğü ve yaşam nötrofil cfDNA varlığı gözlemleyebilirsiniz. Bir hücre impermeant nükleer boya çekirdek asitleri kırmızı hücrelerin hasarlı hücre zarı ile lekeleri. Başka bir hücre permeant boya, bozulmamış plazma membran ile canlı hücrelerde hücre içi nükleik asitler Etiketler. Kendi tedavileri ne olursa olsun tüm bozulmamış nötrofil yeşil ...

Tartışmalar

Burada değişmek içinde çekirdek uyum ve cfDNA serbest bırakmak içinde yaşayan köpek nötrofil hücre permeant boya ve bir hücre impermeant boya kullanarak gözlemlemek için bir protokol mevcut. Bu tahlil en büyük avantajı bu NET oluşumu gerçek zamanlı algılama için yüksek çözünürlüklü mikroskobu canlı nötrofil hücre fiksasyon, olmadan tarafından bu nedenle, vitro NET oluşumu gözlemlemek için basit ve değerli bir araç sağlayan sağlanmıştır. Bu tahlil NET bileşenler tespiti ...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dextran from Leuconostoc spp.	Sigma	31392	Molecular weight 450,000 – 650,000
Ficoll-Paque PLUS	GE Life Sciences	17144002
Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline	ThermoFisher Scientific	A1285801	With divalent cations
Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline	ThermoFisher Scientific	14190136	Without divalent cations
E. coli O55:B5	InvivoGen
SYTOX Orange Fluorescent Nucleic Acid Stain	ThermoFisher Scientific	S11368	5 mM in DMSO; stains in cells with permeable membranes
SYTO Green 16 Fluorescent Nucleic Acid Stain	ThermoFisher Scientific	S7578	1 mM in DMSO; stains in cells with intact membranes
Surface-Amps NP-40	Pierce	28324
Poly-D-Lysine coated coverslips	neuVitro	H-12-pdl	12 mm diameter
Anti-citrullinated histone H3 antibody	Abcam	Ab5103
Unconjugated goat anti-rabbit Fab fragments	Jackson ImmunoResearch	111-007-003	Specificity: IgG (H+L)
Anti- Myeloperoxidase antibody	Dako	A0398
4,6-Diamidino-2-phenylin (DAPI)	Life Technologies Corporation	D1306