In Vitro Formação canina neutrófilos extracelular armadilha: Análise dinâmica e quantitativa por microscopia de fluorescência

Resumo

Podemos descrever métodos para isolar caninos neutrófilos do sangue inteiro e visualizar a formação líquida em neutrófilos ao vivo usando microscopia de fluorescência. Também descritos são protocolos para quantificar a formação líquida e citrulinado histona H3 (citH3) expressão usando microscopia de imunofluorescência.

Resumo

Em resposta à invasão de patógenos, os neutrófilos liberar neutrófilos armadilhas extracelulares (redes), que são redes extracelulares de DNA decorado com histonas e proteínas antimicrobianas. Formação excessiva de líquido (NETosis) e liberação de citH3 durante a sepse está associada a vários órgãos e mortalidade em ratos e seres humanos, mas suas implicações em cães são desconhecidas. Aqui, descrevemos uma técnica para isolar caninos neutrófilos do sangue inteiro para observação e quantificação de NETosis. Plasma rico em leucócitos, gerado pela sedimentação de dextrano, é separado por meios de separação gradiente de densidade comercialmente disponíveis e granulócitos coletados para contagem e testes de viabilidade celular. Para observar em tempo real NETosis em neutrófilos ao vivo, celular permeant e celular impermeant fluorescente do ácido nucleico manchas são adicionadas ao neutrófilos ativados por lipopolissacarídeo (LPS) ou phorbol myristate 12 13-acetato (PMA). Alterações na morfologia nuclear e formação líquida são observadas ao longo do tempo por microscopia de fluorescência. In vitro NETosis caracteriza-se ainda mais por co-colocalization do DNA de células livres (cfDNA), mieloperoxidase (MPO) e citrulinado histona H3 (citH3) usando um protocolo duplo-encontrava modificado. Para quantificar objectivamente formação líquida e citH3 expressão usando microscopia de fluorescência, redes e células citH3-positivo são quantificadas de forma cega usando software disponível. Esta técnica é um ensaio específico para avaliar em vitro capacidade dos neutrófilos caninos para submeter-se NETosis.

Introdução

Os neutrófilos são granulócitos curta duração responsáveis para a defesa inicial contra invasão de agentes patogénicos. Neutrófilos, recrutados para o local da infecção, eliminam microorganismos pela fagocitose, degranulação e geração de oxigênio reativo espécies (ROS)¹. Na presença de bactérias ou Endotoxinas, neutrófilos liberação dos neutrófilos extracelular armadilhas (redes), composto de cromatina extracelular decorado com histonas e granulares proteínas como elastase e mieloperoxidase (MPO)². Embora os NETs têm propriedades antimicrobianas indispensáveis, aumentar as evidências experimentais e clínicas sugere que excesso de zelo formação líquida durante a sepse pode levar a vários órgãos disfunção e morte^{3,4, 5 , 6}.

Porque redes podem desempenhar um papel fisiopatológico semelhante em cães, intervenções terapêuticas que impedem ou diminuem a formação de líquido podem servir como estratégias de tratamento romance em animais sépticos. Por esta razão, há uma necessidade de uma técnica confiável avaliar e quantificar os componentes líquidos em cães e NETosis. NET componentes incluindo DNA sem célula (cfDNA) e os nucleossomas anteriormente foram avaliadas em neutrófilos caninos e plasma de cães clínico^7,8,9. Utilizando ensaios de fluorescência, Goggs e Letendre encontraram que cães sépticos têm níveis mais elevados de cfDNA que cães saudáveis⁸. Embora essas técnicas sejam altamente objetiva e quantitativa, medição de cfDNA e os nucleossomas como marcadores de NETosis é específico já que eles podem ser derivados de células necróticas diferente NETosing neutrófilos. Aqui nós descrevemos uma técnica que utiliza a microscopia de fluorescência para examinar os comportamentos dos neutrófilos de NETosing ao vivo. Também detalhamos um protocolo modificado usando duplo-immunolabeling para quantificar subjetivamente redes e seus componentes como MPO e citH3 em canino neutrófilos¹⁰.

Protocolo

Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo Comitê de uso da Universidade da Califórnia, Davis e institucional Cuidado Animal (número de protocolo: 18338).

1. coleta de sangue

1. Retire 10 mL de sangue ou a veia cefálica ou jugular, usando uma agulha 21G por aspiração de seringa.
2. Para evitar excessiva tensão de cisalhamento, retire a agulha da seringa antes de transferir o sangue em tubos contendo heparina de sódio (USP 75). Inverta suavemente os tubos algumas vezes para garantir a mistura adequada de anticoagulante e sangue. Seleção de provas de coágulos ou agregados de células vermelhas, antes de colocar as amostras no gelo.

2. neutrófilo isolamento

1. Dilua o sangue anticoagulado com um volume igual de fosfato salino do gelada Dubecco (DPBS) (pH 7,4, sem cátions divalentes). Transferência de 8 mL de sangue diluído em um tubo cónico polipropileno de 50 mL contendo 25 mL de dextrano de 3% (a partir de Leuconostoc spp. dissolvido em solução de cloreto de sódio 0,9%). Coloca o tubo na posição vertical em temperatura ambiente por 30 min permitir a agregação e sedimentação de eritrócitos.
2. Cuidadosamente da camada em cima de 5 mL de mídia gradiente de densidade em um tubo de fundo redondo de polipropileno 14 mL 5 mL de plasma rico em leucócitos (Figura 1). Tenha cuidado para não misturar as 2 soluções¹¹.
3. Centrifuga os tubos a 400 x g com aceleração/desaceleração (A/D) definido como 0 (sem freio) por 30 min à temperatura ambiente.
4. Usando um 5 mL pipeta sorológica recolher a camada de células de granulócitos por ignorar o plasma e camadas de células mononucleares (PBMC) de sangue periférico (Figura 1). Use uma outra pipeta cada vez para minimizar a contaminação.
5. Lugar de 4 a 6 mL da camada de células polymorphnuclear (PMN) em um tubo cônico polipropileno de 50 mL. Desde que uma pequena quantidade de agregados de eritrócitos pode ser aspirada juntamente com a camada PMN, use uma pipeta sorológica 1ml para remover suavemente os agregados de eritrócitos que são liquidados na parte inferior do tubo.
6. Lise as hemácias restantes com 20 mL de água ultrapura fria. Inverter suavemente o tubo várias vezes para 30 a 60 s para garantir a adequada lise antes de adicionar um volume igual de solução de cloreto de sódio 1,8% gelada.
7. Centrifugar a 112 x g por 10 min a 4 ° C, A/D definido como 0.
8. Repita a etapa de lise de eritrócitos se esta pelota aparece vermelha. Descartar o sobrenadante cuidadosamente com uma pipeta sorológica e suavemente resuspenda o pellet em 100 µ l de DPBS (dextrose 5 mM, 0.9 mM MgCl₂, 1,9 mM CaCl₂ e 1% albumina de soro bovino, pH 7,3). Combinar todas as células de ressuspensa e colocar no gelo.
9. Realizar uma contagem de células usando um analisador de célula automatizada e verificar a contagem por um hemocytometer. Se necessário, concentrar PMN numa lâmina de vidro usando um cytocentrifuge (1.000 rpm, 5 min) e determinar a porcentagem de neutrófilos pela contagem do número de neutrófilos, o número total de células.
10. Determinar a viabilidade dos neutrófilos através da realização de um teste de exclusão de trypan azul conforme descrito por Strober et al . ¹² sucesso isolamento deve render uma viabilidade de 95 a 100% e neutrófilos devem ser superiores a 95%.
11. Determine a concentração de neutrófilos multiplicando-se a contagem total de células com a viabilidade de porcentagem e neutrófilos por cento. Isolamento de sucesso deve produzir uma concentração de neutrófilos de 1,5 a 6 x 10⁶/mL.
12. Dilua os neutrófilos para uma concentração final de 1 x 10⁶/mL com DPBS contendo dextrose 5 mM, 0.9 mM MgCl₂, 1,9 mM CaCl₂e 1% de albumina de soro bovino com pH ajustado para 7,3.

3. fluorescente microscopia de neutrófilos ao vivo

1. Lugar de 200 a 400 μL de neutrófilos (1 x 10⁶/mL) em cada poço de um poli-L-lisina revestido chapa 12-poços de cultura. Permitir que os neutrófilos aderir ao fundo dos poços, incubando-se as células a 37 ° C por 30 min.
2. Rotular os ácidos nucleicos com 1 μM de um dos dois corantes ácidos nucleicos, que manchas nas células com membranas intactas e que as manchas nas células com membranas permeáveis (ver Tabela de materiais), durante 10 minutos à temperatura ambiente.
3. Ativar os neutrófilos com 100 lipopolissacarídeo μg/mL (LPS) (e. coli O55. B5), 100 nM phorbol myristate 12 13-acetato (PMA) como controle positivo, ou quantidade equivalente de DPBS como controle negativo para 180 min a 37 ° C.
4. Adquirir imagens usando o GFP (excitação: 470/22 nm, emissão: 525/50 nm) e vermelho Texas canais (excitação: 585/29 nm, emissão: 628/32 nm) na microscopia de fluorescência ampliação de 40 X nos seguintes pontos tempo: 30, 90, 120 e 180 min.

4. líquido de quantificação e detecção de componentes de rede usando a imunofluorescência

1. Cuidadosamente coloque 18 mm diâmetro poli-D-lisina revestido lamínulas em poços de uma placa de cultura 12-poços. Rotule os poços adequadamente.
2. Semente 100 a 200 μL de isolado de neutrófilos (1 x 10⁶/mL) diretamente sobre as lamelas e permitir que os neutrófilos a aderir as lamínulas incubando-se as células a 37 ° C por 30 min.
3. Ative os neutrófilos, conforme descrito no ponto 3.3. Inibir a formação de líquido por pretreating neutrófilos com 200 µΜ Cl-amidina (15 min, a 37 ° C) antes da ativação, conforme descrita por Li et al. ¹³ certifique-se de que o controle do veículo adequado (DMSO) é incluído no experimento.
4. Remova cuidadosamente a lamínulas com pinça fina. Uma folha de película de parafina de camada mais um stand de tubo de ensaio para criar poços rasos e coloque 2 a 3 gotas de 4% PFA em cada bem¹⁰. Rotular os poços adequadamente e delicadamente Coloque as lamínulas de cabeça para baixo para os poços de PFA-cheia. Permitir que as células a fixar-se em temperatura ambiente por 20 min.
5. Lave as células 3 vezes em DPBS por 5 min, movendo-as de um poço para a próxima.
6. Se encontrava não pode ser executada logo após a fixação e a ativação de neutrófilos, permita lamínulas ser ar secado colocando as lamínulas viradas para cima em um pedaço de papel de absorvência. Lamínulas podem ser armazenadas por até 1 semana viradas para cima em uma placa de cultura de 12 poços rotulados a 4 ° C até posterior análise. Lave as células 3 vezes em DPBS por 1 min, usando a mesma técnica, conforme descrito em 4.4 antes de prosseguir para a próxima etapa.
7. Para permeabilize células, delicadamente encostar o deslizamento da tampa de cabeça para baixo em uma queda de 1%, NP-40 para 1 min usando a técnica descrita em 4.4. Lavar 3 vezes em DPBS por 1 min em uma cadeira de balanço.
8. Aleatoriamente, atribuir cada amostra para um número e use um marcador de ponto de diamante para rotular as lamelas em conformidade.
9. Preparar e pratos de Petri individuais etiqueta forrado com película de parafina e coloque 100 a 200 μL de 5% de soro de cabra no filme (tampão de bloqueio). Coloque as lamelas de cabeça para baixo sobre o tampão de bloqueio. Coloque em uma cadeira de balanço e incubar durante 1 h a 37 ° C.
10. Lavar 3 vezes em DPBS por 5 min em uma cadeira de balanço.
11. Diluir o anticorpo primário (1: 400 histona de polyclonal anticitrulinado coelho H3 (citH3) em 5% de soro de cabra). Incube as células em pratos de Petri rotulado forrado com película de parafina. Coloque cada lamela de cabeça para baixo em 50 a 100 μL da solução diluída de anticorpo. Coloque em uma cadeira de balanço e incubar durante 1 h a 37° C.
12. Lavar 3 vezes em DPBS por 5 min em uma cadeira de balanço.
13. Diluído anticorpo secundário conjugado com um fluoróforo (1: 200), no soro de cabra de 5%. Incube as células em pratos de Petri rotulado forrado com película de parafina. Coloque cada lamela de cabeça para baixo em 50 a 100 μL da solução diluída de anticorpo. Coloque em uma cadeira de balanço e incubar 1 h a 37 ° C, no escuro.
14. Lavar 3 vezes em DPBS por 5 min em uma cadeira de balanço no escuro.
15. Para a deteção simultânea da mieloperoxidase (MPO), siga as etapas a seguir para um protocolo de immunolabeling duplo modificado conforme descrito por Li et al. ¹³
16. Incube as células em pratos de Petri rotulado forrado com película de parafina. Coloque cada lamela de cabeça para baixo em 100 a 200 μL de coelho 10% soro sob suave balançar (durante a noite, 4 ° C, no escuro).
17. Lavar 3 vezes em DPBS por 5 min em uma cadeira de balanço no escuro.
18. Incube a células em cabra de unconjugated 50 μg/mL anticoelho Fab fragmentos para 2 h à temperatura ambiente em um roqueiro no escuro.
19. Lavar 3 vezes em DPBS por 5 min em uma cadeira de balanço no escuro.
20. Dilua o anticorpo primário (1: 200 coelho anti-humano MPO anticorpo polyclonal) no soro de cabra de 5%. Incube as células em pratos de Petri rotulado forrado com película de parafina. Coloque cada lamela de cabeça para baixo em 50 a 100 μL da solução diluída de anticorpo. Coloque em uma cadeira de balanço e incubar 1 h a 37° C, no escuro.
21. Diluir o anticorpo secundário conjugado com um fluoróforo em 5% de soro de cabra e incubar conforme descrito em 4,8
22. Lavar 3 vezes em DPBS por 5 min em uma cadeira de balanço no escuro.
23. Controles de interferência devem ser preparadas por excluindo incubação com ambos os anticorpos primários na segunda etapa imune-rotulagem.
24. Mancha de DNA com 300 nM de 4', 6-Diamidion-2-Phenylindole, dicloridrato (DAPI) por 5 min no escuro à temperatura ambiente.
25. Lavar 3 vezes em DPBS por 1 min em uma cadeira de balanço no escuro.
26. Aplique uma gota (~ 50 μl) de antidesgaste para montagem numa lâmina de vidro. Bata levemente a extremidade da lamela em um papel absorvente para remover o tampão em excesso antes de montar a lamela com as células de cabeça para baixo. O meio de montagem deve formar uma fina camada entre a lamínula e a lâmina de vidro. Para remover as bolhas de ar, pressione suavemente na lamela com pinça fina.
27. Permitir que as amostras curar durante a noite, no escuro a 4 ° C. O meio de montagem deve endurecer por análise microscópica com lentes de imersão. Armazenar as amostras em 4 ° C, no escuro.

5. neutrófilos extracelular armadilha quantificação

1. Cego aos operadores adquirir e analisar as imagens do microscópio para condições experimentais.
2. Usando um microscópio de fluorescência na ampliação de X 40, com 10 imagens aleatoriamente de diferentes regiões de cada lamela em um experimento sob os respectivos canais. Certifique-se de que o tempo de exposição, brilho e contraste de cada canal são mantidos consistentes em toda a aquisição de imagens.
3. Analise as imagens usando o software disponível como ImageJ (NIH). Identifica redes com base na localização co de cfDNA, citH3 e MPO (Figura 3A, B). Quantificar o número de redes e neutrófilos em 10 campos aleatórios para cada condição experimental. Números de redes lançado pode ser expressa como uma razão (número de redes: número total de neutrófilos) para cada condição experimental.
4. Para avaliar os efeitos do tratamento na expressão intracelular citH3, contar o número de neutrófilos com citH3 intracelular e número de neutrófilos sem citH3 intracelular em 10 campos aleatórios na ampliação de X 40 sob os respectivos canais ( Figura 3, setas vermelhas). Expressão citH3 intracelular pode ser expressa como a relação entre número de neutrófilos com intracelular citH3 para o número de neutrófilos sem citH3 intracelular.

Resultados

Usando este protocolo de imagem de célula viva, os investigadores podem observar a morfologia nuclear, integridade da membrana plasmática e presença de cfDNA na vida de neutrófilos. Um corante nuclear impermeant de célula manchas vermelho de ácidos núcleos em células com as membranas das células danificadas. Célula-permeant outro corante, rótulos os ácidos nucleicos intracelular em células vivas com membranas de plasma intactas. Todos os neutrófilos intactos, independentemen...

Discussão

Apresentamos aqui um protocolo para observar as alterações no lançamento de conformação e cfDNA núcleos na vida canina neutrófilos usando um corante permeant célula e um corante impermeant célula. A principal vantagem deste teste é que ela permite detecção em tempo real de formação líquida por microscopia de alta resolução em neutrófilos ao vivo sem fixação da pilha, portanto, fornecendo uma ferramenta simples e valiosa para a observação em vitro NET formação. Desde que este ensaio não r...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dextran from Leuconostoc spp.	Sigma	31392	Molecular weight 450,000 – 650,000
Ficoll-Paque PLUS	GE Life Sciences	17144002
Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline	ThermoFisher Scientific	A1285801	With divalent cations
Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline	ThermoFisher Scientific	14190136	Without divalent cations
E. coli O55:B5	InvivoGen
SYTOX Orange Fluorescent Nucleic Acid Stain	ThermoFisher Scientific	S11368	5 mM in DMSO; stains in cells with permeable membranes
SYTO Green 16 Fluorescent Nucleic Acid Stain	ThermoFisher Scientific	S7578	1 mM in DMSO; stains in cells with intact membranes
Surface-Amps NP-40	Pierce	28324
Poly-D-Lysine coated coverslips	neuVitro	H-12-pdl	12 mm diameter
Anti-citrullinated histone H3 antibody	Abcam	Ab5103
Unconjugated goat anti-rabbit Fab fragments	Jackson ImmunoResearch	111-007-003	Specificity: IgG (H+L)
Anti- Myeloperoxidase antibody	Dako	A0398
4,6-Diamidino-2-phenylin (DAPI)	Life Technologies Corporation	D1306