In Vitro Formación de la trampa extracelular neutrófilo canino: Análisis dinámico y cuantitativo por microscopía de fluorescencia

Resumen

Se describen métodos para aislar caninas neutrófilos de la sangre entera y visualizar la formación neta en vivo neutrófilos mediante microscopía de fluorescencia. También se describe son protocolos para cuantificar la formación neta y citrulinado histona H3 (citH3) expresión usando microscopia de la inmunofluorescencia.

Resumen

En respuesta a la invasión de patógenos, neutrófilos liberan trampas extracelulares neutrófilos (redes), que son redes extracelulares de ADN con las histonas y proteínas antimicrobianas. Formación de red excesiva (NETosis) citH3 liberación durante la sepsis se asocia con múltiples disfunción del órgano y la mortalidad en ratones y seres humanos y sus implicaciones en los perros son desconocidos. Aquí, describimos una técnica para aislar caninas neutrófilos de la sangre entera para la observación y cuantificación de NETosis. Plasma rico en leucocitos, generado por sedimentación de dextrano, se separa por medios de separación gradiente de densidad disponible comercialmente y granulocitos recolectaron para la cuenta y las pruebas de viabilidad de la célula. Para observar en tiempo real NETosis en vivo neutrófilos, florescente de la célula y la célula impermeant ácido nucleico fluorescente manchas se agregan a neutrófilos activados por lipopolisacárido (LPS) o forbol 12-miristato 13-acetato (PMA). Con el tiempo se observan cambios en la morfología nuclear y formación de red por microscopía de fluorescencia. In vitro NETosis se caracteriza por co-colocalization sin células ADN de (cfDNA), mieloperoxidasa (MPO) y citrulinado histona H3 (citH3) utilizando un protocolo modificado de immunolabelling doble. Cuantificar objetivamente la neta formación y expresión de citH3 utilizando microscopía de fluorescencia, redes y células citH3-positivas se cuantifican de manera cegada utilizando software disponible. Esta técnica es un análisis específico para evaluar la capacidad en vitro de los neutrófilos caninos a NETosis.

Introducción

Neutrófilos son de breve duración granulocitos responsables de la defensa inicial contra los patógenos invasores. Neutrófilos, reclutados en el sitio de la infección, eliminan microorganismos por fagocitosis, degranulación y generación de oxígeno reactivo (ROS) las especies¹. En presencia de bacterias y endotoxinas, neutrófilos liberación neutrófilo extracelular trampas (redes), compuestas de cromatina extracelular decoración con las histonas y las proteínas granulares como elastasa y mieloperoxidasa (MPO)². Aunque redes tienen propiedades antimicrobianas indispensables, cada vez mayor evidencia experimental y clínica sugiere que entusiasta formación neta durante la sepsis puede llevar a múltiples órgano disfunción y muerte^{3,4, 5 , 6}.

Porque las redes pueden desempeñar un papel patofisiológico similar en perros, las intervenciones terapéuticas que prevengan o disminuyen la formación de la red pueden servir como estrategias de tratamiento novedosas en animales sépticos. Por esta razón, hay una necesidad de una técnica confiable evaluar y cuantificar NETosis y componentes netos en perros. Componentes netos como nucleosomas ADN libre de células (cfDNA) han sido evaluados previamente en neutrófilos caninos y plasma de perros clínica^7,8,9. Usando análisis de fluorescencia, Goggs y Letendre encontraron que perros sépticos tienen niveles más altos de cfDNA de perros sanos⁸. Aunque estas técnicas son altamente objetiva y cuantitativa, medición de la cfDNA y nucleosomas como marcadores de la NETosis no es específica ya que pueden derivar de células necróticas que no sean de NETosing neutrófilos. Aquí describimos una técnica que utiliza la microscopía de fluorescencia para examinar los comportamientos de los neutrófilos NETosing vivo. También detallamos un protocolo modificado usando doble inmunomarcación para cuantificar subjetivamente las redes y sus componentes como la MPO y citH3 en neutrófilos caninos¹⁰.

Protocolo

Todos los métodos aquí descritos fueron aprobados por el institucional Animal cuidado y uso de la Universidad de California, Davis (protocolo número: 18338).

1. sangre

1. Extraer 10 mL de sangre desde la vena cefálica o yugular utilizando una aguja de 21 G por la aspiración de la jeringa.
2. Para evitar excesiva tensión de esquileo, retire la aguja de la jeringa antes de transferir la sangre en tubos con heparina sódica (USP 75). Invertir suavemente los tubos varias veces para asegurar una mezcla adecuada de anticoagulante y sangre. Busque evidencia de coágulos o agregados de glóbulos rojos antes de colocar las muestras en hielo.

2. neutrófilo aislamiento

1. Diluir la sangre con anticoagulante con un volumen igual de solución salina helada de Dulbecco tamponada con fosfato (DPBS) (pH 7.4, sin cationes divalentes). Transferencia de 8 mL de sangre diluida en un tubo cónico de 50 mL polipropileno, que contiene 25 mL de dextrano de 3% (de Leuconostoc spp. disuelto en la solución de cloruro de sodio 0.9%). Coloque el tubo verticalmente en temperatura ambiente durante 30 min permitir la agregación y sedimentación de los eritrocitos.
2. Capa con cuidado 5 mL de plasma rico en leucocitos (figura 1) en la parte superior 5 mL de medio gradiente de densidad en un tubo de fondo redondo polipropileno 14 mL. Tenga cuidado de no mezclar los 2 soluciones¹¹.
3. Centrifugar los tubos a 400 x g con aceleración/desaceleración (A/D) set a 0 (sin freno) durante 30 min a temperatura ambiente.
4. Utilizando 5 mL pipeta serológica recoge la capa de células granulocitos puenteando el plasma y capas de células mononucleares (PBMC) de sangre periférica (figura 1). Utilizar una pipeta nueva cada vez para minimizar la contaminación.
5. Lugar 4 a 6 mL de la capa de células polymorphnuclear (PMN) en un tubo cónico de polipropileno 50 mL. Puesto que una pequeña cantidad de agregados de eritrocitos puede ser aspirada junto con la capa PMN, utilizar una pipeta serológica de 1 mL para eliminar suavemente los agregados de eritrocitos que se colocan en la parte inferior del tubo.
6. Lisar los eritrocitos restantes con 20 mL de agua ultrapura fría. Invierta suavemente el tubo varias veces para 30 a 60 s para lisis adecuado antes de agregar un volumen igual de solución de cloruro de sodio 1,8% helada.
7. Centrifugue a 112 x g durante 10 min a 4 ° C, sistema de A/D 0.
8. Repita el paso de lisis de eritrocitos si aparece roja esta pelotilla. Descartar el sobrenadante con una pipeta serológica y suavemente Resuspender el precipitado en 100 μl de DPBS (dextrosa de 5 mM, 0,9 mM MgCl₂, 1,9 mM CaCl₂ y albúmina de suero bovino 1%, pH 7.3). Combinar todas las celdas resuspendidas y coloque en hielo.
9. Realizar un recuento de células usando un analizador automatizado de la célula y verificar la cuenta por un hemocitómetro. Si es necesario, PMNs se concentran sobre un portaobjetos de vidrio con una Citocentrifuga (1.000 rpm, 5 min) y determinar el porcentaje de neutrófilos contando el número de neutrófilos en el número total de células.
10. Determinar la viabilidad de los neutrófilos mediante la realización de una prueba de exclusión del azul tripán señalados por Strober et al. ¹² aislamiento exitoso debe generar una viabilidad del 95 al 100% y neutrófilos deben ser mayores a 95%.
11. Determinar la concentración de neutrófilos multiplicando el recuento celular total y la viabilidad porcentaje porcentajes neutrófilos. Aislamiento exitoso debe generar una concentración de neutrófilos de 1,5 a 6 x 106/ml.
12. Diluir neutrófilos a una concentración final de 1 x 106/ml con DPBS que contiene dextrosa 5 mM, 0,9 mM MgCl₂, 1,9 mM de CaCl₂y seroalbúmina bovina al 1% con pH ajustado a 7.3.

3. fluorescente microscopia de neutrófilos energizados

1. Chapa de 12 bien cultura con lugar 200 a 400 μL de neutrófilos (1 x 106/ml) en cada pocillo de una poli-L-lisina. Permiten neutrófilos a adherirse al fondo de los pozos por incubación de las células a 37 ° C durante 30 minutos.
2. Etiqueta de ácidos nucleicos con 1 μM de uno de los dos tintes de ácido nucleico, que las manchas en las células con las membranas intactas y que las manchas en las células con membranas permeables (véase Tabla de materiales), por 10 min a temperatura ambiente.
3. Activar neutrófilos con lipopolisacárido μg/mL 100 (LPS) (e. coli O55. B5), 100 nM forbol 12-miristato 13-acetato (PMA) como control positivo, o un volumen equivalente de DPBS como control negativo de 180 min a 37 ° C.
4. Adquisición de imágenes con la GFP (excitación: 470/22 nm, emisión: 525/50 nm) y Texas Red canales (excitación: 585/29 nm, emisión: 628/32 nm) en una microscopía de fluorescencia a 40 aumentos en los siguientes puntos de tiempo: 30, 90, 120 y 180 min.

4. red de cuantificación y detección de componentes netos mediante inmunofluorescencia

1. Coloque con cuidado el cubreobjetos de 18 mm de diámetro revestido Poly-D-lisina en los pocillos de una placa de cultivo de 12 pozos. Etiquetar adecuadamente los pozos.
2. Semilla 100 a 200 μL de aislados neutrófilos (1 x 106/ml) directamente sobre el cubreobjetos y deje neutrófilos a adherirse al cubreobjetos por incubación de las células a 37 ° C durante 30 minutos.
3. Activar neutrófilos, como se describe en 3.3. Inhibir la formación de la red por pretratamiento de neutrófilos con 200 µΜ Cl-Amidina (15 min, 37 º C) antes de su activación, como se ha descrito por Li et al. ¹³ asegurar que el control de vehículo apropiado (DMSO) se incluye en el experimento.
4. Remueva cuidadosamente el cubreobjetos con pinzas finas. Capa de una hoja de película de parafina sobre un soporte de tubo de ensayo para crear pozos poco profundos y 2 ó 3 gotas 4% PFA en cada pozo¹⁰. Etiquetar adecuadamente los pozos y Coloque suavemente el cubreobjetos boca abajo en los pozos llenos de PFA. Permitir que las células para ser fijado a temperatura ambiente durante 20 minutos.
5. Lavar las células 3 veces de DPBS durante 5 minutos, moviéndolos de un pozo a otro.
6. Si immunolabelling no puede realizarse poco después de la fijación y activación de neutrófila, permiten cubreobjetos ser secado colocando el cubreobjetos hacia arriba en un trozo de papel de absorbancia. Cubreobjetos pueden conservarse hasta 1 semana boca arriba en una placa con 12 pozos cultura a 4 ° C hasta su análisis posterior. Lavar las células 3 veces de DPBS durante 1 min, utilizando la misma técnica como se describe en 4.4 antes de proceder al siguiente paso.
7. Para permeabilizar las células, Coloque suavemente el cubreobjetos boca abajo sobre una caída de 1% NP-40 para 1 min, utilizando la técnica descrita en 4.4. Lavar 3 veces de DPBS durante 1 min en un eje de balancín.
8. Al azar asignar cada muestra a un número y utilice un marcador de punto de diamantes para etiquetar el cubreobjetos por consiguiente.
9. Preparar y etiqueta de Petri individuales alineados con la película de parafina y 100 a 200 μL de 5% de suero de cabra en la película (tampón de bloqueo). Coloque el cubreobjetos boca abajo sobre el amortiguador de bloqueo. Colocar en un eje de balancín e incubar 1 h a 37 ° C.
10. Lavar 3 veces de DPBS durante 5 minutos en un eje de balancín.
11. Diluir el anticuerpo primario (las histonas 1: 400 conejo policlonales anti-citrulinada H3 (citH3) en 5% de suero de cabra). Incubar las células en placas Petri marcada con película de parafina. Ponen boca abajo cada cubreobjetos en 50 a 100 μL de la solución de anticuerpo diluido. Colocar en un eje de balancín e incubar 1 h a 37° C.
12. Lavar 3 veces de DPBS durante 5 minutos en un eje de balancín.
13. Diluida de anticuerpo secundario conjugado a un fluoróforo (1: 200) en el suero de cabra 5%. Incubar las células en placas Petri marcada con película de parafina. Ponen boca abajo cada cubreobjetos en 50 a 100 μL de la solución de anticuerpo diluido. Colocar en un eje de balancín e incubar 1 h a 37 ° C en la oscuridad.
14. Lavar 3 veces de DPBS durante 5 minutos en un eje de balancín en la oscuridad.
15. Para la detección simultánea de mieloperoxidasa (MPO) seguir los siguientes pasos para un protocolo modificado doble inmunomarcación descrito por Li et al. ¹³
16. Incubar las células en placas Petri marcada con película de parafina. Coloque cada cubreobjetos boca abajo sobre 100 a 200 μL de 10% conejo suero bajo suave balanceo (durante la noche, 4 ° C, en la oscuridad).
17. Lavar 3 veces de DPBS durante 5 minutos en un eje de balancín en la oscuridad.
18. Incubar las células en cabra no conjugada de 50 μg/mL contra conejo Fab fragmentos por 2 h a temperatura ambiente en un eje de balancín en la oscuridad.
19. Lavar 3 veces de DPBS durante 5 minutos en un eje de balancín en la oscuridad.
20. Diluir el anticuerpo primario (1: 200 conejo policlonales anti-humano MPO anticuerpo) en suero de cabra 5%. Incubar las células en placas Petri marcada con película de parafina. Ponen boca abajo cada cubreobjetos en 50 a 100 μL de la solución de anticuerpo diluido. Colocar en un eje de balancín e incubar 1 h a 37° C en la oscuridad.
21. Diluir el anticuerpo secundario conjugado a un fluoróforo en 5% de suero de cabra e incubar como se indica en 4.8
22. Lavar 3 veces de DPBS durante 5 minutos en un eje de balancín en la oscuridad.
23. Controles de interferencia deben elaborarse mediante la exclusión de incubación con cualquiera de los dos anticuerpos primarios en el segundo paso etiquetado inmune.
24. ADN de la mancha con 300 nM de 4', 6-Diamidion-2-Phenylindole, diclorhidrato (DAPI) por 5 min en la oscuridad a temperatura ambiente.
25. Lavar 3 veces de DPBS durante 1 min en un eje de balancín en la oscuridad.
26. Aplique una gota (50 μl) de antifade mountant sobre un portaobjetos de vidrio. Golpee suavemente el borde del cubreobjetos sobre un papel absorbente para eliminar el exceso de tampón antes de colocar el cubreobjetos con las células boca abajo. El medio de montaje debe formar una capa delgada entre el cubreobjetos y el portaobjetos de cristal. Para quitar las burbujas de aire, presione muy suavemente sobre el cubreobjetos con pinzas finas.
27. Muestras curar durante la noche en la oscuridad a 4 ° C. El medio de montaje debe endurecerse para el análisis microscópico con lentes de inmersión. Almacenar las muestras en 4 ° C en la oscuridad.

5. neutrófilo trampa extracelular cuantificación

1. Ciega a los operadores adquirir y analizar las imágenes de microscopio para las condiciones experimentales.
2. Usando un microscopio de fluorescencia a 40 aumentos, tomar 10 imágenes al azar de diferentes regiones de cada cubreobjetos en un experimento bajo los respectivos canales. Asegúrese de que el tiempo de exposición, brillo y contraste de cada canal se mantienen constantes a lo largo de la adquisición de imágenes.
3. Analizar las imágenes utilizando el software disponible como ImageJ (NIH). Identificar redes basadas en la localización de cfDNA, citH3 y MPO (Figura 3A, B). Cuantificar el número de neutrófilos en 10 campos al azar para cada condición experimental y redes. Números de redes publicado puede expresarse como un cociente (número de redes: número total de neutrófilos) para cada condición experimental.
4. Para evaluar los efectos del tratamiento sobre la expresión de citH3 intracelular, contar el número de neutrófilos con citH3 intracelular y el número de neutrófilos sin citH3 intracelular en 10 campos al azar en 40 aumentos bajo los respectivos canales ( Figura 3, flechas rojas). Expresión intracelular de la citH3 se puede expresar como el cociente del número de neutrófilos con citH3 intracelular para el número de neutrófilos sin citH3 intracelular.

Resultados

Utilizando este protocolo de imágenes de células vivas, los investigadores pueden observar la morfología nuclear, la integridad de la membrana plasmática y la presencia de cfDNA en neutrófilos de vida. Un colorante nuclear impermeant celular tiñe ácidos núcleos rojo en células con membranas celulares dañadas. Otro tinte celular-permeant, etiquetas de los ácidos nucleicos intracelulares en células vivas con membranas intactas de plasma. Los neutrófilos intactas, independientem...

Discusión

Presentamos aquí un protocolo para observar los cambios en núcleos conformación y cfDNA comunicado en vida canina neutrófilos utilizando un colorante florescente de la célula y un tinte impermeant del celular. La principal ventaja de este ensayo es que permite para la detección en tiempo real de formación red por microscopía de alta resolución en vivo neutrófilos sin fijación de la célula, por lo tanto, proporciona una herramienta sencilla y valiosa para la observación en vitro de neta formación. P...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dextran from Leuconostoc spp.	Sigma	31392	Molecular weight 450,000 – 650,000
Ficoll-Paque PLUS	GE Life Sciences	17144002
Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline	ThermoFisher Scientific	A1285801	With divalent cations
Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline	ThermoFisher Scientific	14190136	Without divalent cations
E. coli O55:B5	InvivoGen
SYTOX Orange Fluorescent Nucleic Acid Stain	ThermoFisher Scientific	S11368	5 mM in DMSO; stains in cells with permeable membranes
SYTO Green 16 Fluorescent Nucleic Acid Stain	ThermoFisher Scientific	S7578	1 mM in DMSO; stains in cells with intact membranes
Surface-Amps NP-40	Pierce	28324
Poly-D-Lysine coated coverslips	neuVitro	H-12-pdl	12 mm diameter
Anti-citrullinated histone H3 antibody	Abcam	Ab5103
Unconjugated goat anti-rabbit Fab fragments	Jackson ImmunoResearch	111-007-003	Specificity: IgG (H+L)
Anti- Myeloperoxidase antibody	Dako	A0398
4,6-Diamidino-2-phenylin (DAPI)	Life Technologies Corporation	D1306