In Vitro Formation canine piège extracellulaire neutrophiles : Analyse dynamique et Quantitative par microscopie de Fluorescence

Résumé

Nous décrivons des méthodes pour isoler canines neutrophiles du sang total et de visualiser la formation nette des neutrophiles vivants à l’aide de la microscopie de fluorescence. Également décrites sont des protocoles pour quantifier la formation nette et citrullinés histone H3 (citH3) expression à l’aide de la microscopie par immunofluorescence.

Résumé

En réponse à l’invasion de pathogènes, neutrophiles libèrent les pièges extracellulaires neutrophiles (filets), qui sont des réseaux extracellulaires d’ADN orné d’histones et des protéines antimicrobiennes. La formation nette excessive (NETosis) et citH3 communiqué au cours d’une septicémie est associé avec multiples dysfonctionnement organique et mortalité chez les souris et les humains, mais ses conséquences chez les chiens sont inconnus. Ici, nous décrivons une technique pour isoler les neutrophiles canines du sang total pour l’observation et quantification des NETosis. Plasma leucocyte-riche, générée par la sédimentation de dextran, est séparée par les médias de séparation gradient de densité disponible dans le commerce et granulocytes recueillis pour comte et le contrôle de viabilité des cellules. Pour observer en temps réel NETosis neutrophiles direct, cellule perméant et taches imperméants fluorescents des acides nucléiques cellulaires sont ajoutés à neutrophiles activés par lipopolysaccharide (LPS) ou phorbol 12-myristate 13-acétate (PMA). Changements dans la morphologie nucléaire et de la formation nette sont observées au fil du temps par microscopie à fluorescence. In vitro NETosis se caractérise davantage par co-co-localisation d’ADN de cellules libres (cfDNA), contre la myéloperoxydase (MPO) et citrullinés histone H3 (citH3) à l’aide d’un protocole modifié de double-immunomarquage. Afin de quantifier objectivement formation nette et citH3 expression à l’aide de la microscopie en fluorescence, filets et cellules citH3-positives sont quantifiés de façon aveugle à l’aide de logiciels disponibles. Cette technique est un dosage spécifique pour évaluer la capacité in vitro des neutrophiles canines à subir une NETosis.

Introduction

Les neutrophiles sont des granulocytes éphémères chargés de la défense initiale contre l’invasion des agents pathogènes. Neutrophiles, recrutés au site d’infection, éliminent les micro-organismes par phagocytose, dégranulation et génération de réactives de l’oxygène (DRO)¹. En présence de bactéries ou d’endotoxines, neutrophiles libération neutrophiles extracellulaire pièges (filets), composé de chromatine extracellulaire orné de histones et des protéines granulaires comme l’élastase et contre la myéloperoxydase (FTU)². Bien que les filets ont des propriétés antimicrobiennes indispensables, augmentant les preuves expérimentales et cliniques suggère que trop zélée formation nette au cours de l’infection peut conduire à plusieurs organes dysfonction et la mort^{3,4, 5 , 6}.

Parce que les filets peuvent jouer un rôle physiopathologique similaire chez les chiens, les interventions thérapeutiques qui empêchent ou diminuent la formation nette peuvent servir de stratégies de nouveaux traitements chez les animaux de la fosse septique. Pour cette raison, il y a un besoin pour une technique fiable évaluer et quantifier des NETosis et des composantes nettes chez les chiens. Composantes nettes y compris ADN acellulaire (cfDNA) et les nucléosomes précédemment ont été évalués que dans les neutrophiles canines et le plasma chiens clinique^7,8,9. Utilisant la fluorescence, Goggs et Letendre trouvent que septiques chiens ont des niveaux plus élevés de cfDNA que des chiens en bonne santé⁸. Bien que ces techniques soient très objective et quantitative, mesure des cfDNA et des nucléosomes comme marqueurs de NETosis est non spécifique car elles peuvent être dérivées de cellules nécrotiques, autres que les neutrophiles NETosing. Nous décrivons ici une technique qui utilise la microscopie de fluorescence pour étudier les comportements des vivants NETosing neutrophiles. Nous détaillons également un protocole modifié à l’aide de double-immunomarquage à quantifier subjectivement les filets et leurs composants tels que le MPO et citH3 dans les neutrophiles canine¹⁰.

Protocole

Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvées par le Comité de l’urbanisme à l’Université de Californie à Davis et d’institutionnels animalier (protocole numéro : 18338).

1. collecte de sang

1. Tirer 10 mL de sang soit la veine céphalique ou jugulaire à l’aide d’une aiguille de 21 G par aspiration de la seringue.
2. Pour éviter des contraintes de cisaillement excessives, retirer l’aiguille de la seringue avant de transférer le sang dans des tubes contenant de l’héparine de sodium (USP 75). Retourner doucement les tubes plusieurs fois afin d’assurer un mélange adéquat d’anticoagulant et de sang. Recherchez les signes de caillots ou d’agrégats de globules rouges avant de placer les échantillons sur la glace.

2. neutrophil isolement

1. Diluer le sang non coagulé avec un volume égal de tampon phosphate salin de glacé Dubecco (SPD) (pH 7,4, sans les cations divalents). Transfert 8 mL de sang dilué dans un tube conique polypropylène de 50 mL contenant 25 mL de dextran de 3 % (à partir de Leuconostoc spp., dissous dans la solution de chlorure de sodium 0,9 %). Disposer le tube debout à température ambiante pendant 30 min permettre l’agrégation et sédimentation des érythrocytes.
2. Soigneusement la couche 5 mL de plasma leucocyte-riche (Figure 1) sur le dessus de 5 mL de média gradient de densité dans un tube en polypropylène à fond rond 14 mL. Veillez à ne pas mélanger les 2 solutions¹¹.
3. Centrifuger les tubes à 400 x g avec accélération/décélération (A/D) la valeur 0 (pas de frein) pendant 30 min à température ambiante.
4. À l’aide de 5 mL pipette sérologique recueillir la couche de cellules de granulocytes en contournant le plasma et les couches de cellules mononucléaires (PBMC) du sang périphérique (Figure 1). Utilisez une nouvelle pipette chaque fois pour minimiser la contamination.
5. Dans un tube conique polypropylène 50 mL, placer 4 à 6 mL de la couche de cellules polymorphnuclear (PMN). Car une petite quantité de granulats érythrocytaire peut être aspirée avec la couche PMN, utiliser une pipette sérologique de 1 mL pour retirer délicatement les agrégats d’érythrocytes qui sont réglées au fond du tube.
6. Lyse des érythrocytes restants avec 20 mL d’eau ultrapure froid. Retourner doucement le tube plusieurs fois pendant 30 à 60 s pour lyse adéquate avant d’ajouter un volume égal de solution de chlorure de sodium 1,8 % glacée.
7. Centrifuger à 112 x g pendant 10 min à 4 ° C, A/D la valeur 0.
8. Répétez l’étape de lyse des érythrocytes si ce pellet apparaît rouge. Jeter le surnageant soigneusement avec une pipette sérologique et doucement Resuspendre le culot dans 100 µL de SPD (dextrose 5 mM, 0. 9 mM MgCl₂, 1,9 mM CaCl₂ et 1 % d’albumine sérique bovine, pH 7,3). Combiner tous les cellules resuspendues et placez sur la glace.
9. Effectuer un nombre de cellules à l’aide d’un analyseur de cellules automatisées et vérifier le compteur par un hémocytomètre. Si nécessaire, se concentrer APF sur une lame de verre à l’aide d’un cytocentrifuge (1 000 tr/min, 5 min) et détermine le pourcentage des neutrophiles en comptant le nombre de neutrophiles sur le nombre total de cellules.
10. Déterminer la viabilité des neutrophiles en effectuant un test d’exclusion bleu trypan tels que décrits par Strober et al. ¹² isolation réussie cède une viabilité de 95 à 100 % et neutrophiles doivent être supérieures à 95 %.
11. Déterminer la concentration des neutrophiles en multipliant le nombre total de cellules avec la viabilité pour cent et les neutrophiles pour cent. Réussite de l’isolement devrait produire une concentration de neutrophiles de 1,5 à 6 x 106/ml.
12. Diluer les neutrophiles à une concentration finale de 1 x 106/ml avec SPD contenant dextrose 5 mM, 0. 9 mM MgCl₂, 1,9 mM CaCl₂et 1 % d’albumine sérique bovine avec pH ajusté à 7,3.

3. fluorescente microscopie des neutrophiles direct

1. Place de 200 à 400 μL de neutrophiles (1 x 106/ml) dans chaque puits d’une poly-L-lysine enduit plaque de 12 puits de culture. Permettre aux neutrophiles à adhérer au fond des puits en incubant les cellules à 37 ° C pendant 30 min.
2. L’étiquette des acides nucléiques avec 1 μM d’un des deux colorants acides nucléiques, celui des taches dans les cellules à membranes intactes et que les taches dans les cellules des membranes semi-perméables (voir Table des matières), pendant 10 min à température ambiante.
3. Activer les neutrophiles à lipopolysaccharide (LPS) (e. coli O55 de 100 μg/mL. B5), 100 nM phorbol 12-myristate 13-acétate (PMA) comme contrôle positif, ou un volume équivalent de SPD comme contrôle négatif pendant 180 minutes à 37 ° C.
4. Acquisition d’images à l’aide de la GFP (Excitation : 470/22 nm, émission : 525/50 nm) et Texas Red channels (Excitation : 585/29 nm, émission : 628/32 nm) sur une microscopie à fluorescence à un grossissement de X 40 aux points temps suivants : 30, 90, 120 et 180 min.

4. NET Quantification et détection de composants NET à l’aide d’Immunofluorescence

1. Placer soigneusement 18 mm diamètre Poly-D-lysine enduite de lamelles dans les puits d’une plaque de 12 puits de culture. Étiqueter correctement les puits.
2. Semence 100 à 200 μL d’isolé des neutrophiles (1 x 106/ml) directement sur les lamelles et laissez neutrophiles respecte les lamelles en incubant les cellules à 37 ° C pendant 30 min.
3. Activer les neutrophiles comme décrit à la 3.3. Inhiber la formation nette par un pré-traitement des neutrophiles à µΜ 200 Cl-amidine (15 min, 37 ° C) avant l’activation, comme décrit plus haut par Li et al. ¹³ s’assurer que le contrôle du véhicule approprié (DMSO) est compris dans le test.
4. Retirer délicatement les lamelles avec une pince fine. Une feuille de film de paraffine de couche sur un support de tube à essai pour créer des puits peu profonds et mettre 2 à 3 gouttes de 4 % PFA dans chaque puits¹⁰. Étiqueter les puits correctement et poser délicatement les lamelles à l’envers sur les puits remplis de PFA. Permettre aux cellules qui sera fixée à température ambiante pendant 20 min.
5. Laver les cellules 3 fois au SPD pendant 5 min, en les déplaçant d’un puits à l’autre.
6. Si immunomarquage ne peut pas être effectuée peu de temps après la fixation et l’activation neutrophile, permettent de lamelles d’être séchés en plaçant le lamelles face vers le haut sur un morceau de papier de l’absorbance à l’air. Lamelles peut être conservés pendant jusqu'à 1 semaine face vers le haut dans une plaque de culture de 12 puits marqué à 4 ° C jusqu'à l’analyse plus loin. Laver les cellules 3 fois au SPD pendant 1 min, utilisant la même technique, comme décrit dans 4.4 avant de passer à l’étape suivante.
7. Pour permeabilize des cellules, poser délicatement la lamelle couvre-objet à l’envers sur une baisse de 1 %, NP-40 pour 1 min en utilisant la technique décrite en 4.4. Laver 3 fois au SPD pendant 1 min sur un rocker.
8. Au hasard affecter chaque échantillon à un certain nombre et utiliser un marqueur de point de diamant pour étiqueter les lamelles en conséquence.
9. Préparer et étiquette individuelle Pétri bordée de film de paraffine et la place de 100 à 200 μL de sérum de chèvre de 5 % sur le film (tampon de blocage). Poser les lamelles à l’envers sur le tampon de blocage. Placer sur une bascule et incuber pendant 1 heure à 37 ° C.
10. Laver 3 fois au SPD pendant 5 min sur un rocker.
11. Diluer l’anticorps primaire (histone de 1 : 400 lapin polyclonal anti-citrullinés H3 (citH3) à 5 % de sérum de chèvre). Incuber les cellules marquées Pétri bordée de film de paraffine. Poser chaque lamelle couvre-objet à l’envers sur 50 à 100 μL de la solution diluée d’anticorps. Placer sur une bascule et incuber pendant 1 heure à 37° C.
12. Laver 3 fois au SPD pendant 5 min sur un rocker.
13. Anticorps secondaire dilué conjugué à un fluorophore (1 : 200) dans le sérum de chèvre de 5 %. Incuber les cellules marquées Pétri bordée de film de paraffine. Poser chaque lamelle couvre-objet à l’envers sur 50 à 100 μL de la solution diluée d’anticorps. Sur une base berçante et incuber 1 h à 37 ° C dans l’obscurité.
14. Laver 3 fois au SPD pendant 5 min sur une bascule dans l’obscurité.
15. Pour la détection simultanée de la myéloperoxydase (MPO), suivez les étapes suivantes pour un protocole modifié immunomarquage double telle que décrite par Li et al. ¹³
16. Incuber les cellules marquées Pétri bordée de film de paraffine. Poser chaque lamelle couvre-objet à l’envers sur 100 à 200 μL de lapin de 10 % sérum sous le doux balancement (une nuit ou plus, 4 ° C, dans l’obscurité).
17. Laver 3 fois au SPD pendant 5 min sur une bascule dans l’obscurité.
18. Incuber les cellules chez les caprins non conjuguée de 50 μg/mL des fragments Fab anti-lapin pendant 2 h à température ambiante sur une bascule dans l’obscurité.
19. Laver 3 fois au SPD pendant 5 min sur une bascule dans l’obscurité.
20. Diluer l’anticorps primaire (1 : 200 lapin anti-humain MPO anticorps polyclonal) dans le sérum de chèvre de 5 %. Incuber les cellules marquées Pétri bordée de film de paraffine. Poser chaque lamelle couvre-objet à l’envers sur 50 à 100 μL de la solution diluée d’anticorps. Sur une base berçante et incuber 1 h à 37° C dans l’obscurité.
21. Diluer l’anticorps secondaire conjugué à un fluorophore dans 5 % de sérum de chèvre et incuber tel que décrit dans 4,8
22. Laver 3 fois au SPD pendant 5 min sur une bascule dans l’obscurité.
23. Contrôles d’interférence doivent être préparés par l’exclusion d’incubation avec deux anticorps primaires dans la deuxième étape pour le label immunitaire.
24. Tache d’ADN avec 300 nM de 4', 6-Diamidion-2-phénylindole, dichlorhydrate (DAPI) pendant 5 min dans l’obscurité à température ambiante.
25. Laver 3 fois au SPD pendant 1 min sur une bascule dans l’obscurité.
26. Appliquez une goutte (~ 50 μl) d’antifade mountant sur une lame de verre. Tapotez doucement le bord de la lamelle sur un papier absorbant pour enlever l’excès de tampon avant de monter la lamelle avec les cellules à l’envers. Le milieu de montage doit former une fine couche entre la lamelle et la lame de verre. Pour enlever les bulles d’air, appuyez très légèrement sur la lamelle couvre-objet avec une pince fine.
27. Laisser les échantillons guérir du jour au lendemain dans l’obscurité à 4 ° C. Le milieu de montage devrait durcir pendant l’analyse au microscope avec des lentilles d’immersion. Conserver les échantillons à 4 ° C dans l’obscurité.

5. neutrophiles piège extracellulaire Quantification

1. L’ou les opérateurs acquisition et l’analyse des images de microscope pour les conditions expérimentales de l’aveugle.
2. À l’aide d’un microscope à fluorescence avec grossissement de 40 X, prendre 10 images au hasard des différentes régions de chaque lamelle lors d’une expérience dans les canaux. S’assurer que la durée d’exposition, la luminosité et le contraste de chaque canal sont cohérentes au cours de l’acquisition d’images.
3. Analyser les images à l’aide de logiciels disponibles comme ImageJ (NIH). Identifier les filets basés sur la co-localisation de cfDNA, de citH3 et de MPO (Figure 3 a, B). Quantifier le nombre de filets et de neutrophiles dans 10 champs aléatoires pour chaque condition expérimentale. Nombres de filets libéré peut être exprimées sous forme de ratio (nombre de filets : nombre de neutrophiles) pour chaque condition expérimentale.
4. Pour évaluer les effets du traitement sur l’expression citH3 intracellulaire, compter le nombre de neutrophiles à citH3 intracellulaire et le nombre de neutrophiles sans citH3 intracellulaires dans 10 champs au grossissement de X 40 sous les canaux ( Figure 3, flèches rouges). Expression citH3 intracellulaire peut être exprimée comme le ratio du nombre de neutrophiles à intracellulaire citH3 au nombre de neutrophiles sans citH3 intracellulaires.

Résultats

Utilisant ce protocole d’imagerie de cellules vivantes, les enquêteurs peuvent observer la morphologie nucléaire, l’intégrité de la membrane plasmique et la présence de cfDNA vie des neutrophiles. Un colorant nucléaire imperméants cellule taches acides noyaux rouges dans les cellules des membranes de cellules endommagées. Un autre colorant cellulaire perméable, étiquettes intracellulaire des acides nucléiques dans des cellules vivantes avec des membranes de plasma. Tous les...

Discussion

Nous présentons ici un protocole afin d’observer les changements de noyaux conformation et cfDNA l’échappement vie canine neutrophiles en utilisant un colorant perméants de cellule et un colorant imperméants de la cellule. Le principal avantage de ce test, c’est qu’elle permet une détection en temps réel de formation nette par microscopie à haute résolution dans les neutrophiles direct sans fixation de la cellule, par conséquent, fournir un outil simple et utile pour l’observation in vitro la ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dextran from Leuconostoc spp.	Sigma	31392	Molecular weight 450,000 – 650,000
Ficoll-Paque PLUS	GE Life Sciences	17144002
Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline	ThermoFisher Scientific	A1285801	With divalent cations
Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline	ThermoFisher Scientific	14190136	Without divalent cations
E. coli O55:B5	InvivoGen
SYTOX Orange Fluorescent Nucleic Acid Stain	ThermoFisher Scientific	S11368	5 mM in DMSO; stains in cells with permeable membranes
SYTO Green 16 Fluorescent Nucleic Acid Stain	ThermoFisher Scientific	S7578	1 mM in DMSO; stains in cells with intact membranes
Surface-Amps NP-40	Pierce	28324
Poly-D-Lysine coated coverslips	neuVitro	H-12-pdl	12 mm diameter
Anti-citrullinated histone H3 antibody	Abcam	Ab5103
Unconjugated goat anti-rabbit Fab fragments	Jackson ImmunoResearch	111-007-003	Specificity: IgG (H+L)
Anti- Myeloperoxidase antibody	Dako	A0398
4,6-Diamidino-2-phenylin (DAPI)	Life Technologies Corporation	D1306