JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

نحن التقرير أساليب لتوصيف لتمزق الأغشية البلازمية ملكل بوساطة في نيكروبتوسيس بما في ذلك التصوير المجهري خلية العيش التقليدية و [كنفوكل]، وفحص المجهر الإلكتروني، وربط دهني المستندة إلى الرنين المغناطيسي النووي.

Abstract

نيكروبتوسيس هو طريقا موت خلية مبرمجة سببها تفعيل مستقبلات التفاعل كيناز البروتين 3 (RIPK3)، التي فوسفوريلاتيس وينشط بسيودوكيناسي كيناز مثل مجال مختلط النسب، ملكل، تمزق أو بيرميبيليزي غشاء البلازما . نيكروبتوسيس طريقا التهابات المرتبطة بأمراض متعددة بما في ذلك المناعة الذاتية، الأمراض المعدية والقلب والأوعية الدموية، والسكتة الدماغية، ونيوروديجينيريشن، والسرطان. وهنا يصف لنا البروتوكولات التي يمكن استخدامها لوصف ملكل كالجلاد تمزق الأغشية البلازمية في نيكروبتوسيس. يمكننا تصور عملية نيكروبتوسيس في الخلايا باستخدام التصوير خلية يعيش مع الفحص المجهري الفلورية التقليدية و [كنفوكل]، وفي الخلايا الثابتة باستخدام المجهر الإلكتروني، التي كشفت معا إعادة توزيع ملكل من سيتوسول للبلازما غشاء قبل الاستقراء ثقوب كبيرة في غشاء البلازما. ونقدم في المختبر تحليل الرنين المغناطيسي النووي (الرنين المغناطيسي النووي) باستخدام الدهون لتحديد المغيرون المفترضة لوساطة ملكل نيكروبتوسيس. استناداً إلى هذا الأسلوب، حددنا كمية الدهن-ربط اﻷفضليات والفوسفات الفوسفاتيديل-اينوزيتول (نقطة) موثقات الحرجة من ملكل المطلوبة لاستهداف غشاء البلازما وبيرميبيليزيشن في نيكروبتوسيس.

Introduction

ويسرت تحديد العناصر الوراثية في نيكروبتوسيس استخدام نماذج حيوانية لاختبار الأثر المترتب على نيكروبتوسيس في علم وظائف الأعضاء والأمراض1،2،3،،من45. خروج المغلوب من RIPK3 أو ملكل في الفئران أثر ضئيل في التوازن الإنمائي والكبار مما يوحي بأن نيكروبتوسيس ليست ضرورية للحياة3،6. وعلاوة على ذلك، لا تحتوي على أنواع معينة من الجينات أما RIPK3 أو ملكل، ودعم الدور غير الضرورية نيكروبتوسيس في الحيوانات7،8. من ناحية أخرى، كشفت تتحدى نماذج حيوانية خروج المغلوب مع مختلف الأمراض التي يسببها في المختبر دوراً هاما في نيكروبتوسيس في التهاب والحصانة الفطرية، والعدوى الفيروسية9،10، 11 , 12.

يمكن تنشيط نيكروبتوسيس بعدة طرق بإشارات من خلال أجهزة الاستشعار المختلفة الحصانة الفطرية، كافة التي تؤدي إلى تفعيل RIPK31،،من1314. RIPK3 النشطة بدوره فوسفوريلاتيس وينشط ملكل3،4،5،،من67،،من89،10 ،11،،من1213،14،15،16،،من1718. درس أكثر من غيرها، وربما ينطوي بالطريقة الأكثر تعقيداً، مما يؤدي إلى تنشيط RIPK3 الموت مستقبلات ربط، الذي إلى على أساس التكوين المصب من المجمعات إرسال الإشارات لحمل أما المبرمج أو نيكروبتوسيس1. نيكروبتوسيس تستتبعه عندما إشارات من خلال RIPK1 هو يفضل ويؤدي إلى إشراك RIPK319،20. هو يفضل هذه النتيجة بسهولة على تثبيط الدوائية أو حذف الوراثية caspase 8، مثبط ذاتية المفترضة من نيكروبتوسيس التي تحافظ نيكروبتوسيس في خليج. تربط بين RIPK1 وينشط RIPK3. طريقة أخرى لتنشيط نيكروبتوسيس من خلال عدد القتلى مثل مستقبلات الإشارات TLR3/TLR4، الذي يشارك وينشط RIPK3 عن طريق يحتوي على مجال النقل الدولي البري الذي يحفز محول الانترفيرون-بيتا (تريف)21. بعد طريقة أخرى ليموت قبل نيكروبتوسيس بتفعيل استشعار الحمض النووي داي، الذي يشرك مباشرة وينشط RIPK322.

ملكل بروتين سيتوسوليك تتألف من مجال حزمة (ملحوظة) اللولب الطرفي ن وفي مجال بسيودوكيناسي ج-طرفية (بسكد) مرتبطة ب منطقة تنظيمية قوس3. في الخلايا الطبيعية، تم العثور على ملكل في سيتوسول حيث أنه يعتقد أن يكون في مجمع غير نشطة مع RIPK314. تفعيل نيكروبتوسيس مشغلات الفسفرة RIPK3 من ملكل في حلقة التنشيط بسكد، ومواقع إضافية محتملة في ملحوظة وقوس15،3،23. الفسفرة الحث على تغيير كونفورماشونال في ملكل التي ينتج عنها تفكك من RIPK314. الإصدار تغييرات conformational غير مفهومة في القوس من بسكد24. يتوسط القوس، الذي يحتوي على لوالب 2، أوليجوميريزيشن ملكل في تريمير المفترضة من خلال اللولب ج-مبنى رقم25. يمنع اللولب الطرفي ن من القوس المجال NB، هو أمر أساسي لغشاء بيرميبيليزيشن24،26. بمعزل عن غيرها، المجال NB كافية لحمل permeabilization غشاء البلازما ونيكروبتوسيس16،،من2427. أعيد نشاط برو-نيكروبتوتيك ملحوظة في الماوس الخلايا الليفية الجنينية قاصرة في ملكل (ملكل-/- ميفس). ملحوظة: هو مجال ملزم دهن ضلعت تفضيلي diphosphate فوسفاتيديلينوسيتول 4، 5 فسفوليبيد (المرحلة2). واقترحنا إليه التدرجي لتفعيل ملكل، حيث يسهل أوليجوميريزيشن قوس تجنيد ملكل لغشاء البلازما عن طريق التفاعلات الضعيفة من ملحوظة مع الأقطاب رئيس الفريق2 النقطة24. في الغشاء، يخضع NB التعرض ينظم موقع إضافية عالية تقارب ملزمة للنقطة2، الذي هو يخفيها في القوس في ملكل غير نشط. إجمالاً، زعزعة تفاعلات متعددة ملحوظة مع النقطة2 غشاء البلازما مما يؤدي إلى تمزق به، على الرغم من أن لا يكون تم توضيح الآلية الجزيئية لهذه الأحداث.

نحن هنا لتوضيح الأساليب المحددة المستخدمة لتوصيف وظيفة ملكل كالجلاد نيكروبتوسيس24. على وجه الخصوص، نحن نركز على المجال الأدنى ملكل، وملحوظة وقوس (NBB)، الذي يخضع لتثبيط قوس ويمكن تفعيلها من خلال ثنائي القسري للحث على تمزق الأغشية البلازمية ونيكروبتوسيس. يصف لنا نظامنا التعبير إيندوسيبلي جنبا إلى جنب مع المخدرات التي يسببها فكبب بوساطة ثنائي القسري لتصوير خلية يعيش، والمجهر الإلكتروني للخلايا التي تمر نيكروبتوسيس. بالإضافة إلى ذلك، توضح لنا تحليلنا في المختبر الرنين المغناطيسي لتفاعلات NBB مع فوسفاتيديلينوسيتولس (نقطة).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1-الاستنساخ وخلايا توليد خط

  1. [بكر] تضخيم منطقة NBB، المقابلة للأحماض الأمينية المخلفات 1-140 (NBB140)، من البشر ملكل كدنا في الإطار القياسي القائم على تقييد إنزيم الاستنساخ مع أوليجوميريزيشن المجال 2 x FK506 ملزمة البروتين (2xFKBP أو 2xFV) ونيون فينوس البروتين في الدوكسي (دوكس)-بريتروكس-TRE3G إيندوسيبلي ناقل للفيروسات الرجعية للحصول على NBB140-2xFV-فينوس (الجدول 1، الأرقام 1A-ب).
  2. تخليد الابتدائي ملكل-/- أو ripk3-/- ملكل-/- الفأر الجنينية الليفية (MEFs) مستخلصة من الفئران كل منها متاح في المختبر الخضراء تعداء عابر مع مستضد SV40 كبيرة وإذ تعرب عن بلازميد. حدد الخلايا مخلدة في ~ 1 – 2 أسابيع، والحفاظ عليها في دميم تستكمل مع 10% مصل بقرى الجنين (FBS)، 2 مم الجلوتامين L، 100 البنسلين يو/مليلتر وستربتوميسين، بيروفات صوديوم 1 مم، والأحماض الأمينية غير الأساسية في 37 درجة مئوية و 5% CO2 في الأنسجة القياسية محاضن الثقافة.
  3. ترانسدوسي خلد SV40 ملكل-/- ميفس مع ترانساكتيفاتور التتراسيكلين عكس تسيطر (رتا)-تتضمن لفي أعرب من بلازميد التي تحتوي على الجينات المقاومة بلاستيسيدين (لدينا بلازميد المعدلة) وعلاج ل 1 الأسبوع مع 5 ميكروغرام/مل بلاستيسيدين لتحديد الخلايا ستابلي معربا عن رتا28.
  4. ترانسدوسي MEFs معربا عن رتا مع ناقل للفيروسات التراجعية دوكس إيندوسيبلي التي تحتوي على ملكل تشيميريك (بريتروكس-NBB140-2xFV-فينوس-بورو) وحدد استخدام 4 ميكروغرام/مل بوروميسين لمدة أسبوع, 2 أيام بعد توصيل.

2-يعيش-خلية مجهرية تصوير لوساطة ملكل نيكروبتوسيس

  1. لوحة ملكل-/- MEFs الإعراب عن NBB140-2xFV-فينوس في كثافة الخلايا 50,000 كل بئر (1 مل/جيد) في 24 كذلك لوحات، واحتضان بين عشية وضحاها (الشكل 2أ). استخدام خلية يعيش تلطيخ لعد الخلايا الآلي (انظر الجدول للمواد).
  2. علاج الخلايا ح 12 مع دوكس (0.5 ميكروغرام/مل) للحث على التعبير عن NBB140-2xFV-فينوس.
  3. حمل نيكروبتوسيس مع ديميريزير فكبب شمال البحر الأبيض المتوسط 25 (خافت) بالإضافة إلى 25 نانومتر غشاء كتيمة الفلورية الخضراء صبغ (انظر الجدول للمواد) في دميم القياسية (انظر 1-2). تتراكم الخلايا تمر نيكروبتوسيس الصبغة كما هو الخطر سلامتهم غشاء البلازما ب NBB140-بوساطة تمزق. إجراء فحوصات في ثلاث نسخ أو البيلوروسية.
  4. لمراقبة نيكروبتوسيس باستخدام لون واحد أو مزدوج نظم التصوير (انظر الجدول للمواد)، مكان السفن في وحدة التصوير كل منهما في حاضنة زراعة أنسجة الثدييات.
  5. افتح البرنامج (انظر الجدول للمواد)، وحدد علامة التبويب "جدولة فحص القادمة" تحت قائمة "المهام".
    ملاحظة: هذا البروتوكول للتصوير باستخدام نظم أحادية اللون، ولكن برامج مماثلة المتاحة لأنظمة الألوان المزدوجة.
  6. حدد "علبة، السفينة، أنواع المسح الضوئي"، و "نمط المسح الضوئي" في علامة التبويب تخطيط "المادية" و "حمل الأسفار" في علامة التبويب خصائص.
  7. إضافة "المسح الضوئي الوقت" بواسطة النقر فوق في الإطار "جدول زمني" ومجموع عدد النقاط الزمنية والتردد لاقتناء (عادة 1 حيازة كل ح 0.5 إلى 1 ح 6 ح إلى ح 12، أو كل 5 دقائق لحركية سريعة نيكروبتوسيس) والبدء في الحصول على الصور عن طريق تحديد "التطبيق ly "(الزر الأحمر).
  8. قياس نيكروبتوسيس استخدام برمجيات تحليل الصورة (انظر الجدول للمواد) بتحديد من "جزء المهام"، "كائن عد التحليل الجديد مع عتبة تجزئة الثابتة أعلى من مستوى الخلفية"، التي يمكن أن يحددها تحوم مؤشر الماوس عبر المناطق الخلفية في العديد من الصور المستخدمة في التحليل.
  9. فحص الفلورسنت الكائنات عن طريق تحديد تؤدي معاينة باستخدام الصورة الحالية وتحسين مستويات عتبة حسب الحاجة.
  10. دمج التهم الفلورية الخضراء عن طريق فتح علامة التبويب "الشروع في تحليل جديد"، اختر "النطاق الزمني"، وحدد الآبار ليتم تحليلها وإدخال "اسم الوظيفة تحليل" واضغط على "موافق".
  11. الوصول إلى تحليل البيانات من علامة التبويب "تحليل المهام" بالنقر المزدوج فوق اسم المهمة الخاصة بكل منها والمصدرة من إطار الرسم البياني والتصدير لتحليل إضافي في برامج الرسوم البيانية الخارجية (انظر الجدول للمواد).
  12. قوانتيتاتي البيانات الإيجابية الفلورية الخضراء (+ ve) التهم/مم2 أو تطبيع التهم قبل التقاء والتعبير عن البيانات الفلورية الخضراء + ve التهم/التقاء.
  13. بشكل اختياري، في نقطة النهاية التجريبية، وصمة عار الخلايا مع 100 نانومتر الفلورية الخضراء غشاء بيرمينت صبغ (انظر الجدول للمواد). تطبيع البيانات إلى خلايا نيكروبتوتيك % كنسبة الأسفار الفلورية الخضراء/الأخضر عند نقطة النهاية.

3-تصوير مجهرية [كنفوكل] يعيش-خلية تجنيد غشاء البلازما وبيرميبيليزيشن ملكل

  1. لوحة ملكل-/- MEFs الإعراب عن NBB140-2xFV-فينوس في كثافة الخلايا 20,000 كل بئر (0.5 مل/جيد) في كوب أسفل غرفة الفحص المجهري 4-بئر pretreated مع 50 ميكروغرام/مل فيبرونيكتين في برنامج تلفزيوني في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة واحتضانها ل ~ 12 ح ( الشكل 2ب).
  2. علاج الخلايا مع دوكس (0.5 ميكروغرام/مل) ل ~ 12 (ح) الحث على التعبير عن NBB140-2xFV-فينوس.
  3. حمل نيكروبتوسيس بحضانة مع الطازجة المتوسطة (1 مل/جيد) تحتوي على 25 نانومتر خافت لحمل NBB140-2xFV-تفعيل فينوس وازفاء إلى غشاء البلازما.
  4. ضع الدائرة على غزل قرص ليزر المسح مجهر [كنفوكل] بنيت على موقفا مقلوب مجهزة بمراقبة البيئة و 63 1.4 نا الهدف والبدء في التصوير الحصول على استخدام برمجيات اختيار (انظر الجدول للمواد).
  5. تهيئة البرنامج، حدد الرمز "Focus" وتكوين عامل تصفية يفب (الإثارة طول موجي 515 نانومتر).
  6. تحديد موقع مجال الرؤية والمستوى البؤري، وإشراك نظام صيانة التركيز باستخدام علامة التبويب "تركيز محدد".
  7. للبدء باكتساب، حدد علامة التبويب "التقاط" متبوعاً بتعيين تكوين عامل تصفية، ومناسب امككد الكاميرا التعرض الوقت وتكثيف كسب واكتساب الوقت الفاصل بين المعلمات بما في ذلك الفاصل الزمني وطول لاقتناء.
  8. مراقبة إعادة توزيع الخلوية NBB نيون140-2xFV-فينوس البروتين أثناء نيكروبتوسيس بالحصول على صور كل 10 s بكاميرا امككد باستخدام ليزر 515 نانومتر (1 الفيلم).
    ملاحظة: فوتوبليتشينج اهتمام بتصوير بروتين فلوري. فينوس واحدة من أكثر مقاومة للبروتينات الفلورية إلى فوتوبليتشينج29. إذا استخدمت البروتينات الفلورية التي أكثر عرضه فوتوبليتشينج، صورة كل 30 ثانية أو أطول للسماح باسترداد الإشارات بين النقاط الزمنية التصوير.
  9. رصد رابطة غشاء البلازما NBB140-2xFV-فينوس خلال نيكروبتوسيس، صورة كل 10 s العينة أعده في 3.3 fluorescence الانعكاس الداخلي الكلي مجهرية (TIRF) باستخدام مجهر مجهزة منزلق TIRF الآلي هدف نا 100 × 1.4 وكاميرا امككد (2 الفيلم). اتبع الخطوات 3-3، 5-7، ولكن ضبط زاوية TIRF ضمن علامة التبويب التركيز TIRF وفقا لسمك الزجاج عينة وأسفل قاعة الفحص المجهري.
    ملاحظة: علامات غشاء البلازما مثل لك-ج-تقديم العروض قد تستعمل كعناصر تحكم للتعريب غشاء البلازما في تحليل TIRF.
  10. تؤدي معالجة تعزيز الجودة بالالتواء مع المشتقة الثانية تطبيع سلبية دالة الضبابي (خوارزمية مار) من الصور.

4-الميكروسكوب الإلكتروني

  1. لوحة ملكل-/- MEFs الإعراب عن NBB140-2xFV-فينوس في كثافة الخلايا 5 مليون في 150 مم المغلفة بالبلازما خلية طبق الثقافة واحتضانها ح 12 (الشكل 3).
  2. علاج الخلايا مع الدوكسي (0.5 ميكروغرام/مل) للحث على التعبير عن ملاحظة:1-140-2xFV-فينوس ح 12.
  3. حمل NBB140-2xFV-تفعيل فينوس وازفاء إلى غشاء البلازما مع 25 نيوتن متر هوموديميريزير لمدة 5 دقائق. يتم تأسيس هذه المرة من حركية نيكروبتوسيس لاحظ في تصوير خلية يعيش.
  4. قم بإزالة الوسائط وإصلاح الخلايا باستخدام 10 مل من 2.5 ٪ glutaraldehyde، بارافورمالدهيد 2% في م 0.1 الصوديوم كاكوديلاتي المخزن المؤقت درجة الحموضة 7.4 (المخزن المؤقت كاكوديلاتي) استعد مسبقاً عند 37 درجة مئوية.
  5. جمع العينة بتجريف وتدور هذه العينات لمدة 10 دقائق في 500 x ز. تجاهل المادة طافية.
  6. Postfix العينة ح 1.5 في أكسيد الاوزميوم 2% انخفاض مع فيروسيانيد البوتاسيوم 1.5% في المخزن المؤقت كاكوديلاتي الصوديوم 0.1 متر. أكسيد الازميوم عامل المصبوغة تستخدم على نطاق واسع في تيم توفير التباين. ونحن كال تحليلاً أولياً قبل SEM خلية يمر نيكروبتوسيس.
  7. شطف العينة 5 مرات في الماء عالي النقاوة لمدة 5 دقائق في 500 x غ، تليها يشطف في المخزن المؤقت (انظر 4.6)، والمياه والايثانول على معالج تلقائي. تجاهل المادة طافية.
  8. لوزارة شؤون المرأة، وصمة عار عينات محددة مسبقاً مع 1% اليورانيل خلات والرصاص اسبارتاتي وصمة عار المعادن الثقيلة31.
  9. يذوي العينات من خلال سلسلة متدرجة من حلول أكسيد البروبيلين والكحول.
  10. تضمين العينة في الراتنج الثابت32 للحصول على كتلة راتنج.
  11. قطع المقاطع سميكة من 0.5 ميكرومتر لتحديد مجال التحليل الصحيح.
  12. معطف العينات مع فيلم رقيقة جداً من المعدن إجراء كهربائياً (ايريديوم).
  13. صورة وتحليل العينات (الشكل 3). للتحديد الكمي، يتم تفحص صورة التكبير منخفضة السطح كتلة الراتنج مع خلايا المكشوفة في 5 كيلو مجهر الإلكتروني باستخدام.
  14. تصور الخلايا عبر الصور الفردية التي استولت عليها وزارة شؤون المرأة أو التصوير البرمجيات يمكن استخدامها للانضمام إلى حقول متعددة من رأي في صورة واحدة متجاورة30. حوالي 100 خلية يمكن استخدامها لتقييم جزء الخلايا التي تمر نيكروبتوسيس بهذه الطريقة عن طريق توليد مونتاج عالية الدقة في البرنامج المفضل (انظر الجدول للمواد).
    ملاحظة: سجل مورفولوجيا نخرية قبل SEM يقارن ميزات الخلية العادية مع تطور تعمل مسبقاً نخرية أو نخرية. تتضمن هذه الميزات غشاء البلازما التعديلات بما في ذلك اختفاء زغيبات، التسوية، تصدعات في الخلايا تتراوح بين 10 نانومتر إلى 1 ميكرومتر في الحجم، أو فقدان الهيكل عضية عبر 30-40 في المائة على الأقل من منطقة الخلية سيتوسوليك.

5-الدهن ملزمة من ملكل بالتحليل الطيفي الرنين المغناطيسي النووي (الرنين المغناطيسي النووي)

  1. إعداد 15ن المسماة NBB1-156 بتعبير البروتين القياسية وتنقية كما هو موضح سابقا24.
  2. حل 500 ميكروغرام ملح الأمونيوم 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoinositol (18:0 PI) وملح الأمونيوم 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-myo-inositol) (18:1 PI) في 500 ميليلتر من المثلج تشكل3 كل للتركيزات النهائية 1 ملغ/مل.
  3. Sonicate 1 ملغ/مل 18:0 و 18:1 PI في حمام مائي سونيكيشن لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة أو ما يصل إلى 5 دقائق في أن خليط الماء المثلج.
  4. الكوة 1 ملغ/مل 18:0 و 18:1 PI في قارورة زجاج نظيفة لسلسلة المعايرة الرنين المغناطيسي النووي الفردية (الشكل 4). نقل الدهون في المذيبات العضوية باستخدام المحاقن الزجاجية الغلق.
    1. اليكووت ميليلتر 132 1 ملغ/مل 18:1 PI (كتلة المولى = 880.137 g/mol) في تشكل3 لوحدة تخزين استثارة نهائي من 1,200 ميليلتر في 125 ميكرومتر تركيز.
      ملاحظة: لأنابيب 5 مم الرنين المغناطيسي النووي، وإعداد وحدات تمييع المسلسل من > 1000 ميليلتر والرنين المغناطيسي النووي النهائي كميات من عينة > 500 ميليلتر. لأنابيب 3 مم الرنين المغناطيسي النووي، وإعداد وحدات تمييع المسلسل من > 300 ميليلتر والرنين المغناطيسي النووي النهائي العينة وحدات التخزين من > 150 ميليلتر.
  5. الكوة 1 ملغ/مل الخنزير الدماغ ملح الأمونيوم L-α-فوسفاتيديلينوسيتول-4، 5-بيسفوسفاتي في 20:9:1 شكل3/ميوه/ح2س (الدماغ PI (4، 5) ف2) في قارورة زجاج نظيفة.
  6. ضع قارورة تحت تيار غاز الأرجون (Ar) أو النيتروجين (N2) مع تدفق معتدل تتبخر المذيبات العضوية دون الرش ضد جدران القنينة الزجاجية. خمس وثلاثين دقيقة غير كافية عادة لكميات من 10 – 200 ميليلتر المذيبات العضوية.
  7. ترتيب vial(s) الزجاج في أسفل [بشنر] أو فراغ قارورة ملاقط كبيرة، باستخدام ختم مع سداده مطاطية، وإرفاق أنابيب بلاستيكية متصلة بخط فراغ. إخلاء قارورة تحت فراغ خفيف بين عشية وضحاها إزالة المواد العضوية المتبقية.
  8. تراكب مختبرين الفيلم الدهن مع غاز خامل وختم مع غطاء محكم وتخزينها في-20 درجة مئوية للاستخدام في غضون شهر واحد أو-80 درجة مئوية للتخزين طويل الأجل.
  9. تجهيز المخازن المؤقتة للعينة الرنين المغناطيسي النووي دون المنظفات (-ديت) الذي يحتوي على 20 مم ناسحصص. ب4 الرقم الهيدروجيني 6.8، % 10 د2س ومع المنظفات (+ ديت) الذي يحتوي على 20 مم ناسحصص. ب4 الرقم الهيدروجيني 6.8، % 10 د2س، 0.34 مم ن-دوديسيل-β-د-مالتوبيرانوسيدي (DDM).
  10. إضافة + ديت المخزن المؤقت لقنينة الزجاج مع الفيلم الدهن لتحقيق التركيز المطلوب و sonicate في حمام الماء لمدة تصل إلى 30 دقيقة، بالتناوب سونيكاتيون لمدة 10 دقائق تليها التفتيش البصري.
    ملاحظة: قد سونيكيشن الحارة عينة. السماح لتبرد على درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة قبل إعادة تشكيل نموذج البروتين النهائي.
  11. أداء المسلسل تمييع المذيلات الدهن-المنظفات في + ديت المخزن المؤقت باستخدام سونيكيشن خلائط 1:1 لسلسلة التركيز المطلوب. بدءاً من 125 ميكرومتر الدهن التركز، سوف تسفر عن التكرار ثلاثة 62.5 ميكرون، 31.3 ميكرومتر والدهن ميكرومتر 15.6 مم 0.34 DDM.
  12. إعداد التحكم وإشارة الرنين المغناطيسي النووي في عينات من البروتين والمواد المضافة في-ديت و + ديت المخازن المؤقتة، على التوالي. إضافة البروتين والمواد المضافة إلى إضعاف كل من المادة الدهنية في + ديت المخزن المؤقت.
    ملاحظة: ل NBB ن 15156، هو إضافة إلى تركيز نهائي من 40 ميكرومتر وتستكمل مع ديثيوثريتول الديوتيريوم 2 مم للحفاظ على بقايا Cys خفض البروتين.
  13. نقل حجم العينات المناسبة لأنابيب الرنين المغناطيسي 5 مم أو 3 مم (انظر الملاحظة في الخطوة 5، 4).
  14. تحميل عينات في الصك الرنين المغناطيسي أو ترتيب في منصة التشغيل الآلي مثل المحمل سامبليكاسي يدوياً.
  15. الحصول على مركب أطياف الرنين المغناطيسي استخدام البرامج القياسية نبض للاطياف بروتون ح 1كمراقبة الجودة تليها 2D 1ح-15ن ترابط الأطياف سواء بصفة عرضية الاسترخاء الأمثل التحليل الطيفي (ترسي) أو هيتيرونوكلير متعددة الكم الاتساق (سوفاست-همقك)33.
    ملاحظة: يتطلب استخدام أنابيب 3 مم الرنين المغناطيسي مسح 64 ح 1-15ترسي ن (ح ~ 3) أو 1ح-15N سوفاست-همقك (~ 90 دقيقة). تفحص أرقام هي النصف لأنابيب 5 مم الرنين المغناطيسي النووي.
  16. يمكن إضافة أطياف الرنين النووي المغناطيسي ثنائية الأبعاد المجهزة إلى مستودع كارا34 للتحليل أو غيرها من البرامج المفضلة للمستخدم.
  17. تحليل البرمجيات بالتأشير في 2D الأصداء الرنين المغناطيسي لثلاث قمم مشتتة جيدا وحل لكل دولة البروتين. سجل ستريك الذروة لكل من قمم ستة لكل شرط المخزن المؤقت الذي يحتوي على NBB156 (الشكل 5ألف).
    1. استخدم كارا لإعداد قائمة بدفعه لاندماج (القائمة الرئيسية انقر فوق عنوان "الطيف | إعداد قائمة الدفعة "...) جميع الأطياف جمعها وتحليلها باستخدام ملف تعيين ذروة واحدة (القائمة الرئيسية انقر فوق عنوان "قمم | استيراد بياكليست ".. اختر ملف.peaks المعرفة من قبل المستخدم مع قمم إجمالي 6, 3 لكل دولة البروتين، المعرفة داخل).
    2. ضبط الإعدادات ("موحد | ضبط نموذج الذروة "...) للعرض X Y-العرض و 0.06 جزء في المليون 0.30 جزء في المليون (العنوان انقر فوق القائمة الرئيسية "موحد | ضبط نموذج الذروة "...) قبل تسجيل الإخراج النهائي في تحديدات القائمة اثنين (1. انقر فوق عنوان القائمة الرئيسية "موحد | دمج قائمة الدفعة ") (2. انقر فوق عنوان القائمة الرئيسية "قمم | تصدير جدول التكامل ") (الشكل 5ب).
      ملاحظة: تم تعيينها الأصداء أميد العمود الفقري لبقايا M21، V53، و L105 للدولة قوس إغلاق156 NBB. تم تعيين الدولة قوس فتح العمود الفقري أميد الأصداء من بقايا G130 و A141 وابسيلون بروتون سلسلة الجانب صدى من W133 استخدام تجارب الرنين المغناطيسي 3D24.
  18. تطبيع عينات للمقارنة المباشرة من المغناطيس مختلفة أو شروط العينة بمتوسط الاتساع قوس فتح ثلاث عينات مرجعية وحساب عامل تطبيع المتعلقة بهذين المرجعين. حساب الاتساع المحجمة للأصداء156 NBB باستخدام عامل تطبيع وستريك الإعداد السالبة إلى الصفر (الجدول 2).
    أمثلة: 1) مقارنة عينات من المغناطيس مختلفة: المغناطيس A، NBB156+ DDM والمغناطيس ب، NBB156+ DDM. 2) مقارنة المنظفات: DDM 0.34 و 1.7 ملم DDM.
  19. حساب لكل صدى الكسر المحجمة من إغلاق-أو فتح-قوس بتقسيم مجموعة من الحد الأدنى إلى الحد الأقصى من السعة من جميع الأطياف المجمعة التي تحتوي على مراجع مناسبة الحرة NBB156 والكامل-قوس فتح NBB156 في المنظفات.
  20. ارسم ستريك الرنين المغناطيسي طبيعية كدالة لتركيز الدهن وقارن جزء صغير من قوس فتح NBB156 في ظروف مختلفة (الشكل-5 ج).
    ملاحظة: بدلاً من ذلك، من جزء تكيف قوس إغلاق ضد تركيز الدهن يمكن إجراء تحليل مقارنة ربط دهني NBB156. ونحن نفضل التحليل السابق لأنها أسرع وأفضل التقارير على الكسر-منخرطة تماما من الدهون.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

تصور تنفيذ التنظيم نيكروبتوسيس في الخلايا الحية وقد أمكن من خلال التعبير إيندوسيبلي لبناء ملكل مبتوراً الحد الأدنى، NBB140-2xFV-فينوس. هذا البناء يحافظ على القدرة على حمل permeabilization غشاء البلازما ويتم تفعيلها من خلال أوليجوميريزيشن المستحثة خافت من كاسيت فكبب (2xFV). نحن م?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

نحن توفير بروتوكولات للتقنيات التي نحن جنبا إلى جنب لتورط ملكل هو الجلاد المفترضة ل تمزق الأغشية البلازمية24. بالإضافة إلى فك رموز الشبكة التنظيمية التي تنظم بوساطة ملكل نيكروبتوسيس، يمكن استخدام هذه التقنيات بشكل مستقل لتوصيف النظم البيولوجية المناسبة الأخرى. من الناحية ال...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

لا شيء.

Acknowledgements

لا شيء.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Cloning and cell line generation
pRetroX-TRE3GClontech631188
Tet-On transactivator plasmidLlambi et al., 2016
Mouse Embryonic Fibroblasts (MEFs) mlkl-/-Dillon et al., 2014
Blasticidin S HydrochlorideThermo Fisher ScientificBP2647100 CAS#3513-03-9
Cell death quantification and live-cell microscopy
DoxycyclineClontech631311 CAS# 24390-14-5
B/B Homodimerizer AP20187Takara635059 CAS# 195514-80-8
SYTOX GreenThermo Fisher ScientificS7020
Syto16Thermo Fisher ScientificS7578
NMR
15 N Ammonium ChlorideCambridge Isotope LaboratoriesNLM-467-10 CAS# 12125-02-9
Deuterated DTTCambridge Isotope LaboratoriesDLM-2622-1
Deuterium OxideSigma Aldrich617385-1 CAS# 7789-20-0
n-Dodecyl-β-D-MaltopyranosideAnatraceD310 CAS# 69227-93-6
L-α-phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate (Brain, Porcine) (ammonium salt)Avanti Polar Lipids840046X CAS# 383907-42-4
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoinositol (ammonium salt) (18:0 PI)Avanti Polar Lipids850143 CAS# 849412-67-5
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-myo-inositol) (ammonium salt) (18:1)Avanti Polar Lipids850149 CAS# 799268-53-4
Specialized Equipment
IncuCyte FLR or ZOOMEssen BioScience, Inc.Live-cell microscopy imaging
Helios NanoLab 660 DualBeam Thermo Fisher ScientificElectron microscope
Software
IncuCyte 2011A Rev2 v20111.3.4288 (FLR)Essen BioScience, Inc.http://www.essenbioscience.comImaging analysis
FEI MAPSThermo Fisher Scientifichttps://www.fei.com/software/maps/EM analysis
TopSpin v3.2Bruker BioSpinhttp://www.bruker.comNMR data collection
CARA v1.9.1.7http://cara.nmr.ch/ NMR data analysis
Slidebook3i (Intelligent Imaging Innovations)https://www.intelligent-imaging.com/slidebookConfocal microscopy

References

  1. Weinlich, R., Oberst, A., Beere, H. M., Green, D. R. Necroptosis in development, inflammation and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (2), 127-136 (2017).
  2. Kaiser, W. J., et al. RIP3 mediates the embryonic lethality of caspase-8-deficient mice. Nature. 471 (7338), 368-372 (2011).
  3. Murphy, J. M., et al. The pseudokinase MLKL mediates necroptosis via a molecular switch mechanism. Immunity. 39 (3), 443-453 (2013).
  4. Oberst, A., et al. Catalytic activity of the caspase-8-FLIP(L) complex inhibits RIPK3-dependent necrosis. Nature. 471 (7338), 363-367 (2011).
  5. Zhang, H., et al. Functional complementation between FADD and RIP1 in embryos and lymphocytes. Nature. 471 (7338), 373-376 (2011).
  6. He, S., et al. Receptor interacting protein kinase-3 determines cellular necrotic response to TNF-alpha. Cell. 137 (6), 1100-1111 (2009).
  7. Dondelinger, Y., Hulpiau, P., Saeys, Y., Bertrand, M. J. M., Vandenabeele, P. An evolutionary perspective on the necroptotic pathway. Trends in Cell Biology. 26 (10), 721-732 (2016).
  8. Newton, K., Manning, G. Necroptosis and Inflammation. Annual Review of Biochemistry. 85, 743-763 (2016).
  9. Kaiser, W. J., Upton, J. W., Mocarski, E. S. Viral modulation of programmed necrosis. Current Opinion in Virology. 3 (3), 296-306 (2013).
  10. Newton, K., et al. RIPK3 deficiency or catalytically inactive RIPK1 provides greater benefit than MLKL deficiency in mouse models of inflammation and tissue injury. Cell Death & Differentiation. 23 (9), 1565-1576 (2016).
  11. Kearney, C. J., Martin, S. J. An Inflammatory Perspective on Necroptosis. Molecular Cell. 65 (6), 965-973 (2017).
  12. Pasparakis, M., Vandenabeele, P. Necroptosis and its role in inflammation. Nature. 517 (7534), 311-320 (2015).
  13. Sun, L., Wang, X. A new kind of cell suicide: mechanisms and functions of programmed necrosis. Trends in Biochemical Sciences. 39 (12), 587-593 (2014).
  14. Grootjans, S., Vanden Berghe, T., Vandenabeele, P. Initiation and execution mechanisms of necroptosis: an overview. Cell Death & Differentiation. 24 (7), 1184-1195 (2017).
  15. Sun, L., et al. Mixed lineage kinase domain-like protein mediates necrosis signaling downstream of RIP3 kinase. Cell. 148 (1-2), 213-227 (2012).
  16. Wang, H., et al. Mixed lineage kinase domain-like protein MLKL causes necrotic membrane disruption upon phosphorylation by RIP3. Molecular Cell. 54 (1), 133-146 (2014).
  17. Cai, Z., et al. Plasma membrane translocation of trimerized MLKL protein is required for TNF-induced necroptosis. Nature Cell Biology. 16 (1), 55-65 (2014).
  18. Chen, X., et al. Translocation of mixed lineage kinase domain-like protein to plasma membrane leads to necrotic cell death. Cell Research. 24 (1), 105-121 (2014).
  19. Dillon, C. P., et al. RIPK1 blocks early postnatal lethality mediated by caspase-8 and RIPK3. Cell. 157 (5), 1189-1202 (2014).
  20. Rickard, J. A., et al. RIPK1 regulates RIPK3-MLKL-driven systemic inflammation and emergency hematopoiesis. Cell. 157 (5), 1175-1188 (2014).
  21. Kaiser, W. J., et al. Toll-like receptor 3-mediated necrosis via TRIF, RIP3, and MLKL. Journal of Biological Chemistry. 288 (43), 31268-31279 (2013).
  22. Upton, J. W., Kaiser, W. J. DAI Another Way: Necroptotic Control of Viral Infection. Cell Host & Microbe. 21 (3), 290-293 (2017).
  23. Tanzer, M. C., et al. Necroptosis signalling is tuned by phosphorylation of MLKL residues outside the pseudokinase domain activation loop. Biochemical Journal. 471 (2), 255-265 (2015).
  24. Quarato, G., et al. Sequential Engagement of Distinct MLKL Phosphatidylinositol-Binding Sites Executes Necroptosis. Molecular Cell. 61 (4), 589-601 (2016).
  25. Davies, K. A., et al. The brace helices of MLKL mediate interdomain communication and oligomerisation to regulate cell death by necroptosis. Cell Death & Differentiation. , (2018).
  26. Su, L., et al. A plug release mechanism for membrane permeation by MLKL. Structure. 22 (10), 1489-1500 (2014).
  27. Dondelinger, Y., et al. MLKL compromises plasma membrane integrity by binding to phosphatidylinositol phosphates. Cell Reports. 7 (4), 971-981 (2014).
  28. Llambi, F., et al. BOK Is a Non-canonical BCL-2 Family Effector of Apoptosis Regulated by ER-Associated Degradation. Cell. 165 (2), 421-433 (2016).
  29. Malkani, N., Schmid, J. A. Some secrets of fluorescent proteins: distinct bleaching in various mounting fluids and photoactivation of cyan fluorescent proteins at YFP-excitation. PLoS One. 6 (4), 18586(2011).
  30. Perez, A. J., et al. A workflow for the automatic segmentation of organelles in electron microscopy image stacks. Frontiers in Neuroanatomy. 8, 126(2014).
  31. Walton, J. Lead aspartate, an en bloc contrast stain particularly useful for ultrastructural enzymology. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 27 (10), 1337-1342 (1979).
  32. Denk, W., Horstmann, H. Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure. PLoS Biology. 2 (11), 329(2004).
  33. Rossi, P., Xia, Y., Khanra, N., Veglia, G., Kalodimos, C. G. 15N and 13C- SOFAST-HMQC editing enhances 3D-NOESY sensitivity in highly deuterated, selectively [1H,13C]-labeled proteins. Journal of Biomolecular NMR. 66 (4), 259-271 (2016).
  34. Keller, R. The computer aided resonance assignment tutorial. Cantina Verlag. , (2004).
  35. Chen, W., et al. Diverse sequence determinants control human and mouse receptor interacting protein 3 (RIP3) and mixed lineage kinase domain-like (MLKL) interaction in necroptotic signaling. Journal of Biological Chemistry. 288 (23), 16247-16261 (2013).
  36. Tanzer, M. C., et al. Evolutionary divergence of the necroptosis effector MLKL. Cell Death & Differentiation. 23 (7), 1185-1197 (2016).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

138 permeabilization

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved