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요약

우리는 스캐닝 전자 현미경 검사 법, 및 NMR 기반 지질 바인딩 전통과 confocal 라이브 셀 현미경 이미징를 포함 하는 necroptosis에서 MLKL-중재 원형질 막 파열의 방법 보고.

초록

Necroptosis는 단백질 키 니 아 제 3 (RIPK3), phosphorylates 및 혼합된 계보 니 같은 도메인 pseudokinase, MLKL, 파열 또는 permeabilize 원형질 막 활성화는 상호 작용 하는 수용 체의 활성화에 의해 트리거되는 프로그램된 한 세포 죽음 통로 . Necroptosis 면역, 감염 및 심장 혈관 질환, 뇌졸중, neurodegeneration, 그리고 암 등 여러 병 리와 관련 된 염증 통로 이다. 여기, 우리는 necroptosis에 플라즈마 막 파열의 사형 집행으로 MLKL 특성을 사용할 수 있는 프로토콜을 설명 합니다. 우리 전통과 공초점 형광 현미경 검사 법, 함께 라이브 셀 이미징 사용 하 여 셀에 함께 계시는 플라즈마는 cytosol에서 MLKL의 재배포 전자 현미경을 사용 하 여 고정된 셀에 necroptosis의 과정을 시각화 원형질 막에 큰 구멍의 유도 전에 막. 핵 자기 공명 (NMR) 분석 생체 외에서 지질을 사용 하 여 necroptosis MLKL 중재의 putative 변조기를 식별 하는 선물이. 이 방법에 따라, 우리 됨으로 양적 지질 바인딩 환경과 phosphatidyl-이노 시 톨 인산 염 (PIPs) MLKL의 원형질 막 지정 하 고 necroptosis에 permeabilization에 필요한 중요 한 바인더.

서문

Necroptosis의 유전자 구성 요소를 식별 생리학과 질병1,2,3,,45necroptosis의 의미를 테스트 동물 모델의 사용을 촉진 했다. 녹아웃 쥐에 RIPK3 또는 MLKL의 제안 하는 necroptosis는 생활3,6에 대 한 필수적인 개발 및 성인 항상성에서 최소한의 의미를 했다. 또한, 특정 종 동물7,8necroptosis의 비 본질적인 역할을 지 원하는 RIPK3 또는 MLKL 유전자를 포함 하지 않습니다. 다른 한편으로, 염증, 타고 난 면제 및 바이러스 감염9,10, necroptosis의 중요 한 역할을 계시 했다 다양 한 병 리 실험실에서 유도 된 녹아웃 동물 모델 도전 11 , 12.

Necroptosis는 여러 가지 방법으로 다른 타고 난 면역 센서를 통해 신호에 의해 활성화 될 수 있다 RIPK31,,1314의 활성화에 결과의 모든. Active RIPK3에서 phosphorylates 및 MLKL3,,45,6,7,,89,10 를 활성화 11,12,13,14,15,,1617,18. 가장 공부 하 고 아마도 가장 복잡 한 방법, RIPK3의 활성화로 이어지는 죽음 수용 체 결 찰, 분기는 apoptosis 또는 necroptosis1을 유도 하거나 신호 복합물의 다운스트림 구성에 따라 포함 됩니다. Necroptosis 때 RIPK1를 통해 신호 선호 RIPK319,20의 교전에서 결과 인가요. 이 결과 쉽게 약리 억제 또는 caspase 8, 베이에서 necroptosis을 유지 하는 necroptosis의 상 상속 생 억제제의 유전 삭제 시 선호 합니다. RIPK1을 하 고 RIPK3를 활성화 합니다. 또 다른 방법은 necroptosis 활성화 하입니다 수용 체 통행세 같이 TLR3/TLR4 신호, 종사 하 고 유도 하는 어댑터 인터페론-β (TRIF) 사격 도메인 포함21를 통해 RIPK3를 활성화. 아직 necroptosis에 의해 죽고 또 다른 방법은 DNA 센서 다이, 직접 종사 하 고 활성화 하는 RIPK322의 활성화입니다.

MLKL는 N 맨끝 나선 번들 (NB) 도메인 및 규제 중괄호 지역3로 연결 단자 pseudokinase 도메인 (psKD)의 구성 cytosolic 단백질 이다. 정상 세포에서 MLKL RIPK314와 비활성 복잡 한에 생각 된다 cytosol에서 발견 된다. Necroptosis의 활성화는 psKD, 그리고 주의 중괄호3,,1523에 잠재적으로 추가 사이트의 활성화 루프에서 MLKL의 RIPK3 인 산화를 트리거합니다. 인 산화 MLKL RIPK314에서 분리 결과에 구조적 변화를 유도 합니다. 불완전 하 게 이해 구조적 변화 psKD24에서 중괄호를 놓습니다. 2 나선 포함, 중괄호, oligomerization MLKL의 C-터미널 나선25통해 putative 삼합체에 중재. 중괄호의 N 맨끝 나선 막 permeabilization24,26필수적 이다 NB 도메인 억제. 격리, NB 도메인은 원형질 막 permeabilization와 necroptosis16,,2427유도 충분 합니다. NB의 프로 necroptotic 활동은 마우스 미 발달 섬유 아 세포 MLKL (mlkl-/- MEFs)의 결핍에서 재구성 된다. NB는 우선적으로 종사 하는 인지질 phosphatidylinositol 4, 5 diphosphate (핍2) 지질 바인딩 도메인입니다. 우리는 어떤 점에서 중괄호 oligomerization 핍2 북극 머리 그룹24NB의 약한 상호 작용을 통해 플라즈마 막에 MLKL의 모집을 용이 하 게 MLKL의 활성화의 stepwise 메커니즘을 제안 했다. 막에서 주의 핍2는 중괄호 비활성 MLKL에 의해 마스크에 대 한 추가 높은 친 화력 바인딩 사이트의 규제 노출을 겪 습. 이러한 이벤트의 분자 메커니즘 해명 하지는 있지만 전반적으로, 핍2 NB의 여러 상호 작용 원형질 막의 파열으로 이어지는 불안정.

여기 우리 necroptosis24의 사형 집행으로 MLKL의 기능을 특성화 하는 데 사용 하는 특정 방법을 설명 합니다. 특히, 우리는 MLKL, NB (NBB), 중괄호는 중괄호 억제에 의해 규제 및 적용된 이합체 화 유도 플라즈마 막 파열 및 necroptosis를 통해 활성화 될 수 있다의 가장 최소한의 도메인에 초점. 우리는 우리의 유도할 수 있는 식 시스템 적용된 약물 유발 FKBP 중재 이합체 화 라이브 셀 이미징, 및 necroptosis를 받고 세포의 전자 현미경과 함께 설명 합니다. 또한, 우리 우리의 생체 외에서 NMR 분석을 phosphatidylinositols (PIPs)와 NBB의 상호 작용을 보여 줍니다.

프로토콜

1. 복제 및 셀 라인 생성

  1. PCR 증폭 NBB 지역 해당 아미노산 잔류물 1-140 (NBB140), 인간 MLKL cDNA에서에 대 한 프레임 표준 제한 효소 기반 복제 oligomerization 도메인 2 x FK506 의무적인 단백질 (2xFKBP 또는 2xFV)와 금성 형광에 하 단백질에 Doxycycline (Dox)-NBB140를 유도할 수 있는 retroviral 벡터 pRetroX-TRE3G-2xFV-금성 (표 1, 그림 1A-B).
  2. 기본 mlkl또는 ripk3-/- mlkl-/- -/- 마우스 미 발달 섬유 아 세포 (MEFs) 과도 transfection SV40 큰 항 원과 녹색 실험실에서 사용할 수 있는 각 생쥐에서 얻은 불멸 플라스 미드를 표현합니다. ~ 1-2에서 불멸 하 게 셀을 선택, 주 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 2 mM L-글루타민, 100 U/mL 페니실린과 스, 1mm 나트륨 pyruvate, 표준 조직에서 37 ° C, 5% CO2 에서 불필요 한 아미노산 보충 DMEM에 유지 하 고 문화 인큐베이터입니다.
  3. SV40 불후 mlkl-/- MEFs 제어 역방향 항생물질 transactivator (rtTA)와 transduce-blasticidin 저항 유전자 (우리의 수정된 플라스 미드)를 포함 하는 플라스 미드에서 표현 하는 레트로 바이러스를 포함 하 고 1에 대 한 치료 5 μ g/mL blasticidin rtTA28안정적으로 표현 하는 셀에 대 한 선택과 주.
  4. 공상 MLKL를 포함 하는 Dox를 유도할 수 있는 retroviral 벡터와 rtTA 표현 MEFs transduce (pRetroX-NBB140-2xFV-금성-순수 하지 않아) 4 μ g/mL puromycin를 사용 하 여 변환 후 1 주 2 일에 대 한 선택.

2. 라이브 셀 현미경 이미징 Necroptosis MLKL 중재의

  1. 플레이트 mlkl-/- NBB140을 표현 하는 MEFs-2xFV-24에서 잘 (1 mL/잘) 당 50, 000 셀의 밀도에서 금성 판, 고 밤새 품 어 (그림 2A). 라이브 셀 자동된 셀 카운팅 ( 재료의 표참조)에 대 한 얼룩 사용 합니다.
  2. Dox 12 h에 대 한 세포 치료 (0.5 μ g/mL) NBB140의 표현을 유도-2xFV-금성.
  3. 25 nM 멤브레인 스며들 지 않는 녹색 형광 외 25 nM FKBP dimerizer (Dim)와 necroptosis를 유도 표준 DMEM에 ( 재료의 표참조) 염색 (1.2 참조). NBB140에 의해 그들의 원형질 막 무결성은 손상으로 necroptosis를 받고 셀 염료 축적-파열 중재. 3 중 또는 quadruplicate에서 분석을 수행 합니다.
  4. 단일 또는 듀얼 컬러 이미징 시스템 ( 재료의 표참조)를 사용 하 여 necroptosis을 모니터링 하려면 혈관 포유류 조직 문화 인큐베이터에 각각 이미징 장치에 놓습니다.
  5. 소프트웨어를 오픈 ( 재료의 표참조) 곧 스캔 작업 목록에서 일정 탭을 선택.
    참고:: 이 프로토콜은 단일 색상 시스템을 사용 하 여 이미징 이지만 비슷한 소프트웨어가 듀얼 컬러 시스템에서 사용할 수 있습니다.
  6. 속성 탭에서 "실제 레이아웃" 탭에 "빨리 형광" "쟁반, 그릇, 검색 유형", 그리고 "스캔 패턴"을 선택 합니다.
  7. "스캔 시간"를 클릭 하 여 "타임 라인" 창에 총 시간 포인트와 수집 (일반적으로 1 수집 1 h 6 12 h, h 또는 빠른-속도 론 necroptosis에 대 한 모든 5 분 마다 0.5 h)의 주파수를 추가 하 고 "응용 프로그램을 선택 하 여 이미지 수집 시작 히 "(빨간 버튼)
  8. Necroptosis 이미지 분석 소프트웨어를 사용 하 여 계량 ( 재료의 표참조) ","개체 세기 새로운 분석 배경 수준 이상의 고정 분할 임계값"," 작업 창에서 선택 하 여를 유혹 하 여 결정 될 수 있다는 분석에 사용 된 여러 이미지에 배경 영역에 마우스 커서입니다.
  9. 현재 이미지를 사용 하 여 Previewing를 선택 하 여 형광 개체를 검토 하 고 필요에 따라 임계값 수준을 수정.
  10. "발사 새로운 분석" 탭을 열어 녹색 형광 카운트를 통합, "시간 범위"를 선택, 선택 분석 "분석 작업 이름"를 입력 하 고 "확인"을 눌러 하 웰 스.
  11. 액세스 각 작업 이름을 두 번 클릭 하 고 외부 그래픽 소프트웨어에서 추가 분석을 위해 그래프/내보내기 창에서 내보내기로 "분석 작업" 탭에서 데이터를 분석 ( 재료의 표참조).
  12. 녹색 형광 긍정적인 (+ ve)으로 데이터 카운트/m m2 을 quantitate 또는 합류 하 여 카운트를 정상화 하 고 녹색 형광 + ve 카운트/합류로 데이터를 표현 한다.
  13. 필요에 따라 실험 끝점에서 100 셀 얼룩 막 permeant 녹색 형광의 nM 염색 ( 재료의 표참조). 끝점에서 녹색 형광/녹색 형광의 비율로 서 %necroptotic 셀으로 데이터를 정상화.

3. 라이브 셀 Confocal 현미경 이미징 플라즈마 멤브레인 모집 및 MLKL에 의해 Permeabilization의

  1. 플레이트 mlkl-/- NBB140을 표현 하는 MEFs-2xFV-유리에 잘 (0.5 mL/잘) 당 20000 셀의 밀도에서 금성 4 잘 현미경 챔버와 PBS에서 30 분 동안 37 ° C에서 50 µ g/mL fibronectin 청소용된 바닥, ~ 12 h ( 에 대 한 품 어 그림 2B).
  2. Dox 셀 치료 (0.5 μ g/mL) ~ 12 h NBB140의 표현을 유도를 위한-2xFV-금성.
  3. Necroptosis 25 포함 된 신선한 매체 (1 mL/음) 잠복기에 의해 유도 nM NBB140유도 Dim-2xFV-금성 활성화와 전 좌 원형질 막에.
  4. 환경 제어와는 63 거꾸로 스탠드에 내장 하는 confocal 현미경 검사는 회전 디스크 레이저 챔버 위 1.4 나 목표 수집 선택의 소프트웨어를 사용 하 여 이미징 시작 ( 재료의 표참조).
  5. 소프트웨어를 초기화, 선택 하 고 "포커스" 아이콘과 YFP 필터 구성 (여기 파장 515 nm).
  6. 보기의 필드와 초점 비행기를 찾아서 "명확한 초점" 탭을 사용 하 여 시스템을 유지 관리 하는 초점을 참여.
  7. 수집을 시작 하려면 다음 필터 구성, 적절 한 EMCCD 카메라 노출 시간과 강화, 및 이득 취득의 길이 간격을 포함 하 여 시간 경과 인수 매개 변수 할당 "캡처" 탭을 선택 합니다.
  8. 형광 NBB140의 세포질 재분배를 모니터링-2xFV-necroptosis 인수 동안 금성 단백질 이미지 마다 10 EMCCD 카메라 (동영상 1) 515 nm 레이저를 사용 하 여 s.
    참고: Photobleaching 형광 단백질 영상과 관심사 이다. 금성은 photobleaching29에 더 강한 형광 단백질 중 하나입니다. 형광 단백질 photobleaching에 더 취약을 사용 하는 경우 이미지 매일 30 s 이상 이미징 시간 포인트 사이의 신호의 복구를 허용 하도록.
  9. NBB140의 플라즈마 멤브레인 협회를 모니터링 하려면-2xFV-necroptosis, 동안 금성 이미지 마다 10의 샘플 준비 3.3에서 총 내부 반사 형광에 의해 사용 하 여 자동화 된 TIRF 슬라이더를 갖춘 현미경 (TIRF) 현미경 및 100 X 1.4 나 목적 그리고 EMCCD 카메라 (동영상 2). 단계 3.5-3.7, 하지만 현미경 챔버의 샘플 및 아래쪽 유리 두께 따라 TIRF 초점 탭 TIRF 각도 조정.
    참고: LCK-C-RFP와 같은 플라즈마 멤브레인 마커로 사용할 수 있습니다 컨트롤로 TIRF 분석에서 플라즈마 멤브레인 지역화.
  10. 가우스 함수 (마 알고리즘)의 부정적인 정규화 된 두 번째 파생 된 회선으로 품질을 향상 시키기 위해 처리 하는 이미지를 수행 합니다.

4입니다. 전자 현미경 검사 법

  1. 플레이트 mlkl-/- NBB140을 표현 하는 MEFs-2xFV-플라즈마 코팅 150 m m에 5 백만 셀의 밀도에서 금성 문화 접시를 셀, 12 h (그림 3)에 대 한 품 어.
  2. Doxycycline 셀 치료 (0.5 μ g/mL) 주의1-140의 표현을 유도-2xFV-12 h에 대 한 비너스.
  3. 유도 NBB140-2xFV-금성 활성화 및 25와 원형질 막에 전 5 분 동안 homodimerizer의 nM. 이 이번 라이브 셀 이미징에 관찰 하는 necroptosis의 활동에서 설정 됩니다.
  4. 미디어를 제거 하 고 10 mL의 2.5%도, 2% paraformaldehyde 0.1 M 나트륨 cacodylate 버퍼 ph 7.4 (cacodylate 버퍼) 37 ° c.에 미리 예 열을 사용 하 여 셀을 수정
  5. 된다고 하 여 샘플을 수집 하 고 500 x g에서 10 분에 대 한 샘플을 회전. 폐기는 상쾌한.
  6. 0.1 M 나트륨 cacodylate 버퍼에 1.5% 칼륨 ferrocyanide 감소 2% 오스뮴 tetroxide에 1.5 h에 대 한 샘플 접미사 오스뮴 tetroxide 얼룩 에이전트에서에서 널리 이용 된다 가장 대비를 제공 하는. 우리는 SEM 셀 necroptosis를 겪고 전에 예비 분석으로 가장을 사용 합니다.
  7. 500 x g, 린스 버퍼에 다음에 5 번 5 분 초순에에서 샘플을 린스 (4.6 참조), 물, 그리고 자동 프로세서에 에탄올. 폐기는 상쾌한.
  8. SEM에 대 한 1 %uranyl 아세테이트와 aspartate 중 금속 얼룩31이전 고정된 샘플 얼룩.
  9. 탈수 알코올 및 프로필 렌 산화물 솔루션의 등급된 시리즈를 통해 샘플.
  10. 하드 수 지 수 지 블록을 얻기 위해32 에 샘플을 포함 합니다.
  11. 분석의 올바른 영역을 결정 하는 0.5 μ m의 두꺼운 부분을 잘라.
  12. 전기 전도성 금속 (리 듐)의 초박형 필름으로 샘플 코트.
  13. 이미지 및 분석 샘플 (그림 3). 정량화, 대 한 수 지 블록 표면에 노출 된 세포의 낮은 확대 이미지 5에서 스캔 되는 전자 현미경을 사용 하 여 케빈.
  14. SEM으로 촬영 된 개별 이미지에 걸쳐 세포를 시각화 하거나 이미징 소프트웨어 하나의 연속 이미지30으로 여러 분야의 보기 가입 활용 될 수 있습니다. 대략 100 셀 셀 선택의 소프트웨어에 고해상도 몽타주를 생성 하 여 이러한 방식으로 necroptosis를 겪고의 분수를 평가 하는데 사용 될 수 있습니다 ( 재료의 표참조).
    참고: 미리 괴 사 성 또는 괴 사 성 고기의 진행과 정상 세포 기능 비교 SEM으로 괴 사 성 형태를 채 점 합니다. 이러한 기능에는 원형질 막 변경 microvilli 실종을 포함 하 여, 병합, 10에서 배열 하는 셀에 파열 nm 1 µ m 크기, 또는 적어도 30-40%의 cytosolic 셀 영역에 걸쳐 세포 기관이 구조의 손실.

5. 핵 자기 공명 (NMR) 분광학에 의해 MLKL의 지질 바인딩

  1. 15N 표시 NBB1-156 표준 단백질 표정 및 앞에서 설명한24로 정화 하 여 준비 합니다.
  2. 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoinositol 염화 소금 (18:0 PI), 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-myo-inositol) 염화 소금 (18:1 PI) 얼음 처럼 차가운 CHCl3 각 1 mg/mL의 최종 농도 대 한 500 µ L에 500 µ g을 분해.
  3. 1 mg/mL 18:0, 18:1 실내 온도에서 1 분 동안 쥡니다 물 욕조에 PI를 sonicate 또는 얼음 물 혼합물에 5 분까지.
  4. Aliquot 1 mg/mL 18:0 고 개별 NMR 적정 시리즈 (그림 4)에 대 한 깨끗 한 유리 튜브로 18:1 PI. 유리 밀폐 주사기를 사용 하 여 유기 용 매에 있는 전송 지질.
    1. 1 mg/mL 18:1 PI의 aliquot 132 µ L (어 금 니 질량 = 880.137 g/mol) CHCl3 125 µ M 농도에서 1200 µ L의 최종 물의 resuspension 볼륨에 대 한.
      참고: 5mm NMR 튜브에 대 한 준비의 직렬 희석 볼륨 > 1000 µ L 및 최종 NMR 샘플의 볼륨 > 500 µ L. 3mm NMR 튜브에 대 한 준비의 직렬 희석 볼륨 > 300 µ L 및 최종 NMR 샘플의 볼륨 > 150 µ L.
  5. Aliquot 1 mg/mL 돼지 뇌 L-α-phosphatidylinositol-4, 5-bisphosphate 염화 소금 20:9:1 CHCl3/MeOH/H2O (뇌 PI (4, 5) P2) 깨끗 한 유리 튜브에.
  6. 아르곤 (Ar) 또는 질소 (N2) 유리 유리병 벽에 튀는 없이 유기 용 매를 증발을 적당 한 흐름의 가스 스트림 아래 튜브를 배치 합니다. 5 ~ 30 분 양의 10-200 µ L 유기 용 매에 대 한 일반적으로 충분 하다.
  7. 정렬 유리 vial(s) Büchner 또는 큰 족집게를 사용 하 여 진공 플라스 크의 하단에는 고무 마와 인감 및 진공 라인에 연결 하는 플라스틱 튜브를 연결. 잔여 유기 물 제거를 하룻밤 가벼운 진공 아래 플라스 크 철수
  8. 불활성 가스와 지질 영화 aliquots 오버레이, 밀폐 뚜껑으로 밀봉 하 고 장기 저장을 위해 사용 1 개월 이내 또는-80 ° C-20 ° C에서 저장 합니다.
  9. 세제 없이 NMR 샘플 버퍼 준비 (-Det) 20mm 나xHy포4 pH 6.8, 10% D2O와 20mm 나xHy포4 pH 6.8를 포함 하는 세제 (+ Det) 포함 된 10% D2O, 0.34 m m n-라우릴-β-D-maltopyranoside (DDM).
  10. 추가 + 원하는 농도 달성 하 여 최대 30 분, 10 분 동안 쥡니다 번갈아 물 목욕에서 sonicate 지질 영화와 유리 유리병에 Det 버퍼 다음 검사.
    참고: 쥡니다 샘플을 따뜻하게 수 있습니다. 최종 단백질 샘플 재구성 하기 전에 15 분 동안 실내 온도에 냉각 수 있습니다.
  11. 지질 세제 micelles + 1:1 혼합물의 쥡니다를 사용 하 여 원하는 농도 시리즈에 대 한 Det 버퍼의 직렬 희석을 수행 합니다. 125 µ M 지질 농도에서 시작, 3 개의 반복 62.5 µ M, 31.3 µ M, 및 0.34 m m DDM 15.6 µ M 지질 얻을 것입니다.
  12. 제어를 준비 하 고 단백질과-Det에 첨가제의 NMR 샘플을 참조 하 고 + Det 버퍼, 각각. 단백질 및 지질에의 각 희석에 첨가제 + Det 버퍼 추가 합니다.
    참고: 15N NBB156, 단백질은 40 µ M의 최종 농도에 추가 및 Cys의 잔류물 감소 계속 2mm deuterated dithiothreitol 보충.
  13. 3mm 또는 5mm NMR 튜브 (단계 5.4에서에서 참고 참조)을 샘플의 적절 한 볼륨을 전송 합니다.
  14. 수동으로 NMR 악기에서 샘플 로드 하거나 SampleCase 로더 같은 자동화 플랫폼에 정렬 합니다.
  15. 2D 1H-15N 상관 관계 스펙트럼 뒤에 최적화 된 가로 휴식 분광학 (TROSY)으로 품질 관리로 1H 양성자 스펙트럼에 대 한 표준 펄스 프로그램을 사용 하 여 복합 NMR 스펙트럼을 취득 또는 heteronuclear 여러 양자 일관성 (SOFAST-HMQC)33.
    참고: 3 mm NMR 튜브의 사용 1 H-15N TROSY (3 h) 또는 1H-15N SOFAST-HMQC (~ 90 분) 64 검사 필요합니다. 스캔 5mm NMR 튜브에 대 한 숫자를 절반 가까이 떨어졌다.
  16. 처리 된 2D NMR 스펙트럼 분석 또는 사용자에 게 선택의 다른 소프트웨어에 대 한 카라 저장소34 에 추가할 수 있습니다.
  17. 각 단백질 상태에 대 한 3 개의 잘 분산 및 해결 피크에 대 한 2D NMR 공명 하 여 소프트웨어를 분석 합니다. NBB156 (그림 5A)를 포함 하는 각 버퍼 조건에 대 한 6 개의 봉우리의 각 피크 진폭을 기록 합니다.
    1. 카라를 사용 하 여 일괄 통합 목록 준비 (클릭 메인 메뉴 제목 "스펙트럼 | 설치 일괄 처리 목록 "...) 모든 스펙트럼의 수집 하 고 단일 피크 할당 파일을 사용 하 여 분석 (클릭 메인 메뉴 제목 "봉우리 | Peaklist 가져오기".. 그리고 6 총 봉우리, 3 내에 정의 된 각 단백질 상태에 대 한 사용자 정의 된.peaks 파일을 선택).
    2. 설정을 조정 ("통합 | 조정 피크 모델 "...) X-폭의 0.06 p p m과 Y-폭 0.30 p p m (클릭 메인 메뉴 제목 "통합 | 조정 피크 모델 "...) 두 메뉴 선택 (1에서에서 최종 출력을 기록 하기 전에. 메인 메뉴 제목 클릭 "통합 | 통합 배치 목록") (2. 메인 메뉴 제목 클릭 "봉우리 | 통합 테이블 내보내기") (그림 5B).
      참고: 잔류물 M21, V53, 및 L105의 등뼈 아 미드 공명 NBB156 폐쇄 중괄호 상태에 대 한 할당 되었습니다. 오픈 중괄호 상태 G130 및 A141 잔류물의 등뼈 아 미드 공명과 엡실론 양성자 사이드 체인의 공명 W133 3D NMR 실험24를 사용 하 여에 할당 했다.
  18. 3 오픈 중괄호 진폭 참조 샘플의 평균 관련 된 두 개의 참조 정규화 요소를 계산 하 여 다른 자석 또는 샘플 조건에서 직접 비교를 위해 샘플을 정상화. NBB156 공명 정규화 요소 설정 부정적인 진폭을 사용 하 여 0 (표 2)에 대 한 확장 된 진폭을 계산 합니다.
    예제: 1) 다른 자석에서 샘플 비교: 자석 A, NBB156DDM과 자석 B, NBB156+ DDM. 2) 세제 비교: 0.34 m DDM m 및 1.7 mM DDM.
  19. 환산된 분수의 폐쇄-또는 오픈-중괄호 모든 스펙트럼의 최소 최대에 진폭의 범위와 함께 나누어 수집 무료 NBB156 와 완전히 오픈 중괄호 NBB156 에 적절 한 참조를 포함 하는 각 공명에 대 한 계산 세제입니다.
  20. 지질 농도의 기능으로 정규화 NMR 진폭을 플롯 하 고 오픈 중괄호 NBB156 다른 조건 (그림. 5 C)에서 일부를 비교 합니다.
    참고: 또는, 지질 농도 대 한 폐쇄 중괄호 구조의 분수의 분석 수행할 수 있습니다 NBB156에 지질 바인딩 비교 하. 우리는 때문에 더 빠른 더 나은 보고서는 분수에 완전히-약혼 지질에 의해 전 분석을 선호 합니다.

결과

라이브 셀에서 레 귤 레이트 된 necroptosis 실행 시각화 하는 최소한의 잘린된 MLKL 구문, NBB140의 유도할 수 있는 표현을 통해 가능 했습니다-2xFV-금성. 이 구조 원형질 막 permeabilization 유도 하는 기능을 유지 하 고 FKBP 카세트 (2xFV)의 oligomerization Dim 유도 통해 활성화 됩니다. 우리는 관찰 하 고 라이브 셀 현미경 이미징, 모니터링 운동 (5 분 마다) 셀 스며들 지 않는 녹색...

토론

우리는 우리가 MLKL 플라즈마 막 파열24의 putative 사형 집행으로 연루 결합 기술에 대 한 프로토콜을 제공 합니다. MLKL이 중재 necroptosis 규제 규제 네트워크 해독, 뿐만 아니라 이러한 기술은 사용할 수 있습니다 하지 독립적으로 다른 적당 한 생물 학적 시스템의 특성. 실질적으로 말하자면, 이러한 기술은 매체-낮은 처리량 검색 도구입니다.

우리는 정기적으로...

공개

없음입니다.

감사의 말

없음입니다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
Cloning and cell line generation
pRetroX-TRE3GClontech631188
Tet-On transactivator plasmidLlambi et al., 2016
Mouse Embryonic Fibroblasts (MEFs) mlkl-/-Dillon et al., 2014
Blasticidin S HydrochlorideThermo Fisher ScientificBP2647100 CAS#3513-03-9
Cell death quantification and live-cell microscopy
DoxycyclineClontech631311 CAS# 24390-14-5
B/B Homodimerizer AP20187Takara635059 CAS# 195514-80-8
SYTOX GreenThermo Fisher ScientificS7020
Syto16Thermo Fisher ScientificS7578
NMR
15N Ammonium ChlorideCambridge Isotope LaboratoriesNLM-467-10 CAS# 12125-02-9
Deuterated DTTCambridge Isotope LaboratoriesDLM-2622-1
Deuterium OxideSigma Aldrich617385-1 CAS# 7789-20-0
n-Dodecyl-β-D-MaltopyranosideAnatraceD310 CAS# 69227-93-6
L-α-phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate (Brain, Porcine) (ammonium salt)Avanti Polar Lipids840046X CAS# 383907-42-4
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoinositol (ammonium salt) (18:0 PI)Avanti Polar Lipids850143 CAS# 849412-67-5
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-myo-inositol) (ammonium salt) (18:1)Avanti Polar Lipids850149 CAS# 799268-53-4
Specialized Equipment
IncuCyte FLR or ZOOMEssen BioScience, Inc.Live-cell microscopy imaging
Helios NanoLab 660 DualBeam Thermo Fisher ScientificElectron microscope
Software
IncuCyte 2011A Rev2 v20111.3.4288 (FLR)Essen BioScience, Inc.http://www.essenbioscience.comImaging analysis
FEI MAPSThermo Fisher Scientifichttps://www.fei.com/software/maps/EM analysis
TopSpin v3.2Bruker BioSpinhttp://www.bruker.comNMR data collection
CARA v1.9.1.7http://cara.nmr.ch/ NMR data analysis
Slidebook3i (Intelligent Imaging Innovations)https://www.intelligent-imaging.com/slidebookConfocal microscopy

참고문헌

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