Charakterisierung der MLKL-vermittelten Plasmamembran Bruch in Necroptosis

Zusammenfassung

Wir berichten Methoden zur Charakterisierung von MLKL-vermittelten Plasmamembran Bruch in Necroptosis einschließlich konventioneller und konfokale live-Cell-Mikroskopie Bildgebung, Scannen, Elektronenmikroskopie und NMR-basierte Lipid-Bindung.

Zusammenfassung

Necroptosis ist ein programmierter Zelle Tod Weg, ausgelöst durch die Aktivierung des Rezeptors Interaktion Proteinkinase 3 (RIPK3), die phosphorylates und aktiviert die gemischte Abstammung Kinase-ähnliche Domäne Pseudokinase, MLKL, Bruch oder permeabilize der Plasmamembran . Necroptosis ist eine entzündliche Weg mehrere Pathologien einschließlich Autoimmunität, infektiöse und Herz-Kreislauferkrankungen, Schlaganfall, Neurodegeneration und Krebs zugeordnet. Hier beschreiben wir Protokolle, die verwendet werden, um MLKL als der Henker der Plasmamembran Bruch in Necroptosis zu charakterisieren. Wir visualisieren den Prozess der Necroptosis in Zellen mittels live Cell Imaging mit konventionellen und konfokale Fluoreszenzmikroskopie und in festen Zellen mittels Elektronenmikroskopie, die zusammen die Umverteilung von MLKL aus dem Zytosol in das Plasma enthüllt Membran vor Induktion von großen Löchern in der Plasmamembran. Wir präsentieren in Vitro Kernspinresonanz (NMR) Analyse mit Lipiden, um vermeintliche Modulatoren des MLKL-vermittelten Necroptosis zu identifizieren. Basierend auf dieser Methode, identifizierten wir quantitative Lipid-verbindliche Präferenzen und Phosphatidyl-Inositol Phosphate (PIPs) als kritische Bindemittel der MLKL, die für die Plasmamembran targeting und Permeabilisierung in Necroptosis erforderlich sind.

Einleitung

Identifizierung von genetischen Komponenten des Necroptosis hat die Verwendung von Tiermodellen, die Implikation des Necroptosis in Physiologie und Krankheit^1,2,3,4,5testen erleichtert. Ko von RIPK3 oder MLKL bei Mäusen hatten minimal Implikation in Entwicklung und Erwachsenen Homöostase, was darauf hindeutet, dass diese Necroptosis nicht für wichtig Leben^3,6. Darüber hinaus enthalten bestimmte Arten entweder RIPK3 oder MLKL Gene, Unterstützung der unwesentliche Rolle der Necroptosis in Tiere^7,8. Auf der anderen Seite hat anspruchsvolle ko Tiermodellen mit verschiedenen Pathologien im Labor induziert eine wichtige Rolle bei Entzündungen, angeborene Immunität und Virusinfektion^9,10, Necroptosis ergeben ^{11 , 12}.

Necroptosis kann auf verschiedene Weise durch Signalisierung durch verschiedene angeborene Immunität Sensoren aktiviert werden alle die sich bei der Aktivierung von RIPK3^1,13,14. Aktive RIPK3 wiederum phosphorylates und aktiviert MLKL^{3,4,5,6,7,8,9,10 ,11,12,13,14,15,16,17,18}. Die meisten studierte, und vielleicht der komplexeste Weg, führt zu einer Aktivierung des RIPK3 beinhaltet Tod Rezeptor Ligatur, die gabelt basierend auf die nachgelagerten Zusammensetzung der Signalisierung komplexe entweder induzieren Apoptose oder Necroptosis¹. Necroptosis entsteht, wenn durch RIPK1 Signalisierung begünstigt wird und zu Engagement von RIPK3^{19,20 führt}. Dieses Ergebnis ist leicht begünstigt auf pharmakologische Hemmung oder genetische Löschung von Caspase 8, eine vermeintliche endogener Inhibitor des Necroptosis, die Necroptosis in Schach hält. RIPK1 bindet an und aktiviert RIPK3. Eine weitere Möglichkeit, Necroptosis zu aktivieren ist durch Toll-Like-Rezeptoren TLR3/TLR4 Signaltechnik, die eingreift und aktiviert RIPK3 durch TIR-Domain-haltigen Adapter-induzierende Interferon-β (SIMPE)²¹. Noch ist eine andere Art zu sterben durch Necroptosis durch Aktivierung der DNA-Sensor DAI, der direkt eingreift und aktiviert RIPK3²².

MLKL ist ein cytosolischen Protein, bestehend aus einer N-terminalen Helix-Bundle (NB)-Domäne und einer C-terminalen Pseudokinase Domäne (PsKD) durch eine regulatorische Klammer Region³verbunden. In normalen Zellen ist MLKL in das Zytosol gefunden wo es angenommen wird, in einem inaktiven Komplex mit RIPK3¹⁴. Aktivierung des Necroptosis löst RIPK3 Phosphorylierung des MLKL in der Aktivierung der PsKD und möglicherweise weitere Standorte in der NB und Klammer^3,15,23. Phosphorylierung bewirkt eine Konformationsänderung in MLKL, der Dissoziation von RIPK3¹⁴führt. Schlecht verstandene Konformationsänderungen lassen Sie die Klammer aus dem PsKD²⁴. Die Klammer, die 2 Helices enthält, vermittelt Oligomerisierung von MLKL in einem vermeintlichen Trimer durch die C-terminale Helix²⁵. Die N-terminale Helix der Orthese hemmt die NB-Domäne, die für Membran Permeabilisierung^24,26unerlässlich. Isoliert reicht die NB Domäne Permeabilisierung der Plasmamembran und Necroptosis^16,24,27induzieren. Die Pro-Necroptotic-Aktivität der NB wurde in Maus einen Mangel an MLKL (Mlkl^{- / -} MEFs) embryonalen Fibroblasten rekonstituiert. NB ist ein Lipid-bindende Domäne, die bevorzugt die Phospholipid-Phosphatidylinositol-4,5-Diphosphat (PIP₂) eingreift. Wir haben einen schrittweisen Mechanismus der Aktivierung des MLKL, wobei Klammer Oligomerisierung erleichtert die Einstellung des MLKL in der Plasmamembran über schwachen Wechselwirkungen der NB mit dem PIP₂ polare Kopfgruppe²⁴vorgeschlagen. An der Membran erfährt die NB geregelten Exposition eine zusätzliche High-Affinity-Bindungsstelle für PIP₂, die durch die Orthese in inaktiven MLKL maskiert wird. Insgesamt destabilisieren mehrere Interaktionen der NB mit PIP₂ der Plasmamembran zu seinen Bruch, obwohl der molekulare Mechanismus dieser Ereignisse sind nicht geklärt.

Hier zeigen wir spezifische Methoden verwendet, um die Funktion des MLKL als Vollstrecker des Necroptosis²⁴charakterisieren. Insbesondere konzentrieren wir uns auf die minimalsten Domain MLKL, NB und Klammer (NBB) die Klammer Hemmung unterliegt und durch erzwungene Dimerisierung induzieren Plasmamembran Bruch und Necroptosis aktiviert werden können. Wir beschreiben unsere induzierbaren Expressionssystems kombiniert mit erzwungenen drogeninduzierte FKBP-vermittelte Dimerisierung für live Cell Imaging und Elektronenmikroskopie der Zellen Necroptosis. Darüber hinaus zeigen wir unsere in-vitro- NMR-Analyse der Interaktionen der BNB mit Phosphatidylinositols (PIPs).

Protokoll

1. Klonen und Zell-Linie-Generation

1. PCR verstärken die BNB-Region entspricht Aminosäurereste 1-140 (BNB₁₄₀), von menschlichen MLKL cDNA für Rahmen standard Restriktionsenzym-basierte Klonen mit Oligomerisierung Domäne 2 x FK506-bindendes Protein (2xFKBP oder 2xFV) und Venus Leuchtstofflampen Protein in Doxycyclin (Dox) - induzierbaren retroviral Vektor pRetroX-TRE3G, BNB₁₄₀zu erhalten - 2xFV-Venus (Tabelle 1, Figuren 1A-B).
2. Primäre Mlkl^{- /-} oder ripk3^{- / -} Mlkl^{- / -} Maus embryonale Fibroblasten (MEFs) erhalten aus den jeweiligen Mäusen, die in das grüne Labor durch Transiente Transfektion mit SV40-große Antigen zu verewigen mit dem Ausdruck Plasmid. Wählen Sie Zellen aus verewigt in ~ 1 – 2 Wochen, und pflegen in DMEM mit 10 % fetalen bovine Serum (FBS), 2 mM L-Glutamin, 100 U/mL Penicillin und Streptomycin, 1 mM Natrium Pyruvat und unwesentlichen Aminosäuren bei 37 ° C und 5 % CO₂ im standard Gewebe ergänzt Kultur-Inkubatoren.
3. Transduzieren SV40 verewigt Mlkl^{- / -} MEFs mit umgekehrter Tetracyclin kontrollierte transaktivator (RtTA)-enthält Retrovirus von ein Plasmid enthält die Blasticidin-Resistenz-Gen (unsere modifizierte Plasmid) ausgedrückt und Leckerbissen für 1 Woche mit 5 μg/mL Blasticidin für stabil auszudrücken RtTA²⁸Zellen auswählen.
4. Transduzieren RtTA exprimierenden MEFs mit Dox-induzierbaren retroviralen Vektors mit der Chimäre MLKL (pRetroX-NBB₁₄₀-2xFV-Venus-Puro) und wählen Sie mit 4 μg/mL Puromycin für 1 Woche, 2 Tage nach Transduktion.

2. live-Cell-Mikroskopie-Bildgebung des MLKL-vermittelten Necroptosis

1. Platte, Mlkl^{- / -} MEFs Ausdruck BNB₁₄₀-2xFV-Venus bei einer Dichte von 50.000 Zellen pro Bohrloch (1 mL/na) in 24 auch Platten, und über Nacht inkubieren (Abb. 2A). Verwenden Sie Leben-Zelle Färbung für automatisierte Zellzählung (siehe Tabelle der Materialien).
2. Zellen für 12 h mit Dox zu behandeln (0,5 μg/mL) induzieren die Expression von BNB₁₄₀-2xFV-Venus.
3. Induzieren Necroptosis mit 25 nM FKBP Dimerizer (Dim) zusätzlich 25 nM Membran undurchlässig grün fluoreszierenden Farbstoff (siehe Tabelle der Materialien) in standard DMEM (siehe 1.2). Zellen Necroptosis akkumulieren den Farbstoff wie ihre Plasmamembran Integrität von BNB₁₄₀kompromittiert-vermittelte riss. Führen Sie Tests in dreifacher Ausfertigung oder vervierfacht.
4. Zur Überwachung der Necroptosis mit einfarbigen oder Dual bildgebende Systeme (siehe Tabelle der Materialien), legen Sie die Schiffe in die jeweiligen Belichtungseinheit, untergebracht in einem Säugetier Gewebekultur-Inkubator.
5. Öffnen Sie die Software (siehe Tabelle der Materialien) und wählen Sie die Registerkarte Zeitplan kommenden scannt unter der Aufgabenliste.
   Hinweis: dieses Protokoll ist für die Bildgebung mit einfarbigen Systemen, aber eine ähnliche Software ist für zwei-Farben-Systeme verfügbar.
6. Wählen Sie das "Fach, Schiff, Scantypen", und "Scan-Pattern" in der Registerkarte "Physische Layout" und "Schnell Fluoreszenz" in der Registerkarte "Eigenschaften".
7. Fügen Sie die "Scan Zeit" durch Klicken auf das Fenster "Zeitachse" und die Gesamtzahl von Zeitpunkten und Frequenz des Erwerbs (in der Regel 1 Übernahme jeweils 0,5 h bis 1 h 6 h bis 12 h lang alle 5 min für schnelle Kinetik Necroptosis) und wählen Sie "App zunächst Bildaufnahme Ly"(roter Knopf).
8. Necroptosis mit der Bildanalyse-Software zu quantifizieren (siehe Tabelle der Materialien) durch Auswahl aus den "Aufgabenbereich", "Counting neue Analyse von Objekten mit festen Segmentierung Schwellenwert über der Hintergrund-Ebene", die ermittelt werden, indem Sie den Cursor der Mauszeiger über Hintergrund Regionen in mehreren Bildern in der Analyse verwendet.
9. Prüfen Sie fluoreszierende Objekte durch Auswahl mit aktuellen Bild Vorschau und verfeinern Sie die Schwellenwerte nach Bedarf.
10. Integrieren Sie grüne Fluoreszenz zählt durch Öffnen der Registerkarte "Neue Analyse starten" zu, wählen Sie den "Zeitbereich", die Brunnen analysiert werden, geben den Auftragsnamen"Analyse", und drücken "OK".
11. Zugang analysiert Daten aus der Registerkarte "Analyse Aufträge" durch einen Doppelklick auf den Namen des jeweiligen Auftrags und aus dem Diagramm/Export-Fenster für die weitere Analyse in externen Grafik-Software exportieren (siehe Tabelle der Materialien).
12. Quantitate Daten als grüne Fluoreszenz positiv (+ Ve) zählt/mm² oder normalisieren die Grafen von Confluence und drücken die Daten als grüne Fluoreszenz + Ve zählt/Zusammenfluss.
13. Optional am experimentellen Endpunkt Beflecken Zellen mit 100 nM die Membran-permeationsfähigen grün fluoreszierenden Farbstoff (siehe Tabelle der Materialien). Daten auf % Necroptotic Zellen als das Verhältnis der grünen Fluoreszenz/grüne Fluoreszenz am Endpunkt zu normalisieren.

3. live-Zelle konfokalen Mikroskopie Bildgebung der Plasmamembran Rekrutierung und Permeabilisierung von MLKL

1. Platte, Mlkl^{- / -} MEFs Ausdruck BNB₁₄₀-2xFV-Venus bei einer Dichte von 20.000 Zellen pro Bohrloch (0,5 mL/na) in einem Glas unten 4-Well Mikroskopie Kammer vorbehandelt mit 50 µg/mL Fibronektin in PBS bei 37 ° C für 30 min und ~ 12 h ( inkubieren Abbildung 2B).
2. Behandlung der Zellen mit Dox (0,5 μg/mL) für ~ 12 h induzieren die Expression von BNB₁₄₀-2xFV-Venus.
3. Induzieren Necroptosis durch Inkubation mit frischem Medium (1 mL/na) mit 25 nM Dim induzieren BNB₁₄₀-2xFV-Venus-Aktivierung und Translokation in der Plasmamembran.
4. Legen Sie die Kammer auf eine drehenden Scheibe Laserscanning confocal Mikroskop gebaut auf einem umgekehrten Stand ausgestattet mit Umweltkontrolle und ein 63 1,4 NA Ziel und imaging-Erwerb mit Software der Wahl beginnen (siehe Tabelle der Materialien).
5. Initialisieren der Software, wählen Sie "Focus" Symbol und YFP Filterkonfiguration (Erregung Wellenlänge 515 nm).
6. Suchen Sie das Sichtfeld und die Brennebene und engagieren Sie das Wartung-System mithilfe der Registerkarte "Definitive Fokus" zu.
7. Um Übernahme zu beginnen, die Registerkarte "Capture" gefolgt von Zuordnung der Filterkonfiguration, geeignete EMCCD Kamera Belichtung Zeit und Intensivierung Verstärkung und Zeitraffer Aufnahmeparameter einschließlich Intervall und Länge des Erwerbs.
8. Zelluläre Umverteilung der fluoreszierenden BNB₁₄₀zu überwachen-2xFV-Venus-Protein während der Necroptosis durch den Erwerb von Bilder alle 10 s mit einer EMCCD Kamera mit einem 515 nm Laser (Film 1).
   Hinweis: Immunofluoreszenz geht mit fluoreszierenden Proteins Bildgebung. Venus ist eines der widerstandsfähiger fluoreszierende Proteine Immunofluoreszenz²⁹. Fluoreszierende Proteine, anfälliger für Immunofluoreszenz sind, verwendet, Bild alle 30 s oder länger, um die Wiederherstellung des Signals zwischen bildgebenden Zeitpunkten ermöglichen.
9. Plasmamembran Verband der BNB₁₄₀überwachen-2xFV-Venus während Necroptosis, Bild alle 10 s die Probe vorbereitet in 3.3 durch Totalreflexion Fluoreszenz (TIRF) Mikroskopie unter Verwendung eines Mikroskops, ausgestattet mit einer automatisierten TIRF-Slider und eine 100 x 1,4 NA Ziel und einer EMCCD Kamera (Film 2). Führen Sie die Schritte 3,5 – 3,7, aber passen Sie den Winkel der TIRF innerhalb der TIRF Fokus Registerkarte nach Probe und unten Glasstärke der Mikroskopie Kammer.
   Hinweis: Plasmamembran Markierungen wie LCK-C-RFP können als Steuerelemente für die Plasmamembran Lokalisierung in TIRF Analyse verwendet werden.
10. Durchführen Sie Bildverarbeitung zur Verbesserung der Qualität durch Faltung mit der negativen normalisierte zweite Ableitung einer Gaußschen Funktion (Marr Algorithmus).

(4) Elektronenmikroskopie

1. Platte, Mlkl^{- / -} MEFs Ausdruck BNB₁₄₀-2xFV-Venus bei einer Dichte von 5 Millionen Zellen in einem Plasma beschichtet 150 mm Zelle Kulturschale und inkubieren Sie für 12 h (Abbildung 3).
2. Behandlung der Zellen mit Doxycyclin (0,5 μg/mL) induzieren die Expression von NB_1-140-2xFV-Venus für 12 h.
3. Induzieren BNB₁₄₀-2xFV-Venus-Aktivierung und Translokation in der Plasmamembran mit 25 nM Homodimerizer für 5 Minuten. Diesmal wird aus der Kinetik der Necroptosis beobachtet in live Cell Imaging gegründet.
4. Entfernen Sie das Medium und beheben Zellen mit 10 mL 2,5 % Glutaraldehyd, 2 % Paraformaldehyd in 0,1 M Natrium Cacodylate Puffer pH 7,4 (Cacodylate Puffer) bei 37 ° c vorgewärmt zu
5. Sammeln der Probenmaterials durch Schaben und Spinnen die Proben 10 min bei 500 X g. Verwerfen Sie den überstand.
6. Postfix die Probe für 1,5 h in reduzierten 2 % Osmium ausgefällt mit 1,5 % Kaliumferrocyanid in 0,1 M Natrium Cacodylate Puffer. Osmium ausgefällt ist eine Färbung Agent in TEM Kontrast am meisten benutzt. Wir benutzten TEM als vorläufige Analyse vor SEM der Zelle Necroptosis unterziehen.
7. Spülen Sie die Probe 5 Mal in Reinstwasser für 5 min bei 500 X g, gefolgt von Spülungen im Puffer (siehe 4.6), Wasser und Ethanol auf eine automatische Prozessor. Verwerfen Sie den überstand.
8. Für die SEM Fleck vorher festen Proben mit 1 % Uranyl Acetat und Blei Aspartat-Schwermetall Fleck³¹.
9. Die Proben durch eine abgestufte Reihe von Alkohol und Propylen oxid Lösungen zu entwässern.
10. Einbetten der Probenmaterials in harten Harz³² , einen Harz-Block zu erhalten.
11. Schneiden Sie dicke Schichten von 0,5 μm zu bestimmen, den richtigen Bereich der Analyse.
12. Bestreichen Sie die Proben mit einem hauchdünnen Film von elektrisch leitfähigen Metall (Iridium).
13. Image und analysieren die Proben (Abbildung 3). Für die Quantifizierung, ein Low-Vergrößerung Bild der Block Harzoberfläche mit exponierten Zellen wird gescannt, bei 5 keV mit einem Elektronenmikroskop.
14. Zellen in einzelne Bilder von SEM zu visualisieren oder imaging-Software genutzt werden kann, um mehrere Felder-of-View in einem zusammenhängenden Bild³⁰beitreten. Etwa 100 Zellen verwendet werden, um den Bruch der Zellen in der Necroptosis auf diese Weise durch die Erzeugung einer hochauflösenden Montage im Software der Wahl zu bewerten (siehe Tabelle der Materialien).
    Hinweis: Scoring nekrotische Morphologie von SEM normale Zelle Funktionen mit dem Fortschreiten der Pre-nekrotische oder nekrotischen Phänotypen vergleicht. Zu diesen Features gehören Plasmamembran Änderungen einschließlich Mikrovilli verschwinden, Abflachung, Brüche in den Zellen von 10 nm bis 1 µm Größe oder Verlust der Organelle Struktur über mindestens 30 – 40 % der cytosolischen Zellbereich.

(5) Lipid-Bindung des MLKL durch Kernresonanzspektroskopie (NMR)

1. ¹⁵N beschriftet BNB_1-156 von standard Protein-Expression und Reinigung wie oben beschrieben²⁴vorzubereiten.
2. Auflösen von 500 µg 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoinositol Ammoniumsalz (18:0 PI) und 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-myo-inositol) Ammoniumsalz (18:1 PI) in 500 µL des eiskalten Kchl₃ jeweils für Endkonzentrationen von 1 mg/mL.
3. 1 mg/mL 18:0 und 18:1 PI im Wasserbad Beschallung für 1 min bei Raumtemperatur beschallen oder bis zu 5 min in ein Eis-Wasser-Gemisch.
4. Aliquoten 1 mg/mL 18:0 und 18:1 PI in sauberes glasvials für individuelle NMR Titration Serie (Abbildung 4). Transfer-Lipide in organischen Lösungsmitteln mit luftdichten Glas Spritzen.
   1. Aliquoten 132 µL 1 mg/mL 18:1 PI (molare Masse = 880.137 g/Mol) in Kchl₃ für eine endgültige Wiederfreisetzung Volumen von 1.200 µL bei 125 µM Konzentration.
      Hinweis: Für 5 mm NMR Röhrchen, bereiten Sie serielle Verdünnung Mengen von > 1.000 µL und endgültige NMR probieren Sie Mengen von > 500 µL. Vorbereitung 3 mm NMR Röhrchen, serielle Verdünnung Datenmengen > 300 µL und endgültige NMR probieren Sie Mengen von > 150 µL.
5. Aliquoten 1 mg/mL porcinen Gehirn L-α-Phosphatidylinositol-4,5-Bisphosphate Ammoniumsalz in 20:9:1 Kchl3/MeOH/H₂O (Gehirn PI (4,5) P₂) in saubere Glasflaschen.
6. Stellen Sie Fläschchen unter einem gasförmigen Strom von Argon (Ar) oder Stickstoff (N₂) mit mäßiger Strömung organisches Lösungsmittel verdunsten ohne zu spritzen gegen die Glaswände Fläschchen. 5 bis 30 min ist in der Regel ausreichend für Volumina von 10 bis 200 µL organischen Lösungsmittel.
7. Ordnen Sie Glas Ampulle(n) auf Grund einer Büchner oder große Pinzette Isolierflasche mit Gummistopfen verschließen und befestigen Sie Kunststoffschlauch mit einer Vakuumleitung verbunden. Evakuieren Sie Kolben unter milden Vakuum über Nacht, verbleibende organische Stoffe zu entfernen.
8. Lipid-Film-Aliquote mit Inertgas überlagert, mit einem luftdichten Deckel verschließen und bei-20 ° C für den Einsatz innerhalb eines Monats oder-80 ° C für die längerfristige Lagerung lagern.
9. Bereiten Sie NMR Probe Puffer ohne Waschmittel (-Det) mit 20 mM Na_XH_yPO₄ pH 6,8, 10 % D₂O und Waschmittel (+ Det) mit 20 mM Na_XH_yPO₄ pH 6,8, 10 % D₂O, 0,34 mM n-Dodecyl-β-D-Maltopyranoside (DDM).
10. Hinzufügen + Det Puffer Glasfläschchen mit Lipid-Film auf gewünschte Konzentration zu erreichen und im Wasserbad für bis zu 30 min, abwechselnd Beschallung für 10 min beschallen gefolgt durch Sichtkontrolle.
    Hinweis: Beschallung kann Probe warm. Raumtemperatur für 15 min vor der endgültigen Protein Probe Rekonstitution abkühlen lassen.
11. Führen Sie serielle Verdünnung der Lipid-Reinigungsmittel-Mizellen in + Det Puffer mit Beschallung von 1:1 Mischungen für die gewünschte Konzentration-Serie. Ab 125 µM Lipidkonzentration, werden drei Wiederholungen 62,5 µM, 31,3 µM und 15,6 µM Lipid in 0,34 mM DDM ergeben.
12. Bereiten Sie Kontrolle und NMR-Proben von Protein und Zusatzstoffe in - Det zu verweisen und + Det Puffer, beziehungsweise. Protein und Additive zu jeder Verdünnung der Lipid in + Det Puffer hinzufügen.
    Hinweis: Für ¹⁵N BNB₁₅₆, Protein ist hinzugefügt, um eine Endkonzentration von 40 µM und ergänzt mit 2 mM deuterierter Dithiothreitol, Cys Rückstände reduziert zu halten.
13. Übertragen Sie das entsprechende Volumen der Proben auf 5 mm oder 3 mm NMR Röhrchen (siehe Hinweis im Schritt 5.4).
14. Manuell laden Sie Proben in NMR-Gerät oder in ein Automatisierungs-Plattform wie der SampleCase Loader vereinbaren.
15. Zusammengesetzte NMR-Spektren mit standard Puls-Programme für ¹H Proton Spektren als Qualitätskontrolle gefolgt von 2D ¹H -¹⁵N Korrelation Spektren entweder als transversale Entspannung optimiert Spektroskopie (TROSY) zu erwerben oder Heteronuclear mehrere Quantum Kohärenz (SOFAST-HMQC)³³.
    Hinweis: Verwendung von 3 mm NMR Röhrchen erfordert 64 Scans für 1 H -¹⁵N TROSY (~ 3 h) oder ¹H -¹⁵N SOFAST-HMQC (~ 90 min). Scan-Nummern sind für 5 mm NMR Röhrchen halbiert.
16. Verarbeitete 2D NMR-Spektren können eine CARA Repository³⁴ zur Analyse oder anderer Software der Wahl für den Benutzer hinzugefügt werden.
17. Analysieren Sie Software, indem Sie kommentieren 2D NMR-Resonanzen für drei gut dispergierte und gelöst Spitzen für jedes Protein-Staat. Notieren Sie die Peak-Amplituden für jede der sechs Gipfel für jeden Puffer Zustand mit BNB₁₅₆ (Abb. 5A).
    1. CARA verwenden, um eine Batch-Integration-Liste erstellen (Klicken Sie auf Main Menu Rubrik "Spektrum | Setup-Batch-Liste"...) Alle Spektren gesammelt und zu analysieren, mit einer einzigen Spitze Aufgabendatei (Klicken Sie auf Main Menu Überschrift "Gipfel | Importieren Sie Peaklist"... ...und wählen Sie eine benutzerdefinierte .peaks-Datei mit 6 total Gipfeln, 3 für jedes Protein Staates innerhalb definiert).
    2. Feinabstimmung der Einstellungen vornehmen ("Integrator | Tune Peak Modell"...) der X-Breite 0,06 ppm und Y-Breite 0,30 ppm (Klicken Sie auf Main Menu Überschrift "Integrator | Tune Peak Modell"...) vor der Aufnahme der endgültigen Ausgabe in zwei Menüauswahl (1.) Klicken Sie auf Main Menu Überschrift "Integrator | Integrieren Sie Batch-Liste") (2. Klicken Sie auf Main Menu Überschrift "Gipfel | Integration-Tabelle exportieren") (Abb. 5B).
       Hinweis: Die Rückgrat Amid Resonanzen für Rückstände M21, V53 und L105 wurden für den BNB₁₅₆ geschlossen-Brace Staat zugewiesen. Der Open-Brace-Staat war Rückgrat Amid Resonanzen von Rückständen G130 und A141 und Epsilon Proton Sidechain-Resonanz der W133 mit 3D NMR-Experimente-²⁴zugeordnet.
18. Normalisieren Sie Proben für den direkten Vergleich von verschiedenen Magneten oder Probe Bedingungen durch Mittelung der drei Open-Brace Amplituden der Referenzproben und berechnen einen Normalisierungsfaktor im Zusammenhang mit den beiden Referenzen. Berechnen Sie die skalierten Amplituden für BNB₁₅₆ Resonanzen mit den Normalisierungsfaktor und Einstellung negative Amplituden auf NULL (Tabelle 2).
    Beispiele: (1) Vergleich von Proben aus verschiedenen Magneten: Magnet A, BNB₁₅₆DDM und Magnet B, BNB₁₅₆+ DDM. (2) Waschmittel Vergleich: 0,34 mM DDM und 1,7 mM DDM.
19. Berechnen Sie für jede Resonanz, dass die skalierte Bruchteil des geschlossen - oder Open-Klammer durch Division mit der Palette von Mindest-und maximale Amplitude der alle Spektren enthalten entsprechende Hinweise frei BNB₁₅₆ und vollständig offen-Brace BNB₁₅₆ in gesammelt Waschmittel.
20. Die normalisierte NMR-Amplituden als Funktion der Lipidkonzentration des Grundstückes und vergleichen den Bruchteil der öffnen-Brace BNB₁₅₆ unter verschiedenen Bedingungen (Abbildung. 5 C).
    Hinweis: Alternativ kann Analyse des Bruchs der geschlossen-Brace Konformation gegen Lipidkonzentration durchgeführt werden um Lipid Bindung an BNB₁₅₆zu vergleichen. Wir bevorzugen die frühere Analyse, weil es schneller und bessere Berichte auf den Bruch-durch Lipide engagiert.

Ergebnisse

Visualisierung von regulierten Necroptosis Ausführung in lebenden Zellen wurde möglich durch induzierbaren Ausdruck eines minimalen abgeschnittene MLKL Konstrukts, BNB₁₄₀-2xFV-Venus. Dieses Konstrukt behält die Fähigkeit, Plasmamembran Permeabilisierung induzieren und durch Dim-induzierte Oligomerisierung FKBP-Kassette (2xFV) aktiviert ist. Wir beobachten und Quantifizierung der Necroptosis durch live-Cell-Mikroskopie imaging, Überwachung kinetisch (alle 5 min) die Aufnahm...

Diskussion

Wir bieten Protokolle für Techniken, die wir zusammen als die vermeintliche Henker der Plasmamembran Bruch²⁴MLKL verwickelt. Neben der Entschlüsselung der regulatorischen Netzwerk, das MLKL-vermittelten Necroptosis regelt, können diese Techniken unabhängig verwendet werden, andere geeignete biologische Systeme zu charakterisieren. Praktisch gesehen, sind diese Techniken Medium zu niedrigen Durchsatz Discovery-Tools.

Wir haben routinemäßig verwendet live Cell Imagi...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cloning and cell line generation
pRetroX-TRE3G	Clontech	631188
Tet-On transactivator plasmid			Llambi et al., 2016
Mouse Embryonic Fibroblasts (MEFs) mlkl-/-			Dillon et al., 2014
Blasticidin S Hydrochloride	Thermo Fisher Scientific	BP2647100 CAS#3513-03-9
Cell death quantification and live-cell microscopy
Doxycycline	Clontech	631311 CAS# 24390-14-5
B/B Homodimerizer AP20187	Takara	635059 CAS# 195514-80-8
SYTOX Green	Thermo Fisher Scientific	S7020
Syto16	Thermo Fisher Scientific	S7578
NMR
15N Ammonium Chloride	Cambridge Isotope Laboratories	NLM-467-10 CAS# 12125-02-9
Deuterated DTT	Cambridge Isotope Laboratories	DLM-2622-1
Deuterium Oxide	Sigma Aldrich	617385-1 CAS# 7789-20-0
n-Dodecyl-β-D-Maltopyranoside	Anatrace	D310 CAS# 69227-93-6
L-α-phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate (Brain, Porcine) (ammonium salt)	Avanti Polar Lipids	840046X CAS# 383907-42-4
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoinositol (ammonium salt) (18:0 PI)	Avanti Polar Lipids	850143 CAS# 849412-67-5
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-myo-inositol) (ammonium salt) (18:1)	Avanti Polar Lipids	850149 CAS# 799268-53-4
Specialized Equipment
IncuCyte FLR or ZOOM	Essen BioScience, Inc.		Live-cell microscopy imaging
Helios NanoLab 660 DualBeam	Thermo Fisher Scientific		Electron microscope
Software
IncuCyte 2011A Rev2 v20111.3.4288 (FLR)	Essen BioScience, Inc.	http://www.essenbioscience.com	Imaging analysis
FEI MAPS	Thermo Fisher Scientific	https://www.fei.com/software/maps/	EM analysis
TopSpin v3.2	Bruker BioSpin	http://www.bruker.com	NMR data collection
CARA v1.9.1.7		http://cara.nmr.ch/	NMR data analysis
Slidebook	3i (Intelligent Imaging Innovations)	https://www.intelligent-imaging.com/slidebook	Confocal microscopy