JoVE Logo
Autori
Contattaci

Accedi

È necessario avere un abbonamento a JoVE per visualizzare questo. Accedi o inizia la tua prova gratuita.

In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Segnaliamo i metodi per la caratterizzazione della rottura della membrana plasmatica MLKL-mediata in necroptosis compreso formazione immagine convenzionale e confocale microscopia di cellule vive, microscopia elettronica, e associazione basata su NMR del lipido.

Abstract

Necroptosis è una via di morte programmata delle cellule innescata dall'attivazione del recettore interacting protein chinasi 3 (RIPK3), che fosforila e attiva la pseudochinasi dominio chinasi-come stirpe misto, MLKL, rottura o permeabilize la membrana plasmatica . Necroptosis è un percorso infiammatorio associato con patologie multiple, tra cui il cancro, le malattie infettive e cardiovascolari, ictus, neurodegenerazione e autoimmunità. Qui, descriviamo i protocolli che possono essere utilizzati per caratterizzare il MLKL come il boia di rottura della membrana del plasma in necroptosis. Visualizziamo il processo di necroptosis in cellule usando la formazione immagine della vivere-cella con microscopia di fluorescenza confocale e convenzionale e in cellule fissate mediante microscopia elettronica, che insieme hanno rivelato la ridistribuzione dei MLKL dal cytosol al plasma membrana prima di induzione di grandi fori nella membrana plasmatica. Vi presentiamo in vitro analisi di risonanza magnetica nucleare (NMR) utilizzando i lipidi per identificare putativi modulatori di necroptosis MLKL-mediata. Basato su questo metodo, abbiamo identificato quantitativa del lipido-associazione preferenze e fosfatidil-inositolo fosfato (PIPs) come leganti critici di MLKL che sono necessari per il targeting di membrana plasmatica e permeabilizzazione in necroptosis.

Introduzione

Identificazione dei componenti genetiche di necroptosis ha facilitato l'uso di modelli animali per testare l'implicazione di necroptosis in fisiologia e malattia1,2,3,4,5. Ko di RIPK3 o MLKL in topi aveva minima implicazione nell'omeostasi sviluppo e adulto, suggerendo che necroptosis non è essenziale per vita3,6. Inoltre, alcune specie non contengono geni o RIPK3 o MLKL, sostenere il ruolo non essenziali di necroptosis in animali7,8. D'altra parte, impegnativo modelli animali knockout con varie patologie indotte in laboratorio ha rivelato un importante ruolo di necroptosis nell'infiammazione, immunità innata e l'infezione virale9,10, 11 , 12.

Necroptosis può essere attivato in diversi modi di segnalazione attraverso sensori differenti immunità innata, tutti che provocano l'attivazione di RIPK31,13,14. RIPK3 attivo a sua volta fosforila e attiva MLKL3,4,5,6,7,8,9,10 ,11,12,13,14,15,16,17,18. Il più studiato e forse il modo più complesso, che portano all'attivazione di RIPK3 coinvolge morte recettore legatura, che si biforca sulla base della composizione a valle dei complessi segnalazione sia indurre apoptosi o necroptosis1. Necroptosis consegue quando segnalazione attraverso RIPK1 è favorita e si traduce in impegno di RIPK319,20. Questo risultato è facilmente favorito su inibizione farmacologica o delezione genetica della caspasi 8, un inibitore endogeno putativo di necroptosis che tiene a bada il necroptosis. RIPK1 lega a ed attiva RIPK3. Un altro modo per attivare necroptosis è attraverso recettori Toll-like TLR3/TLR4 segnalazione, che coinvolge e attiva il RIPK3 TIR-dominio-contenente adattatore-induzione dell'interferone-β (TRIF)21. Un altro modo per morire di necroptosis è di attivazione del sensore del DNA DAI, che direttamente si impegna e si attiva RIPK322.

MLKL è una proteina citosolica composta da un N-terminale dell'elica bundle (NB) e un dominio di pseudochinasi C-terminale (psKD) collegati da una parentesi graffa regolamentazione regione3. In cellule normali, MLKL si trova nel citosol dove si pensa di essere in un complesso inattivo con RIPK314. Attivazione di necroptosis innesca fosforilazione di RIPK3 di MLKL nel ciclo di attivazione della psKD e potenzialmente altri siti nel NB e parentesi graffa3,15,23. La fosforilazione induce un cambio conformazionale in MLKL che si traduce in dissociazione dal RIPK314. Capito male cambiamenti conformazionali rilasciare il tutore dal psKD24. L'ortesi, che contiene 2 eliche, media oligomerizzazione di MLKL in un trimero putativo attraverso il C-terminale dell'elica25. L'elica del N-terminale della ginocchiera inibisce il dominio NB, che è essenziale per la permeabilizzazione della membrana24,26. In isolamento, NB dominio è sufficiente per indurre la permeabilizzazione della membrana del plasma e necroptosis16,24,27. L'attività di pro-necroptotic NB è stato ricostituito in fibroblasti embrionali del mouse carenti in MLKL (mlkl- / - MEFs). NB è un dominio di legame del lipido che coinvolge preferenzialmente il difosfato di fosfatidilinositolo 4,5 del fosfolipide (PIP2). Abbiamo proposto un meccanismo graduale dell'attivazione di MLKL, in cui parentesi graffa oligomerizzazione facilita il reclutamento di MLKL alla membrana del plasma tramite interazioni deboli di NB con il gruppo di testa polare di2 PIP24. La membrana, il NB subisce regolamentato l'esposizione di un sito di associazione aggiuntive di alto-affinità per PIP2, che è mascherato dal tutore in MLKL inattivo. Nel complesso, le interazioni multiple di NB con PIP2 destabilizzano la membrana plasmatica che porta alla sua rottura, anche se il meccanismo molecolare di questi eventi non sono stati delucidati.

Qui illustriamo metodi specifici utilizzati per caratterizzare la funzione di MLKL come boia di necroptosis24. In particolare, ci concentriamo sul dominio più minimo del MLKL, NB e brace (NBB), che è regolata tramite inibizione di parentesi graffa e può essere attivato attraverso la dimerizzazione forzata per indurre la necroptosis e la rottura della membrana del plasma. Descriviamo il nostro sistema di espressione inducibile combinato con forzata dimerizzazione di FKBP-mediata indotta dai farmaci per l'imaging di cellule vive e la microscopia elettronica delle cellule che subiscono necroptosis. Inoltre, vi illustriamo la nostra analisi in vitro NMR delle interazioni della NBB con phosphatidylinositols (PIPs).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocollo

1. clonazione e cella linea generazione

  1. PCR amplificano la regione NBB, corrispondono ai residui dell'amminoacido 1-140 (NBB140), da cDNA umano MLKL per telaio standard basati su enzimi di limitazione clonazione con la proteina legante di oligomerizzazione dominio 2 x FK506 (2xFKBP o 2xFV) e Venus fluorescente proteine nella doxiciclina (Dox) - vettore retrovirale inducibile pRetroX-TRE3G per ottenere NBB140- 2xFV-Venus (tabella 1, figure 1A-B).
  2. Immortalare primario mlkl- / - o ripk3- / - mlkl- / - fibroblasti embrionali del mouse (MEFs) ottenuti dai rispettivi topi disponibili in laboratorio verde di trasfezione transiente con antigene SV40-grande esprimendo il plasmide. Selezionare cellule immortalate in ~ 1 – 2 settimane e mantenere in DMEM completati con 10% siero bovino fetale (FBS), 2 mM L-Glutammina, 100 U/mL di penicillina e streptomicina, piruvato di sodio di 1 mM e aminoacidi non essenziali a 37 ° C e 5% di CO2 in tessuto standard incubatori di cultura.
  3. Trasducono SV40-immortalato mlkl- / - MEFs con il transactivator di tetraciclina inversa controllata (rtTA)-contenente retrovirus espressa da un plasmide contenente il gene di resistenza Consciousness (nostro plasmide modificato) e trattare per 1 settimana con 5 μg/mL Consciousness per selezionare per le cellule che esprimono rtTA28.
  4. Trasducono i MEFs rtTA-esprimendo con il vettore retrovirale Dox-inducible contenente il chimerico MLKL (pRetroX-NBB140-2xFV-Venus-puro) e selezionare utilizzando 4 con puromicina μg/mL per una settimana, 2 giorni dopo la trasduzione.

2. vivere-cella microscopia Imaging di Necroptosis MLKL-mediata

  1. Piastra mlkl- / - MEFs esprimendo NBB140-2xFV-Venus ad una densità di 50.000 cellule per pozzetto (1 mL/pozzetto) in 24 piastre ed incubare durante la notte (Figura 2A). Utilizzare cellule vive che macchia per conta cellulare automatizzata (Vedi Tabella materiali).
  2. Curare le cellule per 12 h con Dox (0,5 μg/mL) per indurre l'espressione di NBB140-2xFV-Venus.
  3. Indurre il necroptosis con dimerizer di 25 nM FKBP (Dim) oltre 25 fluorescente verde membrana impermeabile di nM tingere (Vedi Tabella materiali) in DMEM standard (Vedi 1.2). Cellule che subiscono necroptosis si accumulano il colorante come l'integrità della membrana plasmatica è compromessa da NBB140-mediata di rottura. Effettuare saggi in triplice o quadruplice copia.
  4. Per monitorare necroptosis utilizzando sistemi di imaging single - o dual-color (Vedi Tabella materiali), posizionare i vasi nella rispettiva unità imaging ospitato in un'incubatrice di coltura di tessuti dei mammiferi.
  5. Aprire il software (Vedi Tabella materiali) e selezionare la scheda pianificazione prossime analizza sotto l'elenco delle attività.
    Nota: questo protocollo è per l'imaging utilizzando sistemi di colore unico, ma un software simile è disponibile per i sistemi dual-color.
  6. Nella scheda Proprietà, selezionare il cassetto", nave, tipi di scansione" e il "modello di scansione" nella scheda "Layout fisico" e "Fast fluorescenza".
  7. Aggiungere "Scan Time" cliccando sulla finestra "Temporale" e il numero totale di punti di tempo e frequenza di acquisizione (in genere 1 acquisizione ogni 0,5 h-1 h per 6 h alle 12h, o ogni 5 min per fast-cinetica necroptosis) e avviare l'acquisizione di immagini selezionando "App ly"(pulsante rosso).
  8. Quantificare la necroptosis utilizzando il software di analisi di immagine (Vedi Tabella materiali) selezionando "Riquadro attività", "Oggetto Counting nuova analisi con soglia di segmentazione fissa sopra il livello di sfondo", che può essere determinato facendo passare il cursore del mouse sulle regioni di sfondo in diverse immagini utilizzate nell'analisi.
  9. Esaminare oggetti fluorescenti selezionando anteprima utilizzando l'immagine corrente e perfezionare i livelli di soglia come necessario.
  10. Integrare i conteggi di fluorescenza verde aprendo la scheda "Launch New Analysis", scegliere il "intervallo di tempo", selezionare i pozzetti per essere analizzati, inserire il "nome di processo di analisi" e premere "OK".
  11. Accesso ha analizzato i dati dalla scheda "Analisi processi" facendo doppio clic sul nome del rispettivo lavoro ed esportazione dalla finestra grafico/esportazione per ulteriore analisi in esterno grafica software (Vedi Tabella materiali).
  12. Quantificare i dati come fluorescenza verde positivo (+ ve) conteggi/mm2 o normalizzare i conteggi di confluenza ed esprimere i dati come fluorescenza verde + ve conteggi/confluenza.
  13. Facoltativamente, l'endpoint sperimentale, macchia cellule con 100 nM della membrana-permeante verde fluorescente tingere (Vedi Tabella materiali). Normalizzare i dati alle celle necroptotic % come il rapporto della fluorescenza fluorescenza verde/verde all'endpoint.

3. vivere-cella microscopia confocale Imaging di reclutamento della membrana plasmatica e permeabilizzazione di MLKL

  1. Piastra mlkl- / - MEFs esprimendo NBB140-2xFV-Venus ad una densità di 20.000 cellule per pozzetto (0,5 mL/pozzetto) in un bicchiere basso camera 4 pozzetti microscopia pretrattato con 50 µ g/mL in PBS a 37 ° C per 30 min e incubare per ~ 12 h ( Figura 2B).
  2. Trattare le cellule con Dox (0,5 μg/mL) per ~ 12 h di indurre l'espressione di NBB140-2xFV-Venus.
  3. Indurre necroptosis incubando con medium fresco (1 mL/pozzetto) contenente 25 nM Dim per indurre NBB140-2xFV-attivazione di Venus e traslocazione alla membrana plasmatica.
  4. Posizionare la camera su un microscopio confocale, costruito su un supporto invertito dotata di controllo ambientale e un 63 di scansione laser di filatura disco 1,4 obiettivo NA e cominciare imaging acquisizione utilizzando software di scelta (Vedi Tabella materiali).
  5. Inizializzare il software, selezionare l'icona "Focus" e configurazione del filtro di YFP (eccitazione lunghezza d'onda 515 nm).
  6. Individuare il campo di vista e il piano focale e coinvolgere il sistema di manutenzione di messa a fuoco utilizzando la scheda "Precisa messa a fuoco".
  7. Per iniziare l'acquisizione, selezionare la scheda di "Acquisizione" seguita da assegnazione di configurazione del filtro, appropriato EMCCD fotocamera esposizione tempo e intensificazione guadagno e parametri di acquisizione Time-lapse compreso intervallo e la lunghezza di acquisizione.
  8. Monitorare cellulare ridistribuzione del fluorescente NBB140-2xFV-proteina Venus durante necroptosis con l'acquisizione di immagini ogni 10 s di una macchina fotografica EMCCD utilizzando un laser di 515 nm (1 film).
    Nota: Photobleaching è una preoccupazione con formazione immagine di proteina fluorescente. Venere è una delle proteine fluorescenti più resistente a photobleaching29. Se vengono utilizzate le proteine fluorescenti che sono più suscettibili di photobleaching, immagine ogni 30 s o più tempo per consentire il ripristino del segnale tra imaging tempo punti.
  9. Per monitorare la membrana plasmatica associazione di NBB140-2xFV-Venus durante necroptosis, immagine ogni 10 s il campione preparato in 3.3 di fluorescenza di riflessione interna totale microscopia (TIRF) utilizzando un microscopio equipaggiato con un cursore TIRF automatizzato e un 100 x 1.4 NA obiettivo e una telecamera EMCCD (2 film). Seguire i passaggi 3,5 – 3,7, ma regolare l'angolo TIRF all'interno della scheda di messa a fuoco TIRF secondo campione e basso spessore di vetro della camera di microscopia.
    Nota: i marcatori di membrana plasmatica come LCK-C-RFP possono essere utilizzati come controlli per la localizzazione di membrana plasmatica in analisi TIRF.
  10. Eseguire l'elaborazione delle immagini per migliorare la qualità di convoluzione con il negativo normalizzato secondo derivato di una funzione gaussiana (algoritmo di Marr).

4. microscopia elettronica

  1. Piastra mlkl- / - MEFs esprimendo NBB140-2xFV-Venus ad una densità di 5 milioni di cellule in un 150 mm rivestite con plasma cell piastra di coltura e incubare per 12 h (Figura 3).
  2. Trattare le cellule con doxiciclina (0,5 μg/mL) per indurre l'espressione di NB1-140-2xFV-Venus per 12 h.
  3. Indurre NBB140-2xFV-attivazione di Venus e traslocazione alla membrana plasmatica con 25 nM di homodimerizer per 5 min. Questa volta è stabilito dalla cinetica di necroptosis osservato nell'imaging di cellule vive.
  4. Rimuovere il supporto e fissare le cellule con 10 mL di soluzione 2,5% glutaraldeide, paraformaldeide di 2% in tampone 0,1 M a pH 7.4 sodio cacodilato (tampone cacodilato) preriscaldato a 37 ° C.
  5. Raccogliere il campione da raschiare e girare i campioni per 10 min a 500 x g. Scartare il surnatante.
  6. Postfix il campione per 1,5 h in tetrossido di osmio ridotto 2% con ferrocianuro di potassio 1,5% in tampone cacodilato di sodio 0.1 M. Tetrossido di osmio è un agente colorante ampiamente utilizzato in TEM per fornire contrasto. Abbiamo usato TEM come analisi preliminare prima del SEM di cella in fase di necroptosis.
  7. Sciacquare il campione 5 volte in acqua ultrapura per 5 minuti ciascuno a 500 x g, seguito da risciacqui nel buffer (vedere 4.6), acqua ed etanolo su un elaboratore automatico. Scartare il surnatante.
  8. Per SEM, macchia i campioni precedentemente fissati con 1% uranile acetato e piombo aspartato macchia metalli pesanti31.
  9. Disidratare i campioni attraverso una serie graduata di alcool e propilene ossido soluzioni.
  10. Incorporare il campione in resina dura32 per ottenere un blocco di resina.
  11. Tagliare sezioni spesse di 0,5 μm per determinare la corretta area di analisi.
  12. Rivestire i campioni con un film ultra-sottile di metallo elettricamente conduttori (Iridium).
  13. Immagine e analizzare i campioni (Figura 3). Per la quantificazione, viene analizzata una basso ingrandimento immagine della superficie del blocco di resina con cellule esposte a 5 keV utilizzando un microscopio elettronico.
  14. Visualizzare le cellule attraverso singole immagini catturate da SEM o software di imaging può essere utilizzata per unire più campi di vista in una sola immagine contigua30. Circa 100 cellule possono essere utilizzate per valutare la frazione di cellule in fase di necroptosis in questo modo generando un montaggio ad alta risoluzione nel software di scelta (Vedi Tabella materiali).
    Nota: Segnando necrotico morfologia di SEM Confronta caratteristiche della cellula normale con la progressione dei fenotipi pre-necrotici o necrotici. Queste funzionalità includono alterazioni della membrana del plasma tra cui scomparsa microvilli, appiattimento, rotture nelle cellule che vanno da 10 nm a 1 µm in dimensione, o perdita di struttura organello attraverso almeno 30 – 40% della superficie citosolica delle cellule.

5. lipid Binding di MLKL dalla spettroscopia di risonanza magnetica nucleare (NMR)

  1. Preparare 15N-labeled NBB1-156 di espressione della proteina standard e purificazione come descritto in precedenza24.
  2. Sciogliere 500 µ g di sale di ammonio 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoinositol (18:0 PI) e sale di ammonio di 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-myo-inositol) (18:1 PI) in 500 µ l di gelida CHCl3 ciascuno per concentrazioni finali di 1 mg/mL.
  3. Sottoporre ad ultrasuoni 1 mg/mL 18:0 e PI 18:1 in un bagno di acqua di sonicazione per 1 min a temperatura ambiente o fino a 5 min in una miscela di acqua e ghiaccio.
  4. Aliquotare 1 mg/mL 18:0 e PI 18:1 in fiale di vetro pulito per singole serie di titolazione di NMR (Figura 4). Trasferimento dei lipidi in solventi organici utilizzando siringhe in vetro ermetico.
    1. Aliquotare 132 µ l di 1 mg/mL 18:1 PI (massa molare = 880.137 g/mol) in CHCl3 per un volume finale di risospensione di 1.200 µ l a concentrazione di 125 µM.
      Nota: Per tubi 5mm NMR, preparare volumi di diluizione seriale di > 1.000 µ l e NMR finale esempio volumi di > 500 µ l. Per tubi da 3 mm NMR, preparare volumi di diluizione seriale di > 300 µ l e NMR finale esempio volumi di > 150 µ l.
  5. Aliquotare 1 mg/mL porcine cervello L-α-fosfatidilinositolo-4,5-bisfosfato sale di ammonio in 20:9:1 CHCl3/MeOH/H2O (cervello PI (4,5) P2) in fiale di vetro pulito.
  6. Posizionare fiale sotto un flusso gassoso di argon (Ar) o di azoto (N2) con flusso moderato per far evaporare il solvente organico senza schizzi contro le pareti del flaconcino di vetro. Cinque a trenta min è in genere sufficiente per volumi di solvente organico di 10-200 µ l.
  7. Organizzare o i flaconcini di vetro in fondo di un Büchner o beuta da vuoto con grande pinzette, sigillare con un tappo di gomma e collegare il tubo di plastica collegato a una linea di vuoto. Evacuare il pallone sotto vuoto mite durante la notte per rimuovere sostanze organiche residue.
  8. Sovrapporre le aliquote di pellicola lipidica con gas inerte, sigillare con un coperchio a chiusura ermetica e conservare a-20 ° C per l'uso entro un mese o a-80 ° C per la conservazione a lungo termine.
  9. Preparare il buffer del campione NMR senza detersivo (-Det) contenente 20 mMxH NayPO4 a pH 6.8, 10% D2O e con detergente (+ Det) contenente 20 mMxH NayPO4 a pH 6.8, 10% D2O, 0,34 mM n-dodecil-β-D-maltopyranoside (DDM).
  10. Aggiungere + Det buffer per flaconcino di vetro con film lipidico per ottenere la concentrazione desiderata e Sonicare a bagnomaria per fino a 30 min, alternati sonicazione per 10 min seguita da ispezione visiva.
    Nota: Sonicazione può riscaldare il campione. Lasciarli raffreddare a temperatura ambiente per 15 min prima della ricostituzione del campione finale di proteine.
  11. Effettuare diluizioni seriali di micelle lipidiche-detergente in + Det buffer mediante sonicazione di miscele 1:1 per la serie di concentrazione desiderata. A partire da concentrazione di lipidi 125 µM, tre ripetizioni produrrà 62,5 µM, 31,3 µM e dei lipidi in 0,34 mM DDM 15,6-µM.
  12. Controllo di preparare e fare riferimento a campioni di NMR di proteine e additivi in - Det e + buffer Det, rispettivamente. Aggiungi proteine e additivi per ogni diluizione del lipido in + buffer di Det.
    Nota: Per 15NBB N156, proteina è aggiunto ad una concentrazione finale di 40 µM e completata con 2mm deuterated dithiothreitol per mantenere residui di Cys ridotti.
  13. Trasferire il volume appropriato di campioni a 5 mm o 3 mm tubi NMR (vedere nota punto 5.4).
  14. Caricare i campioni in strumento NMR o organizzare in una piattaforma di automazione come il caricatore di SampleCase manualmente.
  15. Acquisire spettri NMR compositi utilizzando programmi di impulsi standard per spettri di 1H protone come controllo di qualità, seguita da 2D 1H -15N spettri di correlazione sia come spettroscopia di rilassamento trasversale ottimizzato (TROSY) o eteronucleari multiple quantum coerenza (SOFAST-HMQC)33.
    Nota: L'utilizzo di tubi da 3 mm NMR richiede 64 scansioni per 1 H -15TROSY N (~ 3 h) o 1H -15N SOFAST-HMQC (~ 90 min). Scansione di numeri sono dimezzati per i tubi NMR di 5 mm.
  16. Elaborati 2D spettri RMN possono essere aggiunto a una CARA repository34 per analisi o altri software di scelta per l'utente.
  17. Analisi software annotando 2D risonanze NMR per tre cime ben dispersi e risolti per ciascuno stato di proteina. Registrare le ampiezze di picco per ognuno dei sei picchi per ogni condizione di buffer contenente NBB156 (Figura 5A).
    1. Utilizzare CARA per preparare un elenco di batch-integrazione (intestazione fare clic sul Menu principale "spettro | Impostazione elenco Batch"...) di tutti gli spettri raccolti e analizzare utilizzando un file di assegnazione singolo picco (intestazione fare clic sul Menu principale "picchi | Importare Peaklist"... e scegliere un file definito dall'utente .peaks con 6 punte totale, 3 per ogni stato di proteina, definita all'interno).
    2. Regolare le impostazioni ("Integrator | Sintonia modello Peak"...) di larghezza X 0,06 ppm e Y-larghezza 0,30 ppm (intestazione fare clic sul Menu principale "Integrator | Sintonia modello Peak"...) prima di registrare l'output finale in due selezioni di menu (1. Fare clic sull'intestazione di Menu principale "Integrator | Integrare l'elenco Batch") (2. Fare clic sull'intestazione di Menu principale "picchi | Esporta tabella di integrazione") (Figura 5B).
      Nota: Le risonanze di ammide di spina dorsale per residui M21, V53 e L105 sono state assegnate per lo stato di chiuso-brace156 NBB. Lo stato di parentesi graffa di apertura è stato assegnato risonanze di ammide di spina dorsale dei residui G130 e A141 e la risonanza di lato-catena protone epsilon di W133 utilizzando 3D di esperimenti NMR24.
  18. Normalizzare i campioni per confronto diretto da diversi magneti o condizioni campione in media le tre ampiezze di parentesi graffa di apertura dei campioni di riferimento e calcolando un fattore di normalizzazione relative i due riferimenti. Calcolare le ampiezze in scala per risonanze156 NBB utilizzando il fattore di normalizzazione e ampiezze negativo impostazione a zero (tabella 2).
    Esempi: 1) confrontando campioni da diversi magneti: magnete una e magnete B, DDM, NBB156+ DDM, NBB156. 2) detergente confronto: 0,34 mM DDM e 1,7 mM DDM.
  19. Calcolare per ogni risonanza la frazione in scala della chiuso-aperto-gancio o dividendo con l'intervallo di ampiezza minima al massimo di tutti gli spettri raccolti contenenti riferimenti appropriati di libero NBB156 e completamente open-brace NBB156 a detergente.
  20. Tracciare le ampiezze di NMR normalizzate in funzione della concentrazione dei lipidi e confrontare la frazione di Apri-brace NBB156 in condizioni diverse (fig. 5C).
    Nota: In alternativa, analisi della frazione di conformazione di parentesi graffa chiusa contro la concentrazione dei lipidi possono essere eseguita per confrontare associazione del lipido a NBB156. Noi preferiamo l'analisi precedente perché è più veloce e migliore rapporti sulla frazione completamente-impegnati dai lipidi.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Risultati

Visualizzare l'esecuzione di necroptosis regolamentati in cellule vive è stato possibile attraverso l'espressione inducibile di un costrutto MLKL troncato minimal, NBB140-2xFV-Venus. Questo costrutto mantiene la capacità di indurre la permeabilizzazione della membrana del plasma e viene attivato tramite oligomerizzazione Dim-indotta della cassetta FKBP (2xFV). Osserviamo e quantificare necroptosis da microscopia di cellule vive di imaging, monitoraggio cineticamente (ogni 5 m...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussione

Forniamo i protocolli per le tecniche che abbiamo combinato implicati MLKL come il presunto boia di membrana plasmatica rottura24. Oltre a decifrare la rete di regolamentazione che regola necroptosis MLKL-mediata, queste tecniche possono essere utilizzate in modo indipendente per caratterizzare altri sistemi biologici adatti. In pratica, queste tecniche sono strumenti di rilevamento medio-basso rendimento.

Abbiamo usato ordinariamente imaging di cellule vive di NBB...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Divulgazioni

Nessuno.

Riconoscimenti

Nessuno.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
Cloning and cell line generation
pRetroX-TRE3GClontech631188
Tet-On transactivator plasmidLlambi et al., 2016
Mouse Embryonic Fibroblasts (MEFs) mlkl-/-Dillon et al., 2014
Blasticidin S HydrochlorideThermo Fisher ScientificBP2647100 CAS#3513-03-9
Cell death quantification and live-cell microscopy
DoxycyclineClontech631311 CAS# 24390-14-5
B/B Homodimerizer AP20187Takara635059 CAS# 195514-80-8
SYTOX GreenThermo Fisher ScientificS7020
Syto16Thermo Fisher ScientificS7578
NMR
15 N Ammonium ChlorideCambridge Isotope LaboratoriesNLM-467-10 CAS# 12125-02-9
Deuterated DTTCambridge Isotope LaboratoriesDLM-2622-1
Deuterium OxideSigma Aldrich617385-1 CAS# 7789-20-0
n-Dodecyl-β-D-MaltopyranosideAnatraceD310 CAS# 69227-93-6
L-α-phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate (Brain, Porcine) (ammonium salt)Avanti Polar Lipids840046X CAS# 383907-42-4
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoinositol (ammonium salt) (18:0 PI)Avanti Polar Lipids850143 CAS# 849412-67-5
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-myo-inositol) (ammonium salt) (18:1)Avanti Polar Lipids850149 CAS# 799268-53-4
Specialized Equipment
IncuCyte FLR or ZOOMEssen BioScience, Inc.Live-cell microscopy imaging
Helios NanoLab 660 DualBeam Thermo Fisher ScientificElectron microscope
Software
IncuCyte 2011A Rev2 v20111.3.4288 (FLR)Essen BioScience, Inc.http://www.essenbioscience.comImaging analysis
FEI MAPSThermo Fisher Scientifichttps://www.fei.com/software/maps/EM analysis
TopSpin v3.2Bruker BioSpinhttp://www.bruker.comNMR data collection
CARA v1.9.1.7http://cara.nmr.ch/ NMR data analysis
Slidebook3i (Intelligent Imaging Innovations)https://www.intelligent-imaging.com/slidebookConfocal microscopy

Riferimenti

  1. Weinlich, R., Oberst, A., Beere, H. M., Green, D. R. Necroptosis in development, inflammation and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (2), 127-136 (2017).
  2. Kaiser, W. J., et al. RIP3 mediates the embryonic lethality of caspase-8-deficient mice. Nature. 471 (7338), 368-372 (2011).
  3. Murphy, J. M., et al. The pseudokinase MLKL mediates necroptosis via a molecular switch mechanism. Immunity. 39 (3), 443-453 (2013).
  4. Oberst, A., et al. Catalytic activity of the caspase-8-FLIP(L) complex inhibits RIPK3-dependent necrosis. Nature. 471 (7338), 363-367 (2011).
  5. Zhang, H., et al. Functional complementation between FADD and RIP1 in embryos and lymphocytes. Nature. 471 (7338), 373-376 (2011).
  6. He, S., et al. Receptor interacting protein kinase-3 determines cellular necrotic response to TNF-alpha. Cell. 137 (6), 1100-1111 (2009).
  7. Dondelinger, Y., Hulpiau, P., Saeys, Y., Bertrand, M. J. M., Vandenabeele, P. An evolutionary perspective on the necroptotic pathway. Trends in Cell Biology. 26 (10), 721-732 (2016).
  8. Newton, K., Manning, G. Necroptosis and Inflammation. Annual Review of Biochemistry. 85, 743-763 (2016).
  9. Kaiser, W. J., Upton, J. W., Mocarski, E. S. Viral modulation of programmed necrosis. Current Opinion in Virology. 3 (3), 296-306 (2013).
  10. Newton, K., et al. RIPK3 deficiency or catalytically inactive RIPK1 provides greater benefit than MLKL deficiency in mouse models of inflammation and tissue injury. Cell Death & Differentiation. 23 (9), 1565-1576 (2016).
  11. Kearney, C. J., Martin, S. J. An Inflammatory Perspective on Necroptosis. Molecular Cell. 65 (6), 965-973 (2017).
  12. Pasparakis, M., Vandenabeele, P. Necroptosis and its role in inflammation. Nature. 517 (7534), 311-320 (2015).
  13. Sun, L., Wang, X. A new kind of cell suicide: mechanisms and functions of programmed necrosis. Trends in Biochemical Sciences. 39 (12), 587-593 (2014).
  14. Grootjans, S., Vanden Berghe, T., Vandenabeele, P. Initiation and execution mechanisms of necroptosis: an overview. Cell Death & Differentiation. 24 (7), 1184-1195 (2017).
  15. Sun, L., et al. Mixed lineage kinase domain-like protein mediates necrosis signaling downstream of RIP3 kinase. Cell. 148 (1-2), 213-227 (2012).
  16. Wang, H., et al. Mixed lineage kinase domain-like protein MLKL causes necrotic membrane disruption upon phosphorylation by RIP3. Molecular Cell. 54 (1), 133-146 (2014).
  17. Cai, Z., et al. Plasma membrane translocation of trimerized MLKL protein is required for TNF-induced necroptosis. Nature Cell Biology. 16 (1), 55-65 (2014).
  18. Chen, X., et al. Translocation of mixed lineage kinase domain-like protein to plasma membrane leads to necrotic cell death. Cell Research. 24 (1), 105-121 (2014).
  19. Dillon, C. P., et al. RIPK1 blocks early postnatal lethality mediated by caspase-8 and RIPK3. Cell. 157 (5), 1189-1202 (2014).
  20. Rickard, J. A., et al. RIPK1 regulates RIPK3-MLKL-driven systemic inflammation and emergency hematopoiesis. Cell. 157 (5), 1175-1188 (2014).
  21. Kaiser, W. J., et al. Toll-like receptor 3-mediated necrosis via TRIF, RIP3, and MLKL. Journal of Biological Chemistry. 288 (43), 31268-31279 (2013).
  22. Upton, J. W., Kaiser, W. J. DAI Another Way: Necroptotic Control of Viral Infection. Cell Host & Microbe. 21 (3), 290-293 (2017).
  23. Tanzer, M. C., et al. Necroptosis signalling is tuned by phosphorylation of MLKL residues outside the pseudokinase domain activation loop. Biochemical Journal. 471 (2), 255-265 (2015).
  24. Quarato, G., et al. Sequential Engagement of Distinct MLKL Phosphatidylinositol-Binding Sites Executes Necroptosis. Molecular Cell. 61 (4), 589-601 (2016).
  25. Davies, K. A., et al. The brace helices of MLKL mediate interdomain communication and oligomerisation to regulate cell death by necroptosis. Cell Death & Differentiation. , (2018).
  26. Su, L., et al. A plug release mechanism for membrane permeation by MLKL. Structure. 22 (10), 1489-1500 (2014).
  27. Dondelinger, Y., et al. MLKL compromises plasma membrane integrity by binding to phosphatidylinositol phosphates. Cell Reports. 7 (4), 971-981 (2014).
  28. Llambi, F., et al. BOK Is a Non-canonical BCL-2 Family Effector of Apoptosis Regulated by ER-Associated Degradation. Cell. 165 (2), 421-433 (2016).
  29. Malkani, N., Schmid, J. A. Some secrets of fluorescent proteins: distinct bleaching in various mounting fluids and photoactivation of cyan fluorescent proteins at YFP-excitation. PLoS One. 6 (4), 18586(2011).
  30. Perez, A. J., et al. A workflow for the automatic segmentation of organelles in electron microscopy image stacks. Frontiers in Neuroanatomy. 8, 126(2014).
  31. Walton, J. Lead aspartate, an en bloc contrast stain particularly useful for ultrastructural enzymology. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 27 (10), 1337-1342 (1979).
  32. Denk, W., Horstmann, H. Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure. PLoS Biology. 2 (11), 329(2004).
  33. Rossi, P., Xia, Y., Khanra, N., Veglia, G., Kalodimos, C. G. 15N and 13C- SOFAST-HMQC editing enhances 3D-NOESY sensitivity in highly deuterated, selectively [1H,13C]-labeled proteins. Journal of Biomolecular NMR. 66 (4), 259-271 (2016).
  34. Keller, R. The computer aided resonance assignment tutorial. Cantina Verlag. , (2004).
  35. Chen, W., et al. Diverse sequence determinants control human and mouse receptor interacting protein 3 (RIP3) and mixed lineage kinase domain-like (MLKL) interaction in necroptotic signaling. Journal of Biological Chemistry. 288 (23), 16247-16261 (2013).
  36. Tanzer, M. C., et al. Evolutionary divergence of the necroptosis effector MLKL. Cell Death & Differentiation. 23 (7), 1185-1197 (2016).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Ristampe e Autorizzazioni

Richiedi autorizzazione per utilizzare il testo o le figure di questo articolo JoVE

Richiedi Autorizzazione

Esplora altri articoli

Biologiaproblema 138Necroptosismisto lignaggio permeabilizzazione della membrana del plasmadominio come kinased MLKLcellule vive microscopiamicroscopiaspettroscopia NMRfosfoinositidi

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Riservatezza

Condizioni di utilizzo

Politiche

Contattaci

SUGGERISCI JOVE ALLA BIBLIOTECA

Newsletter di JoVE

Ricerca

Didattica

Autori

Personale delle biblioteche

CHI SIAMO

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. Tutti i diritti riservati