أسلوب نانوحبيبات الفضي للتخفيف من حدة المتلازمة الكبدية الصفراوية في الفئران

Summary

توضح هذه المقالة بالتفصيل أسلوب يقوم على جسيمات نانوية فضية لتخفيف المتلازمة الكبدية الصفراوية في طراز ماوس الكبدية الصفراوية تجريبية. سوف يساعد فهم راسخ لعملية إعداد كاشف وتقنية حقن الفأر الولدان تعريف الباحثين بالطريقة التي استخدمت في دراسات نموذجية الماوس الأطفال حديثي الولادة.

Abstract

الكبدية الصفراوية (BA) هو نوع شديد من التهاب الأوعية الصفراوية مع ارتفاع معدل الوفيات في الأطفال منها المسببات: هو لا تزال غير مفهومة تماما. الالتهابات الفيروسية قد يكون أحد الأسباب المحتملة. يحدد نموذج الحيوان النموذجية المستخدمة لدراسة درجة البكالوريوس تطعيم ماوس حديثي الولادة مع فيروس روتا الريسوسي. جسيمات فضة نانوية قد ثبت أن ممارسة تأثيرات مضادة للجراثيم والمضادة للفيروسات؛ يتم تقييم وظيفتها في طراز الماوس با في هذه الدراسة. حاليا، في التجارب على الحيوانات با، الأساليب المستخدمة لتحسين أعراض الفئران با الأعراض عموما علاجات تعطي عن طريق الأغذية أو الأدوية الأخرى. الهدف من هذه الدراسة هو إظهار أسلوب جديد لتخفيف متلازمة با في الفئران بحقن داخل جسيمات فضة نانوية وتوفير طرق مفصلة لإعداد صياغة جل نانوحبيبات الفضة. هذه الطريقة بسيطة وقابلة للتطبيق على نطاق واسع ويمكن استخدامها لإجراء بحوث إليه مكتبة الإسكندرية، وكذلك في العلاج السريري. استناداً إلى نموذج الماوس با، عند الفئران يحمل اليرقان، هلام نانوحبيبات الفضة استعداد يتم حقن إينترابيريتونيلي على سطح الكبد أقل. لوحظ في حالة البقاء على قيد الحياة، وهي دراسة المؤشرات البيوكيميائية والتشريح المرضى الكبد. يسمح هذا الأسلوب فهم أكثر بديهية لكلا إنشاء نموذج با ورواية با العلاج.

Introduction

با شكل من ركود صفراوي تتسم باستمرار اليرقان وارتفاع معدل الوفيات في غياب زرع الكبد. الالتهابات الفيروسية ترتبط ارتباطاً وثيقا بالآلية المرضية لمكتبة الإسكندرية. الفيروس المضخم للخلايا، ريوفيروس، وفيروس روتا جميعا قد اقترحت كممرضات في مكتبة الإسكندرية^1،،من²³. خلال فترة الوليد، استجابة النظام المناعي غير ناضجة لالتهاب فيروسي يؤدي إلى التقلبات محصنة ضد القنوات الصفراوية إضافية-وأحيانا، مما يؤدي إلى استموات الخلايا الظهارية الصفراوية، تسلل الخلايا الملتهبة في المدخل المنطقة، وانسداد القناة الصفراوية أحياناً واكستراهيباتيك، وأخيراً، تليف الكبد^4،،من⁵⁶.

نموذج الحيوان استخداماً للدراسات با ينطوي على تلقيح ماوس الوليد بفيروس الروتا الريسوسي (RRV). عادة ما تضع الماوس اليرقان بعد 5-6 أيام، عرض على وزن جسم منخفض والبراز أتشوليك. ويتمثل دور الاستجابة المناعية في عملية المرض الحرجة، خاصة بالنسبة للخلايا (ناغورني كاراباخ) القاتل الطبيعية؛ استنفاد هذه الخلايا مع الأجسام المضادة NKG2D يقلل كثيرا من الأضرار التي يسببها با⁷. وعلاوة على ذلك، الخلايا الأخرى، بما في ذلك خلايا CD4⁺ تي خلايا CD8⁺ تي الخلايا والخلايا الجذعية والخلايا التائية التنظيمية، الجميع تبين أن تلعب أدواراً في المرض^8،9،،من¹⁰¹¹. كافة البيانات تشير إلى طبيعة الجهاز المناعي أثناء با لا غنى عنه.

جسيمات فضة نانوية (أجنبس) أثبتت أن تكون لها آثار مفيدة ضد بعض الأمراض المعدية، بما في ذلك¹² من الإصابات البكتيرية والالتهابات الفيروسية^13،،من¹⁴¹⁵. بيد عدا استخدام الأمراض الجلدية، ودراسات قليلة استخدمت أجنبس في علاج السريري، معظمهم بسبب سميتها المحتملة. في التجارب على الحيوانات، وقد درس الباحثون عموما فعالية أجنبس تدار عن طريق الفم¹⁶ أو¹⁷من طرق الحقن الوريدي. ومع ذلك، لا باحثين آخرين درسوا فعالية أجنبس تدار عن طريق حقنه داخل (القائمة) في الماوس الولدان والتجارب، الذي هو طريقة بسيطة وسريعة تؤدي إلى تأثير مباشر أكثر في الكبد والقناة الصفراوية أثناء تقليل السمية إلى أنظمة أخرى مثل نظام المناعة. أجنبس قد ثبت أن تؤثر على نشاط الخلية ناغورني كاراباخ¹⁸؛ ولذلك، نحن اختبار الآثار العلاجية من أجنبس تدار عن طريق الحقن القائمة في نموذج الماوس با.

Protocol

جميع البروتوكولات التجريبية الحيوانية أقرتها لجنة استخدام صن يأت-صن الجامعة مختبر الحيوان مركز (#إياكوك-DB-16-0602) ورعاية الحيوان المؤسسية.

1-إنشاء نموذج الماوس الكبدية الصفراوية

1. الحفاظ على الحوامل بالب/ج الفئران في بيئة خالية من مسببات الأمراض محددة ضمن دورة الظلام/ضوء ح 12 عند 25 درجة مئوية، مع إمكانية الوصول إلى تشو يعقم libitum الإعلانية.
2. إعداد سلالة RRV MMU 18006 وتضخيم الفيروس في الخلايا MA104 وقياس التتر الفيروسية ب مقايسة البلاك¹⁹.
   ملاحظة: الخلايا MA104 تستزرع في المتوسطة تعديل النسر دولبيكو (دميم) مع 10% مصل بقرى الجنين (FBS) في حاضنة مع جو هوميديفيد التي تحتوي على 5% CO₂. فيما يلي بإيجاز الخطوات التضخيم.
   1. تصيب الخلايا MA104 (1.5 × 10⁷) في قارورة ثقافة² سم 150 مع تنشيط التربسين RRV [1.5 × 10⁶ وحدات تشكيل اللوحة (بفو)] في 30 مل متوسط خالية من المصل. احتضان الخلايا المصابة لمدة 3 أيام في حاضنة هوميديفيد عند 37 درجة مئوية مع شركة 5%₂.
   2. الخلايا المصابة في قارورة الثقافة بثلاث دورات التجميد والذوبان، مع 20 دقيقة في ثلاجة-80 درجة مئوية لتجميد كل مرحلة، وذوبان الخلايا، ثم مرة أخرى إلى درجة حرارة الغرفة؛ سوف تطلق الجسيمات الفيروسات المرتبطة بالخلية في المادة طافية. ثم جمع ونقل الخلية ليستي والثقافة طافية في أنبوب مخروطي 15 مل.
   3. إزالة الحطام الخلوية الكبيرة من بالطرد المركزي ذات سرعة منخفضة (300 x ز عند 4 درجة مئوية لمدة 3 دقائق). ثم قم بنقل المادة طافية المحتوية على الفيروس (حوالي 6 مل) في أنبوب 15 مل مخروطية الشكل جديد للتجارب على الحيوانات.
      ملاحظة: RRV ثم مستعدة لأن تكون تيتيريد أو الكوتيد، والمخزنة أو المستخدمة لجولات إضافية من التضخيم. التعرض الطويل الأمد لدرجة حرارة الغرفة وسوف تقلل من قدرة العدوى الفيروسية؛ ينبغي أن توضع على الجليد الفيروس والمخزنة في-80 درجة مئوية أو في نيتروجين سائل.
3. تحميل RRV إلى الأنسولين صغيرة حجم (1 مل) المحاقن بإبرة ز 29 لحقن الفأر حديثي الولادة.
   ملاحظة: سميكة الإبر من المحاقن الحجمي يؤدي بسهولة إلى تسرب المخدرات.
4. خلال 24 ساعة ولادة، إدارة لكل ميليلتر الوليد 20 من 1.2 × 10⁵ RRV بفو/مل عبر مسار القائمة؛ استخدم نفس الحجم من المياه المالحة كعنصر التحكم.
   ملاحظة: المحاقن المستخدمة في هذه التجربة حقنه الأنسولين 1 مل. الفئران المصابة غذيت لا عن طريق أمهاتهم توفي خلال أول يومين بسبب أسباب أخرى لم تدرج في التحليل.
5. ملاحظة جميع الفئران حديثي الولادة عن كثب وتزن لهم يوميا. عادة، في اليوم السادس بعد التلقيح RRV، يظهر اليرقان على الأذنين والجلد العارية، يصبح البراز من الصلصال الملون، والفراء يصبح الزيتية، مما يوحي بإنشاء نموذج مكتبة الإسكندرية؛ التحقق من وجود هذه الأعراض.
   ملاحظة: يمكن تأكيد با بإجراء فحص أنسجة كبد مقطع مع ح & ه وتفيد المناعي. ثم مستعدون الفئران با لعلاج عنب.
   تنبيه: البروتوكول قدم للاستخدام مع المعاصرة الإنسان والحيوان RV السلالات، التي يجب أن تعالج ضمن شروط السلامة البيولوجية المستوى 2 (BSL-2).

2-الفضة نانوحبيبات التوليف

1. إعداد وتوصيف أجنبس كما هو موضح سابقا^12،20.
   ملاحظة: تفاصيل الإعداد وتميز في أجنبس وقد وصف في منشورات فريق جيم م تشي في قسم الكيمياء، جامعة هونج كونج^12،20. وكان تركيز الحل النهائي 1 مم. قطر يعني أجنبس كان 10 نانومتر (تتراوح بين 5 إلى 15 نانومتر) وأكدت بالميكروسكوب الإلكتروني.

3-إعداد خليط الفضة نانوحبيبات الكولاجين

ملاحظة: إعداد مزيج الكولاجين في عنب وتتسم كما تم وصفه سابقا²¹ وتخزينها في 4 درجات مئوية. يجب إجراء كافة الإجراءات على الجليد.

1. أولاً، من أجل إعداد الكولاجين، إضافة 490 ميليلتر من النوع الأول من الكولاجين (4 مغ/مل) لأنبوب 1.5 مل ووضعه على الجليد.
2. إضافة 100 ميليلتر من الفوسفات مخزنة المالحة (برنامج تلفزيوني، 10 x) إلى الكولاجين ومزجها مع ماصة.
   1. لتحضير 1 لتر x 10 برنامج تلفزيوني المخزن المؤقت، الجمع بين 80 جرام من كلوريد الصوديوم وز 2 من بوكل ز 35.8 Na₂هبو₄^. 12 ح₂س إلى 2.4 ز خ₂ص₄ ومخزن المخزن المؤقت في درجة حرارة الغرفة.
3. ثم إضافة 10 ميليلتر من هيدروكسيد الصوديوم (0.2 M) إلى الحل أعلاه.
   1. لإعداد 0.2 M هيدروكسيد الصوديوم، إضافة 8 غم مسحوق هيدروكسيد الصوديوم إلى 1 لتر ماء المقطر.
4. وأخيراً، إضافة 400 ميليلتر من أجنبس (1 مم) إلى الكولاجين ومزجها مع ماصة.
   ملاحظة: إضافة أجنبس آخر لخلط حتى. يجب أن يتم تخزين المخلوط الكولاجين عنب عند 4 درجة مئوية؛ وبخلاف ذلك، فإنه بسهولة يتصلب في درجة حرارة الغرفة.

4-أسلوب الحقن الماوس

1. إدارة الفئران حديثي الولادة المصابين في المجموعة RRV تعامل مع حقن القائمة من 50 ميليلتر في عنب خليط الكولاجين بعد ظهور اليرقان؛ إجراء حقن ثانية د 3 في وقت لاحق.
   ملاحظة: يتم إعطاء الفئران في المجموعة (مراقبة المصابة) RRV التحكم نفس الحجم من المحلول الملحي، والفئران في مجموعة التحكم العادية لا تعطي أي علاج.
2. في بداية الحقن، اضغط الساق الماوس مع الإصبع خاتم منحرف على الفخذ الأيمن، وإدخال الإبرة ببطء بزاوية 15 درجة (الشكل 1). عند الوصول إلى سطح الحافة السفلية للكبد (الشكل 2)، حوالي 0.5 سم في، حقن مزيج الكولاجين في عنب؛ وبعد ذلك، سحب الإبرة ببطء.
   ملاحظة: ينبغي الحرص على عدم إدخال أي الهواء في المحاقن ك، ثم، قد يكون قتل الماوس الأطفال حديثي الولادة. في الفئران حديثي الولادة، المعدة والطحال في البطن الأيسر، وبطنه مليء بالحليب. إذا الحقن تدار من هذا الجانب، يمكن بسهولة إدخال الإبرة أما المعدة، مما تسبب في اللبن في التدفق إلى تجويف البطن، أو الطحال، مما تسبب في نزيف.
   تنبيه: الاهتمام بالإبرة لمنع أي إصابات الأصابع، وتأكد من استبدال الغطاء إبرة وإزالة الإبرة، ووضعه في حاوية الأدوات الحادة.
3. بعد جميع الحقن، الحفاظ على الفئران من اقفاصها لمدة 10 دقيقة للسماح الخليط الكولاجين عنب لجل ومنع الأم من لعق مكان الحقن. ثم العودة الفئران إلى اقفاصها.
4. مراقبة وتسجيل المظاهر المادية لجميع الفئران يوميا، بما في ذلك اليرقان ووزن الجسم، فضلا عن أن معدل البقاء على قيد الحياة.

5-الدم عينة جمع

ملاحظة: يتم جمع عينات دم من حوالي 120 ميليلتر بإدخال الإبرة في القلب. بعد الطرد المركزي، هو المصل المجمعة (ميليلتر حوالي 70) لاختبار وظيفة الكبد. طريقة جمع الدم كما يلي.

1. تخدير الفئران في اليوم التاسع والثاني عشر بعد التلقيح RRV (و 3 أيام بعد العلاج عنب) باستخدام 0.5-2.5 ٪ سيفوفلوراني.
2. شل أطرافه الماوس وتعقيم البطن العلوي والسفلي مع 75 ٪ من الكحول.
3. كشف الحجاب الحاجز عن طريق قطع الماوس الجلد والعضلات والصفاق على طول خط الوسط الرهابه مع مقص؛ استخدم مسحه القطن معقم لإزالة الجهاز الهضمي لفضح تماما في عضلة الحجاب الحاجز.
4. إدراج الإبرة (مع حقنه الأنسولين تفريغ 1 مل) في البطين الأيسر للقلب وبطء سحب المكبس حقنه للحصول على حجم الدم كحد أقصى. ثم قم بنقل الدم إلى أنبوب 1.5 مل.
5. يسمح الأنبوب إلى الوقوف لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة والطرد المركزي أنه لمدة 5 دقائق في 400 x غ. ثم، باستخدام ماصة نقل، جمع وحفظ المصل لاستخدامها مرة أخرى.
   ملاحظة: تجنب إتلاف الحاجز، كالحجاب الحاجز العيوب يؤدي بسهولة إلى استرواح الصدر، والموت، وتخثر الدم، مما يحول دون جمع عينة الدم.

6-اكتشاف المعلمة الكيمياء الحيوية

1. استخدام مصل الدم التي تم جمعها في الخطوة 5، 5 للكشف عن معلمة الكيمياء الحيوية.
2. استخدام محلل بيوكيميائية الآلي الكشف عن المعلمات البيوكيميائية التالية: aminotransferase ألانين (البديل)، أمينوترانسفيراسي اسبارتاتي (أست)، الفوسفاتيز القلوية (حزب العمال الأسترالي)، البروتين الكلي (TP)، الزلال (القلب)، الجلوبيولين (GLO)، ومجموع البيليروبين (تبيل)، البيليروبين المباشر (دبيل)، البيليروبين غير المباشر (أبل)، وإجمالي الأحماض الصفراوية (يعلن عنها لاحقاً).

7-اكستراهيباتيك تشولانجيوجرافي لمراقبة سالكيه القناة الصفراوية اكستراهيباتيك

ملاحظة: تنفيذ العملية بأكملها تحت مجهر تشريح.

1. كشف تماما في الكبد، والمرارة والقنوات الصفراوية extrahepatic مع مسحه القطن.
2. مراقبة وتصوير مظهر الكبد والقناة الصفراوية تحت مجهر تشريح.
3. استخدام الملقط العيون بلطف عقد الجزء السفلي من المرارة.
4. تحميل 1 مل حقنه بمحلول أزرق الميثيلين (wt.% 0.05 في ح₂س). أدخل إبرة حقنه ببطء في تجويف المرارة؛ ثم أمسك الإبرة مع الملقط العيون، ويبث ببطء 10 – 20 ميليلتر من الميثيلين الأزرق.
5. مراقبة تحت مجهر ما إذا كان اللون الأزرق يمر عبر الصفراوية اكستراهيباتيك إلى الصائم وأخذ صورة فوتوغرافية.

8-جمع عينات الكبد الطازج توضع وتلطيخ ويوزين

1. إصلاح الماوس جديدة أنسجة الكبد بين عشية وضحاها في الفورمالين 10%.
2. ثم تضمين أنسجة الكبد الثابتة في البارافين وقسم منهم.
3. دو المقاطع، ترطيب لهم مع سلسلة إيثانول (مثل الإيثانول 100%، 95%، 80%، و 70% في الماء المقطر، كل منهما لمدة 5 دقائق)، ووصمة عار أقسام الأنسجة مع توضع، وإخضاعها لتفريق الكحول حمض الهيدروكلوريك 1%، وأخيراً، وصمة عار مقاطع مع ويوزين.
4. وأخيراً، نلاحظ الأنسجة الكبد تحت مجهر X 40.

9-المناعي تلطيخ الأنسجة الملطخة ثم قسمي وتوضع

1. بعد ديواكسينج وريهيدراتينج المقاطع، القيام استرجاع مستضد غمر المقاطع في تريس يدتا المخزن المؤقت (قاعدة تريس 10 ملم، والحل يدتا 1 مم؛ pH 9.0) وتدفئة لهم في فرن ميكروويف لمدة 10 دقائق عند 95 درجة مئوية.
2. إزالة البيروكسيديز الذاتية بفضح مقاطع الأنسجة لمدة 10 دقيقة لحل بيروكسيد الهيدروجين 3%.
3. علاج المقاطع مع مصل الماعز 5%، لمنع الربط غير محدد.
4. إضافة الأجسام المضادة الأولية أرنب-ماوس NKG2D (1: 100) للفروع، واحتضان هذه بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
5. احتضان الفروع مع الأجسام المضادة الثانوية المناسبة (المسمى HRP البوليمر أرنب المناهضة النظام) لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
6. تصور المناعي تلطيخ استخدام 3، 3 '--ديامينوبينزيديني (DAB) تشروموجين.
7. مراقبة الأقسام تحت مجهر X 40، والحصول على الصور، والشروع في تحليل هذه كما هو مطلوب.

10-تدفق سيتوميتريك التحليل

1. بلطف فرم نسيج الكبد، يمر عبر مصفاة خلية 70 ميكرومتر، والطرد المركزي هو 2 x في x 270 ز عند 4 درجة مئوية لمدة 4 دقائق.
2. ريسوسبيند بيليه خلية في المتوسط RPMI 1640 ونحللها باللونين الفلورة استخدام الأجسام المضادة.
3. أداء فينوتيبينج الخلوية باستخدام علامات سطح الخلية المحددة، بما في ذلك fluorescein isothiocyanate و phycoerythrin مترافق مكافحة--NKp46 (لمفاوية ناغورني كاراباخ؛ 1:1، 000) ومكافحة-CD4 (تي خلية نوع فرعي؛ 1:1، 000)، مع سيتوميتير تدفق البيانات وتحليلها مع التدفق الخلوي برامج تحليل البيانات.
4. حدد الخلية السكان وفقا للأمام/الجانب مبعثر، البوابة وفقا لضوابط ايستب للأسفار أي خلفية، وإخضاع البيانات لتحليل ثانوي استناداً إلى إشارات الأسفار من الأجسام المضادة للأفراد.

النتائج

استناداً إلى نموذج الماوس با الراسخة، كانت تدار من الفئران حديثي الولادة المصابين حقنه القائمة في عنب استعداد خليط الكولاجين 2 x بعد العارضة اليرقان. تم التحقق من بقاء الماوس يوميا، وأجريت اختبارات وظائف الكبد وأمراض الكبد، والتدفق الخلوي. مقارنة بالفئران غير المعالجة ا...

Discussion

أجنبس يحمل خصائص مضادة للجراثيم واسعة الطيف قوية ونفاذيه قوية²²؛ بالإضافة إلى ذلك، يتم استخدامها لإنتاج مجموعة من المنتجات المضادة للبكتيريا الطبية²³. ومع ذلك، أجنبس يمكن أن يستغرق وقتاً طويلاً لمسح مرة واحدة أنها تتراكم في الأعضاء، واستمرار هذه قد تؤدي إلى تأثي?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
BALB/c mouse	Guangdong Medical Experimental Animal Center	SYXK2017-0174	Animal experiment
Rhesus rotavirus (RRV)	ATCC	ATCC VR-1739	Establish biliary atresia mouse model
MA104 cells	ATCC	ATCC CRL-2378.1	For laboratory use only
DMEM	Thermo Fisher	10569010	Mammalian Cell Culture
Fetal Bovine Serum	Thermo Fisher	10099141	Mammalian Cell Culture
collagen Type I	CORNING	354236	For research use only
PBS buffer	OXOID	BR0014G	For washing
NaOH	Sigma	1310-73-2	Adjust the PH value
AgNP			Antibacterial Note: The AgNps was a gift from Prof CM Che. in the Department of Chemistry, the University of Hong Kong.
Insulin syringe with integrated needle	BD	9161635S	For medical use
15 mL Centrifuge Tube	Corning	430791	For laboratory use only
1.5 mL Microcentrifuge Tube	GEB	CT0200-B-N	For laboratory use only
Microscope	Nikon	ECLIPSE-Ci	For laboratory use
Dissecting/Intravital microscope	Nikon	SMZ 1000	For laboratory use
anti-Mouse NKp46 FITC	eBioscience	11-3351	For research use only
anti-Mouse CD4 PE-Cyanine5	eBioscience	15-0041	For research use only
Monoclonal Mouse Anti-Human CD4	DAKO	20001673	For research use only
anti-NKG2D	RD	MAB1547	For research use only
BD FACSCanto Flow Cytometer	BD Biosciences	FACS Canto Plus	For laboratory use only