Um método de nanopartículas prata para atenuar a síndrome de Atresia biliar em ratos

Resumo

Este artigo descreve detalhadamente um método baseado em nanopartículas de prata para atenuar a síndrome de atresia biliar em um modelo do rato de atresia biliar experimental. Uma sólida compreensão do processo de preparação de reagente e a técnica de injeção de rato neonatal ajudará a familiarizar os pesquisadores com o método utilizado em estudos de modelo de rato neonatal.

Resumo

Atresia biliar (BA) é um tipo grave de colangite, com alta mortalidade em crianças do que a etiologia é ainda não totalmente compreendida. Infecções virais podem ser uma causa possível. O típico modelo animal para estudar BA é estabelecido por inocular um rato neonatal com um rotavírus rhesus. Nanopartículas de prata foram mostradas para exercer efeitos antibacterianos e antivirais; sua função no modelo do rato de BA é avaliada neste estudo. Atualmente, em experiências com animais BA, os métodos utilizados para melhorar os sintomas dos ratos BA são tratamentos geralmente sintomáticos dada através de alimentos ou outras drogas. O objetivo deste estudo é demonstrar um novo método para atenuar a síndrome de BA em ratos pela injeção intraperitoneal de nanopartículas de prata e para fornecer métodos detalhados para preparar a formulação de gel de nanopartículas de prata. Este método é simples e amplamente aplicável e pode ser usado para pesquisar o mecanismo de BA, bem como em tratamentos clínicos. Baseia-se no modelo do rato de BA, quando os ratos exibem icterícia, o gel de nanopartículas de prata preparado é injetado intraperitonealmente à superfície do fígado inferior. Observa-se o status de sobrevivência, e indicadores bioquímicos e histopatologia hepática são examinados. Este método permite uma compreensão mais intuitiva de ambos o estabelecimento dos novos tratamentos de BA e modelo BA.

Introdução

BA é uma forma de colestase caracterizada por icterícia persistente e tem alta mortalidade na ausência de transplante hepático. Infecções virais estão intimamente associadas com a patogênese da BA. O citomegalovírus, reovírus e rotavírus têm sido sugeridos como patógenos na BA^1,2,3. Durante o período neonatal, a resposta do sistema imunológico imaturo para uma infecção viral resulta em alteração no sistema imunológica contra ductos biliares intra e extra, levando à apoptose de células epiteliais biliar, infiltração de células inflamatórias no portal área, obstrução biliar intra-hepática e extra-hepática e finalmente, fibrose hepática,^4,5,6.

O modelo animal comumente utilizado para estudos de BA envolve a inoculação de um rato neonatal com o rotavírus rhesus (RRV). O mouse normalmente desenvolve icterícia após 5-6 dias, apresentando um peso de corpo baixo e fezes acholic. O papel da resposta imune no processo de doença é crítico, especialmente para as células killer naturais (NK); o esgotamento dessas células com anticorpo anti-NKG2D reduz dano induzido por BA⁷. Além disso, outras células, incluindo CD4⁺ T células CD8⁺ T células, as células dendríticas e pilhas de T reguladoras, todos foram mostradas para desempenhar funções na doença^8,9,10,11. Todos os dados sugerem a natureza indispensável do sistema imunológico, no decurso de BA.

Nanopartículas de prata (AgNPs) tem sido demonstradas para ter efeitos benéficos contra algumas doenças infecciosas, incluindo infecções bacterianas¹² e infecções virais^13,14,15. No entanto, além de uso dermatológico, poucos estudos têm usado AgNPs em um tratamento clínico, principalmente por causa da sua toxicidade potencial. Em experimentos com animais, os investigadores estudaram-se geralmente a eficácia de AgNPs administrado via oral¹⁶ ou intravenosa métodos¹⁷. No entanto, não há outros pesquisadores estudaram a eficácia de AgNPs administrado através de uma injeção intraperitoneal (i.p.) em rato neonatal de experiências, que é um método simples e rápido levando a um efeito mais direto sobre o fígado e ductos biliares, enquanto reduzir a toxicidade de outros sistemas, como o sistema imunológico. AgNPs foram mostrados para afetar a atividade de células NK¹⁸; Portanto, nós testamos os efeitos terapêuticos da AgNPs administrado através de injeção i.p. no modelo do rato de BA.

Protocolo

Todos os protocolos experimentais animais foram aprovados pelo Comitê de uso do Sun Yat-Sen University laboratório Animal Center (#IACUC-DB-16-0602) e institucionais Cuidado Animal.

1. estabelecer o modelo de Mouse de Atresia biliar

1. Manter grávidos camundongos BALB/c em um ambiente livre de patógeno específico sob um ciclo claro/escuro de 12 h a 25 ° C, com acesso a comida esterilizada ad libitum.
2. Para preparar a estirpe RRV MMU 18006, amplificar o vírus nas células MA104 e medir a concentração viral por uma placa de ensaio¹⁹.
   Nota: Células MA104 são cultivadas em meio da águia modificados de Dulbecco (DMEM), com 10% soro bovino fetal (FBS) em uma incubadora, com um ambiente umidificado contendo 5% de CO₂. As etapas de amplificação são brevemente descritas abaixo.
   1. Infectar células MA104 (1,5 x 10⁷) num frasco de cultura² 150cm com tripsina activada RRV [1,5 x 10⁶ deformação unidades (PFU)] em 30 mL de meio livre de soro. Incube as células infectadas por 3 dias numa incubadora umidificado a 37 ° C com 5% de CO₂.
   2. Lisar as células infectadas no frasco de cultura por três ciclos de congelamento e descongelamento, com 20 min em um freezer-80 ° C para cada congelar fase e, em seguida, descongelar as células de volta à temperatura ambiente; a partícula do vírus associado a célula irá lançar para o sobrenadante. Em seguida, coletar e transferir o lisado celular e cultura sobrenadante para um tubo cônico de 15 mL.
   3. Remova restos celulares grandes o lisado por centrifugação de baixa velocidade (300 x g a 4 ° C por 3 min). Em seguida, transferi o sobrenadante contendo o vírus (cerca de 6 mL) para um novo tubo cônico de 15 mL para experiências em animais.
      Nota: O RRV está pronto para ser titulada, aliquotadas e armazenados ou usados para rodadas adicionais de amplificação. A exposição prolongada a temperatura irá reduzir a capacidade de infecção viral; o vírus deve ser colocado no gelo e armazenado a-80 ° C ou em nitrogênio líquido.
3. Carga a RRV em uma insulina de pequeno volume (1ml) seringa com uma agulha de 29 G para a injeção de rato neonatal.
   Nota: As grossas agulhas de seringas volumétricas facilmente levam à fuga de drogas.
4. Dentro de 24 horas de nascimento, administrar a cada µ de neonato 20 l de 1,2 x 10⁵ RRV PFU/mL através da rota de i.p.; Use o mesmo volume de solução salina como o controle.
   Nota: A seringa usada neste experimento é uma seringa de insulina 1 mL. Ratos infectados que não foram alimentados por suas mães morridas dentro dos primeiros 2 dias devido a outras razões não foram incluídos na análise.
5. Observar de perto todos os mouses Neonatais e pesá-los diariamente. Normalmente, no sexto dia após a inoculação do RRV, icterícia aparece nas orelhas e pele nua, as fezes torna-se cor de barro, e a pele se torna oleosa, sugerindo a criação do modelo BA; Verifique estes sintomas.
   Nota: BA pode ser confirmada por um exame de seção de tecido hepático com H & E e imuno-histoquímica afirmando. Os ratos BA então estão prontos para o tratamento da AgNP.
   Atenção: O protocolo apresentado é para uso com contemporânea animais e humanas RV cepas, que deve ser tratado em condições de biossegurança nível 2 (BSL-2).

2. síntese de nanopartículas de prata

1. Preparar e caracterizar o AgNPs como descrito anteriormente,^12,20.
   Nota: Os detalhes de preparação e caracterizando o AgNPs têm sido descritos em publicações pela equipe do C. M. Che no departamento de química, Universidade de Hong Kong,^12,20. A concentração final da solução foi de 1 mM. O diâmetro médio do AgNPs era 10 nm (variando de 5 a 15 nm) e confirmado por microscopia electrónica.

3. preparação da mistura prata Nanoparticle colágeno

Nota: A mistura de colágeno AgNP é preparada e caracteriza-se como descrito anteriormente a²¹ e armazenado a 4 ° C. Todos os procedimentos devem ser efectuados no gelo.

1. Primeiro, para a preparação de colágeno, adicionar 490 µ l do tipo I de colágeno (4 mg/mL) para um tubo de 1,5 mL e colocá-lo no gelo.
2. Adicione 100 µ l de tampão fosfato salino (PBS, 10x) para o colágeno e misturá-lo com uma pipeta.
   1. Para preparar 1 L de tampão de PBS x 10, combinar 80g de NaCl, 2 g de KCl e 35,8 g de Na₂HPO₄^. 12H₂O a 2,4 g de KH₂PO₄ e loja reserva em temperatura ambiente.
3. Em seguida, adicione 10 µ l de NaOH (0,2 M) para a solução acima.
   1. Para preparar a 0,2 M de NaOH, adicione 8 g de NaOH em pó para 1 litro de água destilada.
4. Finalmente, adicionar 400 µ l de AgNPs (1 mM) para o colágeno e misturá-los com uma pipeta.
   Nota: Adicione o AgNPs último para uma mistura mesmo. A mistura de colágeno AgNP deve ser armazenada a 4 ° C; caso contrário, ela facilmente se solidifica à temperatura ambiente.

4. Mouse método de injeção

1. Administrar os ratos infectados neonatais no grupo RRV tratado com uma injeção i.p. de 50 µ l da mistura de colágeno AgNP após o aparecimento de icterícia; Realize uma segunda injeção 3 d mais tarde.
   Nota: Os ratos no grupo controle RRV (controle infectado) recebem o mesmo volume de solução salina, e os ratos do grupo controle normal não recebem nenhum tratamento.
2. No início da injeção, pressione a perna do mouse com o dedo anelar obliquamente sobre a coxa direita e introduzir a agulha lentamente em um ângulo de 15° (Figura 1). Ao atingir a superfície da borda inferior do fígado (Figura 2), cerca de 0,5 cm em, injetar a mistura de colágeno AgNP; em seguida, retire a agulha lentamente.
   Nota: Tenha cuidado para não introduzir nenhum ar dentro da seringa como, então, o rato neonatal pode ser morto. Em camundongos neonatais, estômago e baço estão na parte esquerda do abdome, e o estômago está cheio de leite. Se a injeção é administrada por este lado, a agulha poderia facilmente entrar ou o estômago, causando o leite a fluir para a cavidade abdominal, ou o baço, causando sangramento.
   Atenção: Preste atenção a agulha para evitar qualquer lesão do dedo e certifique-se de substituir a tampa da agulha, retire a agulha e colocá-lo em um recipiente de objectos cortantes.
3. Depois de todas as injeções, manter os ratos das gaiolas durante 10 minutos permitir a mistura de colágeno AgNP ao gel e para impedir que a mãe lamber o local da injeção. Em seguida, retorne os ratos de suas gaiolas.
4. Observar e registrar as aparências físicas de todos os mouses diariamente, incluindo icterícia e peso corporal, bem como a taxa de sobrevivência.

5. sangue coleta da amostra

Nota: São colhidas amostras de sangue de aproximadamente 120 µ l inserindo a agulha no coração. Após a centrifugação, o soro é coletado (aproximadamente 70 µ l) para testes de função hepática. O método de coleta de sangue é a seguinte.

1. Anestesiar os ratos no 9º e 12º dia após a inoculação de RRV (que é 3 dias após o tratamento da AgNP) usando 0.5-2.5% sevoflurano.
2. Imobilizar os membros do mouse e esterilizar o abdômen superior e inferior com 75% de álcool.
3. Expor o diafragma cortando o mouse pele, músculo e peritônio ao longo da linha mediana para o xifoide com tesoura; Use um cotonete estéril para remover o trato gastrointestinal para expor totalmente o músculo diafragma.
4. Insira a agulha (com uma seringa de 1 mL insulina descarregado) no ventrículo esquerdo do coração e puxe lentamente o êmbolo da seringa para obter o volume máximo de sangue. Em seguida, transfira o sangue para um tubo de 1,5 mL.
5. Deixe os tubos repousar durante 30 min à temperatura ambiente e centrifugue por 5 min a x 400 g. Em seguida, usando uma pipeta de transferência, recolher e guardar o soro para utilização posterior.
   Nota: Evite danificar o diafragma, como diafragma defeitos facilmente levam a pneumotórax, morte e coagulação do sangue, evitando assim a coleta de amostra de sangue.

6. bioquímica detecção de

1. Use o soro coletado na etapa 5.5 para uma detecção de parâmetro bioquímicos.
2. Use um analisador bioquímico automatizado para detectar os seguintes parâmetros bioquímicos: alanina aminotransferase (ALT), aspartato aminotransferase (AST), fosfatase alcalina (FAL ou ALP), proteína total (TP), albumina (ALB), globulina (GLO), bilirrubina total (TBIL), bilirrubina direta (DBIL), bilirrubina indireta (IBIL) e ácidos biliares totais (TBA).

7. extra-hepática colangiografia para observar a desobstrução biliar extra-hepática

Nota: Execute todo o processo sob um microscópio de dissecação.

1. Expor totalmente o fígado, vesícula e vias biliares extra-hepáticas com um cotonete.
2. Observar e fotografar a aparência do fígado e ductos biliares sob um microscópio de dissecação.
3. Use o fórceps oftálmico para pressione cuidadosamente a parte inferior da vesícula biliar.
4. Carrega uma seringa de 1 mL com solução de azul de metileno (0.05 wt.% em H₂O). Lentamente, introduza a agulha da seringa para a cavidade da vesícula biliar; Então, segure a agulha com a pinça de Oftalmologia e infundir lentamente 10 – 20 µ l de azul de metileno.
5. Observar ao microscópio se a cor azul passa através dos ductos biliares extra-hepáticas para o jejuno e tirar uma fotografia.

8. coleta de amostras de fígado frescas de hematoxilina e eosina coloração

1. Corrigi o mouse fresco fígados tecidos durante a noite em formol a 10%.
2. Em seguida, incorporar os tecidos hepáticas fixos em parafina e seção-los.
3. Dewax as seções, hidratá-los com uma série de etanol (como 100%, 95%, 80% e 70% de etanol em água destilada, cada um por 5 min), mancha as seções de tecido com hematoxilina, sujeitá-los a uma diferenciação de álcool de ácido clorídrico 1% e finalmente, manchar a seções com eosina.
4. Finalmente, observe a Histopatologia do fígado sob um microscópio X 40.

9. coloração imuno-histoquímica da hematoxilina e eosina-manchado cortes histologicos

1. Depois de desparafinagem e reidratar as seções, executar uma recuperação de antígeno por submergir as seções em tampão Tris-EDTA (base de Tris 10 mM, 1 mM EDTA solução; pH 9.0) e aquecimento no microondas durante 10 minutos a 95 ° C.
2. Remova a peroxidase endógena, expondo as secções de tecido para 10 min para uma solução de peróxido de hidrogênio 3%.
3. Trate as seções com 5% de soro de cabra, para bloquear a ligação inespecífica.
4. Adicionar os anticorpos primários coelho-rato NKG2D (1: 100) para as seções e incube-os durante a noite a 4 ° C.
5. Incube as secções com os anticorpos secundários apropriados (sistema de antipolímero coelho HRP-rotulados) por 30 min à temperatura ambiente.
6. Visualize a coloração imuno-histoquímica utilizando 3, 3'-diaminobenzidine (DAB) como cromógeno.
7. Observar as seções sob um microscópio X 40, adquirir imagens e prossiga para analisá-los conforme desejado.

10. fluxo Cytometric Analysis

1. Delicadamente picar o tecido do fígado, passá-lo através de um filtro de célula de 70 µm e centrifugue-2 x a 270 x g a 4 ° C por 4 min.
2. Ressuspender as células em meio RPMI 1640 e analisá-lo por imunofluorescência de duas cores usando anticorpos monoclonais.
3. Realizar fenotipagem celular usando marcadores específicos da pilha-superfície, incluindo fluoresceína isotiocianato e ficoeritrina-conjugado anti-NKp46 (linfócitos NK; 1:1, 000) e anti-CD4 (subtipo de célula T; 1:1, 000), com um citômetro de fluxo e analisar os dados com software de análise dados de citometria de fluxo.
4. Selecione as populações de células de acordo com a dispersão de frente/lateral, portão de acordo com os controles do isotipo para contabilizar qualquer fluorescência de fundo e submeter os dados para uma análise secundária baseada os sinais de fluorescência de anticorpos individuais.

Resultados

Baseado no modelo estabelecido BA rato, foram administrados os ratos infectados neonatais uma injeção i.p. da mistura preparada de colágeno AgNP 2 x depois exibindo icterícia. Sobrevivência do mouse foi verificada diariamente e efectuaram-se testes de função hepática, patologia hepática e citometria de fluxo. Em comparação com os ratos de BA de controle sem tratamento, os ratos tratados com AgNP mostraram redução da icterícia e mantiveram seu peso normal (

Discussão

AgNPs apresentam propriedades antibacterianas amplo espectro potentes e uma permeabilidade forte²²; Além disso, eles são usados para produzir uma gama de produtos médicos antibacteriano²³. No entanto, AgNPs pode levar um longo tempo para limpar uma vez que se acumulam em órgãos, e esta persistência pode levar a efeitos tóxicos^24,25. Um estudo anterior analisou a toxicidade aguda e genotoxicidade de AgNPs apó...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
BALB/c mouse	Guangdong Medical Experimental Animal Center	SYXK2017-0174	Animal experiment
Rhesus rotavirus (RRV)	ATCC	ATCC VR-1739	Establish biliary atresia mouse model
MA104 cells	ATCC	ATCC CRL-2378.1	For laboratory use only
DMEM	Thermo Fisher	10569010	Mammalian Cell Culture
Fetal Bovine Serum	Thermo Fisher	10099141	Mammalian Cell Culture
collagen Type I	CORNING	354236	For research use only
PBS buffer	OXOID	BR0014G	For washing
NaOH	Sigma	1310-73-2	Adjust the PH value
AgNP			Antibacterial Note: The AgNps was a gift from Prof CM Che. in the Department of Chemistry, the University of Hong Kong.
Insulin syringe with integrated needle	BD	9161635S	For medical use
15 mL Centrifuge Tube	Corning	430791	For laboratory use only
1.5 mL Microcentrifuge Tube	GEB	CT0200-B-N	For laboratory use only
Microscope	Nikon	ECLIPSE-Ci	For laboratory use
Dissecting/Intravital microscope	Nikon	SMZ 1000	For laboratory use
anti-Mouse NKp46 FITC	eBioscience	11-3351	For research use only
anti-Mouse CD4 PE-Cyanine5	eBioscience	15-0041	For research use only
Monoclonal Mouse Anti-Human CD4	DAKO	20001673	For research use only
anti-NKG2D	RD	MAB1547	For research use only
BD FACSCanto Flow Cytometer	BD Biosciences	FACS Canto Plus	For laboratory use only