マウスにおける胆道閉鎖症症候群を改善するための銀ナノ粒子法

要約

この資料では、銀ナノ粒子実験的胆道閉鎖症マウスモデルにおける胆道閉鎖症症候群を改善するための手法について詳しく説明します。試薬の準備プロセスおよび新生仔マウス注入の技術をしっかりと理解は、新生児マウス モデル研究で用いられた方法と研究者を理解に役立ちます。

要約

胆道閉鎖症 (BA) は、病因はまだ完全に理解するの子供の高い死亡率と胆管炎の重症型です。ウイルス感染症は、原因の 1 つかもしれません。BA の勉強に使用する典型的な動物モデルを確立するには、アカゲザルのロタウイルスを新生児マウスに接種します。抗菌・抗ウイルス効果を発揮する銀ナノ粒子が示されています。BA マウス モデルでの機能は、この研究で評価されます。現在、BA 動物実験で BA マウスの症状を改善する方法について、一般的に症状の治療を経由で食物や他の薬物を与え。本研究の目的は、銀ナノ粒子の腹腔内投与によるマウスの BA 症候群を改善するための新しい方法を示すため、銀ナノ粒子ゲル製剤を準備するための詳細な方法を提供します。この方法は簡単で、広く適用できると ba, だけでなく、臨床治療のメカニズムの研究に使用することができます。BA マウス モデルに基づいて、マウスが黄疸を示す場合、準備された銀ナノ粒子ゲルは低い肝臓の表面に腹腔内に注入されます。生存状態を観察し、生化学的指標と肝の病理組織を検討しました。このメソッドは、BA モデルと新しい BA 治療法成立のより直感的に理解できます。

概要

BA は胆汁うっ滞、永続的な黄疸が特徴の形態であり、高い死亡率は、肝移植の不在。ウイルス感染が BA の病態と密接に関連します。サイトメガロ ウイルスやレオウイルス、ロタウイルスは BA^1,2,3の病原体としてすべて提案されています。新生児期には、ウイルス感染に未熟な免疫システムの反応の結果余分な - と肝内胆管、胆管上皮細胞のアポトーシス、ポータルで炎症性細胞浸潤につながるに対して免疫不全領域、肝内および肝外胆管閉塞、そして最後に、肝線維症^4,5,6。

BA 研究の一般的に使用される動物モデルには、アカゲザルのロタウイルス (RRV) 新生仔マウスの接種が含まれます。マウスは通常、低体重と灰白色便を示す後 5-6 日、黄疸を開発しています。病気の過程における免疫応答の役割は重要、特にナチュラル キラー (NK) 細胞;アンチ NKG2D 抗体とこれらの細胞の枯渇は、BA ダメージ⁷を大きく軽減されます。さらに、他のセル、CD4 を含む⁺ T 細胞、CD8⁺ T 細胞、樹状細胞、T 細胞、すべて示されている疾患^8,9,10,11の役割を果たします。すべてのデータは、BA の過程で免疫システムの不可欠な性質をお勧めします。

銀ナノ粒子 (AgNPs) は、¹²細菌感染症とウイルス感染症^13,14,15を含むいくつかの感染症に対して有益な効果があると実証されています。ただし、皮膚の使用率以外いくつかの研究使用している AgNPs 臨床治療の潜在的な毒性が主な原因。動物実験で研究者は一般に口腔を介してAgNPs 投与¹⁶または静脈内投与方法¹⁷の有効性を調査しました。しかし、ない他の研究者は AgNPs 投与による新生仔マウスにおける腹腔注入実験、簡易迅速法は、肝臓の中の胆管のより直接的な影響につながる効果を研究しています。免疫システムなど、他システムへの毒性を減らします。NK 細胞活性¹⁸; に影響を与える AgNPs が示されています。したがって、我々 は BA マウス モデルで i. p. 注入を介してAgNPs 投与の治療効果をテストしました。

プロトコル

すべての動物実験的プロトコルは、機関の動物の世話、太陽 Yat Sen 大学実験動物センター (#IACUC-DB-16-0602) の利用委員会によって承認されています。

1 胆道閉鎖症のマウスモデルの確立

1. オートクレーブ チョウ広告自由にアクセスできる、25 ° C で 12 h ダーク/ライト サイクル下特定病原体フリーの環境で妊娠中の BALB/c マウスを維持します。
2. RRV 株 MMU 18006 を準備するには、MA104 細胞でウイルスを増幅し、プラーク法¹⁹ウイルス抗体価を測定します。
   注: MA104 細胞培養されるダルベッコ変法イーグル培地 (DMEM) で 10% 牛胎児血清 (FBS) インキュベーター内で 5% CO₂を含む加湿雰囲気。増幅の手順を簡単に紹介いたします。
   1. MA104 細胞に感染する (1.5 x 10⁷) 無血清培地 30 mL のトリプシン活性化 RRV [1.5 x 10⁶プラーク形成単位 (PFU)] と 150 cm²培養フラスコで。5% CO₂と 37 ° C で加湿のインキュベーターで 3 日間の感染細胞を孵化させなさい。
   2. 各固定相、室温; に戻して細胞を融解し、-80 ° C のフリーザーで 20 分で、3 つの凍結-融解サイクルによって培養用フラスコに感染した細胞を溶解させます。細胞のウイルス粒子は、培養上清を発売いたします。収集し、15 mL の円錐管に細胞ライセートや培養上清を転送します。
   3. 低速遠心分離 (300 x gで 3 分のための 4 ° C) によってライセートから大規模な細胞の残骸を削除します。その後、動物実験のための新しい 15 mL の円錐管にウイルス (約 6 mL) を含む上清を転送します。
      注: RRV は胃と検体、または増幅の追加ラウンドのために使用される格納される準備ができているし。部屋の温度への長期露出はウイルス感染能力を減らすウイルスは、氷の上に配置、-80 ° c または液体窒素中で保存されている必要があります。
3. 負荷は少量 (1 mL) インスリンに RRV の新生児マウス注射用 29 G 注射針と注射器します。
   注: 体積注射器の太い針は簡単に薬物の漏洩に します。
4. 出生 24 時間以内 10⁵ Pfu/ml RRV経由でi. p. ルート x 1.2 の各新生児 20 μ L に管理します。コントロールとして生理食塩水と同じボリュームを使用します。
   注: この実験で使用されるシリンジが 1 mL インスリン注射器です。他の理由により最初の 2 日以内に死亡した母親によって与えられたいない感染したマウスでは、分析に含まれていません。
5. すべての新生児マウスを密接に観察し、毎日それらの重量を量る。通常、RRV の接種後六日目、耳と裸の皮膚に黄疸が表示されます便粘土色になり毛皮になります油性、BA モデルの確立を示唆これらの症状を確認します。
   注: BA は、H & E と免疫組織化学を示すと肝組織のセクション検査で確認できます。BA マウスは AgNP 治療のため準備ができているし。
   注意: 提示されたプロトコルは、現代的な動物と人間の RV 株、バイオ セーフティ レベル 2 (BSL-2) 条件下で処理する必要があります使用します。

2. 銀のナノ粒子合成

1. 準備し、前述の^12,20AgNPs を特徴付けます。
   注: 準備と、AgNPs の特性の詳細は香港大学^12,20化学科の c. m. チェ チームが出版物に記載されています。ソリューションの最終濃度 1 mM であった。AgNPs の平均の直径は 10 nm (5、15 に至るまで nm)、電子顕微鏡による確認します。

3. 銀ナノ粒子コラーゲン混合物の調製

注: AgNP コラーゲン混合物を準備し、前述の²¹ 4 ° C で格納される特徴すべての手順は、氷で実行する必要があります。

1. まず、コラーゲンの準備のための 490 μ L を追加 I 型コラーゲン (4 mg/mL) 1.5 mL チューブに、氷の上に置きます。
2. コラーゲンにリン酸緩衝食塩水 (PBS, 10 x) の 100 μ L を追加し、ピペットとミックスします。
   1. 10 x PBS バッファーの 1 L を準備するには、結合 80 g の NaCl、KCl の 2 g および Na₂HPO₄^.の 35.8 g12 H₂O 瀬₂PO₄とストア室温でバッファーの 2.4 g に。
3. その後、上記の解決策に水酸化ナトリウム (0.2 M) の 10 μ L を追加します。
   1. 0.2 M NaOH を準備するには、蒸留水 1 L に水酸化ナトリウム粉末 8 g を追加します。
4. 最後に、コラーゲンを AgNPs (1 mM) の 400 μ L を追加し、ピペットでそれらをミックスします。
   注: も混合の最後、AgNPs を追加します。4 ° C で保存する AgNP コラーゲン混合物それ以外の場合、それは簡単に室温で固化します。

4. マウス注入法

1. 黄疸の出現の後 AgNP コラーゲン混合物の 50 μ L の i. p. 注入で RRV 群で感染した新生児マウスを管理します。第 2 注入 3 d 後を実行します。
   注: コントロール RRV (感染制御) グループのマウスは、生理食塩水と同じボリュームを与えられているし、正常対照群のマウスは、任意の治療を与えられていません。
2. 注射の初めに、右太腿の上斜めリング指でマウスの足を押すし、15 ° の角度 (図 1) でゆっくりと針を紹介します。約 0.5 cm (図 2)、肝臓の下側の面に達したら、注入 AgNP コラーゲン混合物;その後、ゆっくりと針を撤回します。
   注: する、注射器に空気を導入しないように注意し、新生仔マウスが殺されるかもしれない。新生仔マウスの左腹部、胃、脾臓と胃は牛乳でいっぱい。こちら側から注入が管理されている場合針をどちらか胃の腹腔内や出血を引き起こす、脾臓に流れ込むミルクを原因と簡単に入力。
   注意: 任意の指のけがを防ぐため、針のキャップを交換し、針を削除、シャープス コンテナーに配置を確認するため針に注意してください。
3. すべての注射後 10 分 AgNP コラーゲン混合ゲルと母が注射部位をなめるを防ぐためにできるようにケージのマウスを維持します。その後、マウスをケージに戻ります。
4. 観察し、黄疸や体重、生存率など毎日、すべてのマウスの物理的な外観を記録します。

5. 血液検体の採取

注: 約 120 μ L の血液サンプルは、中心に針を挿入することによって収集されます。遠心分離後、血清は収集 (約 70 μ L) 肝機能をテストするためです。血の収集方法は次のとおりです。

1. (ある AgNP 治療後 3 日) RRV 接種後第 9 そして第 12 日目のマウスを麻酔使用 0.5 2.5% セボフルラン。
2. マウスの手足を固定し、75% のアルコールで下腹部を滅菌します。
3. ハサミでは; に、剣にマウスを皮膚、筋肉や正中線に沿って腹膜切断して横隔膜を公開します。滅菌綿棒を使って横隔膜筋を完全に公開する消化管を外します。
4. (1 mL アンロード インスリン注射器) の心臓の左心室に針を挿入し、最大血液量を取得するシリンジのプランジャーをゆっくり引き戻します。その後、血を 1.5 mL チューブに転送します。
5. 室温で 30 分放置し、400 × gで 5 分間遠心管を許可します。転送ピペットを使用すると、収集し、さらに使用するため血清を保存します。
   注: は、欠陥は、簡単に気胸、死、および血液凝固、血サンプルのコレクションを防ぐにつながるダイヤフラムとして、横隔膜の損傷を防ぐ。

6. 生化学的パラメーターの検出

1. 生化学的パラメーターの検出のステップ 5.5 で収集した血清を使用します。
2. 自動生化学分析装置を使用して、次の生化学的パラメーターを検出: アラニントランスアミナーゼ (ALT)、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ (AST)、アルカリ性ホスファターゼ (ALP)、総蛋白 (TP)、アルブミン (ALB)、グロブリン (グロ)、総ビリルビン (TBIL)(DBIL) 直接ビリルビン、間接ビリルビン (IBIL)、および総胆汁酸 (TBA)。

7. 肝外胆道胆管の開存性を観察するには

注: は、解剖顕微鏡の下で全体のプロセスを実行します。

1. 肝臓、胆嚢、肝外胆管綿棒で完全に公開します。
2. 観察して肝臓と胆管解剖顕微鏡で外観の写真します。
3. 眼科用鉗子を使用して、胆嚢の底部を軽く押さえします。
4. メチレン ブルー溶液 (0.05 wt.% H₂O を 1 mL 注射器をロードします。胆嚢空洞に注射針をゆっくりと挿入します。眼科ピンセットで針を把握し、メチレン ブルーの 10-20 μ L をゆっくりと注入します。
5. 青い色は空腸に肝外胆管に通過するかどうかを顕微鏡下で観察し、写真を撮る。

8. ヘマトキシリン ・ エオシン染色の新鮮な肝臓サンプル集

1. 新鮮なマウス肝組織一晩で修正 10% ホルマリン。
2. パラフィンで固定肝組織を埋め込むし、それらをセクションします。
3. セクションを dewax、エタノール シリーズ (各 5 分間蒸留水で 100%、95%、80%、70% エタノール) などで水分補給をして、組織切片ヘマトキシリンで染色、1% 塩酸アルコール分化にそれらを服従、最後に、ステイン、エオシンのセクション。
4. 最後に、40 X 顕微鏡下で肝臓の病理組織像を観察します。

9. ヘマトキシリンとエオシン染色組織切片の染色

1. 脱脂とセクションを復元することの後トリス EDTA バッファー (10 mM Tris ベース、1 mM EDTA 溶液; pH 9.0) でセクションを水没、95 ° C で 10 分間電子レンジで加熱して抗原検索を実行します。
2. 3% 過酸化水素溶液に 10 分間ティッシュ セクションを公開することによって、内因性ペルオキシダーゼを削除します。
3. 5% のヤギ血清、非特異的結合をブロックするとセクションを扱います。
4. 一次抗体ウサギ マウス NKG2D 追加 (1: 100)、セクションに、4 ° C でそれらを一晩インキュベート
5. セクションに適切な二次抗体 (高分子の HRP 標識抗家兎システム) 室温で 30 分間インキュベートします。
6. 3, 3'-ジアミノベンジジン (軽打) として発色を用いた免疫組織染色を視覚化します。
7. 40 倍の顕微鏡の下でセクションを観察、画像を取得、必要に応じてそれらを分析に進みます。

10. フローサイトメトリーによる解析

1. 優しく肝組織をミンチ、70 μ m の細胞ストレーナを通過、それを遠心分離機 270 x gで 4 分の 4 ° C で 2 倍。
2. RPMI 1640 培地で細胞ペレットを再懸濁します、モノクローナル抗体を用いた 2 色蛍光抗体法によって分析します。
3. フルオレセイン共役イソチオ シアン酸とフィコエ リスリン アンチ-NKp46 (NK リンパ球; 1:1, 000) を含む、特定の細胞表面マーカーを使用して細胞の表現型解析を実行し、抗 cd4 抗体 (T 細胞サブタイプ; 1:1, 000)、流れの cytometer でデータを分析流れ cytometry データ解析ソフトウェア。
4. 前方/側面分散、アイソタイプ コントロールを任意の背景の蛍光性を考慮して個々 の抗体の蛍光信号に基づき二次分析対象データによるとゲートによるとセル人口を選択します。

結果

確立された BA マウス モデルに基づいて、感染した新生児マウス投与準備 AgNP コラーゲン混合物 2 の i. p. 注入後黄疸を示す x。マウスの生存率は毎日、チェック、肝機能検査、肝臓の病理とフローサイトメトリーを行った。無処理 BA マウスと比較して、AgNP 投与マウスは減らされた黄疸を示し、通常の体重 (図 3) を維持します。ビリルビン代謝?...

ディスカッション

AgNPs 展示強力な広域スペクトル抗菌特性と強力な透磁率²²;さらに、抗菌医薬品²³の範囲を生成する使用されます。しかし、AgNPs では、臓器内に蓄積し、毒性^24,25につながる可能性がありますこの永続性をクリアに長い時間がかかります。以前研究ラット実験で単回静脈内投与後の急性毒性および遺伝毒性 AgNPs の検...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
BALB/c mouse	Guangdong Medical Experimental Animal Center	SYXK2017-0174	Animal experiment
Rhesus rotavirus (RRV)	ATCC	ATCC VR-1739	Establish biliary atresia mouse model
MA104 cells	ATCC	ATCC CRL-2378.1	For laboratory use only
DMEM	Thermo Fisher	10569010	Mammalian Cell Culture
Fetal Bovine Serum	Thermo Fisher	10099141	Mammalian Cell Culture
collagen Type I	CORNING	354236	For research use only
PBS buffer	OXOID	BR0014G	For washing
NaOH	Sigma	1310-73-2	Adjust the PH value
AgNP			Antibacterial Note: The AgNps was a gift from Prof CM Che. in the Department of Chemistry, the University of Hong Kong.
Insulin syringe with integrated needle	BD	9161635S	For medical use
15 mL Centrifuge Tube	Corning	430791	For laboratory use only
1.5 mL Microcentrifuge Tube	GEB	CT0200-B-N	For laboratory use only
Microscope	Nikon	ECLIPSE-Ci	For laboratory use
Dissecting/Intravital microscope	Nikon	SMZ 1000	For laboratory use
anti-Mouse NKp46 FITC	eBioscience	11-3351	For research use only
anti-Mouse CD4 PE-Cyanine5	eBioscience	15-0041	For research use only
Monoclonal Mouse Anti-Human CD4	DAKO	20001673	For research use only
anti-NKG2D	RD	MAB1547	For research use only
BD FACSCanto Flow Cytometer	BD Biosciences	FACS Canto Plus	For laboratory use only