Серебряных наночастиц метод для улучшения Билиарной атрезией синдром у мышей

Резюме

Эта статья подробно описывает метод, основанный на наночастицы серебра для улучшения Билиарной атрезией синдром в экспериментальной Билиарной атрезией мыши модели. Четкое понимание процесса подготовки реагента и технику инъекций неонатальной мышь поможет ознакомить исследователей с метод, используемый в неонатальной мыши модель исследования.

Аннотация

Билиарной атрезией (BA) — это серьезный тип холангит с высокой смертности детей, которые до сих пор не полностью понимается этиологии. Вирусные инфекции могут быть одной из возможных причин. Типичная модель животных, используются для изучения Ба устанавливается путем прививки новорожденным мышь с ротавирусом резус. Было показано, что наночастицы серебра оказывают антибактериальное и противовирусное эффекты; в этом исследовании оценивается их функции в модели мыши ба. В настоящее время в ба экспериментов на животных, методы, используемые для улучшения симптомов Ба мышей, обычно симптоматическое лечение через продовольствия или других наркотиков. Целью данного исследования является продемонстрировать новый метод для улучшения Ба синдром у мышей, внутрибрюшинного введения наночастиц серебра и предоставить подробные методы для подготовки формулировка гель серебряных наночастиц. Этот метод прост и широко применимые и может использоваться для исследования механизма Ба, а также клиническое лечение. На основе Ба мыши модели, когда мышей выставки желтухи, подготовленный серебряных наночастиц Гель вводится внутрибрюшинно на поверхность Нижняя печени. Наблюдается состояние выживания, и изучаются биохимических показателей и гистопатология печени. Этот метод позволяет более интуитивное понимание создание модели Ба и Роман лечения ба.

Введение

Ба является формой холестаза, характеризуется стойким желтухи и обладает высокой смертности в отсутствие трансплантации печени. Вирусные инфекции тесно связаны с патогенеза ба. Ротавирусной инфекции цитомегаловирус и реовирус предлагались как патогены в ба^1,2,3. В неонатальный период ответ незрелой иммунной системы к вирусной инфекции приводит к иммунной регуляции против дополнительных - и внутрипеченочных желчных протоков, ведущих к апоптозу желчных эпителиальных клеток, воспалительных клеток инфильтрата в портале Площадь, внутрипеченочных и внепеченочных желчных протоков препятствие и, наконец, фиброз печени^4,5,6.

Часто используемых животных модель BA исследований включает прививки новорожденным мышь с резус Ротавирусная (RRV). Мышь обычно развивается желтуха после 5-6 дней, показывая низкой массой тела и acholic стул. Роль иммунной реакции в процессе заболевания имеет решающее значение, особенно для естественных убийца клеток (НК); истощение этих клеток с антитела анти NKG2D значительно снижает Ба индуцированного повреждения⁷. Кроме того, другие клетки, включая CD4⁺ T-клеток, CD8⁺ T клетки, дендритные клетки и регулирования Т-клеток, все было показано играть роль в болезни^8,9,10,11. Все данные свидетельствуют о незаменимый характер иммунной системы в ходе ба.

Наночастиц серебра (AgNPs) были продемонстрированы иметь благотворное влияние против некоторых инфекционных заболеваний, в том числе¹² бактериальных инфекций и вирусных инфекций^13,14,15. Однако кроме дерматологических использования, несколько исследований использовали AgNPs в клинического лечения, главным образом из-за их потенциальной токсичности. В экспериментов на животных исследователи изучили обычно эффективность AgNPs осуществляется через устные¹⁶ или¹⁷внутривенные методы. Однако другие исследователи изучили эффективность AgNPs осуществляется через инъекцию внутрибрюшинного (и.п.) у новорожденных мышей экспериментов, что простой и быстрый метод приводит к более прямое воздействие на печени и желчных протоков при снижение токсичности для других систем, таких как иммунной системы. AgNPs было показано, влияют на активность клеток NK¹⁸; Таким образом мы протестировали терапевтического эффекта AgNPs осуществляется через и.п. инъекции в мышиной модели ба.

протокол

Все животные экспериментальные протоколы были одобрены институциональный уход животных и использование Комитета Sun Yat-Sen университета лабораторных животных центр (#IACUC-DB-16-0602).

1. Создание модели мыши Билиарной атрезией

1. Поддерживать беременных мышей BALB/c в определенной среде свободной от возбудителя в темноте/свет цикла 12 ч при 25 ° C, с доступом к газобетона Чоу ad libitum.
2. Подготовить RRV штамм MMU 18006, усиливают вируса в клетках MA104 и измерить вирусного титры налета пробирного¹⁹.
   Примечание: MA104 клетки являются культивировали в среде Дульбекко изменение орла (DMEM) с 10% плода бычьим сывороточным (ФБС) в инкубаторе с атмосферой увлажненные, содержащих 5% CO₂. Усиление действия кратко изложены ниже.
   1. Заразить клетки MA104 (1,5 х 10⁷) в колбе культуры² 150 см с активированной трипсина RRV [1,5 х 10⁶ металлическ формируя единиц (ОРП)] в 30 мл сыворотки свободной среды. Инкубируйте 3 дней в увлажненные инкубатора при 37 ° C с 5% CO₂инфицированных клеток.
   2. Лизировать инфицированных клеток в культуре колбу на трех циклов замораживания оттаивания, с 20 минут в морозильник-80 ° C для каждого заморозить фазы и, затем, отогрева клетки обратно до комнатной температуры; клетки связанных вирус частиц выпустит в надосадке. Затем собирать и передавать lysate клетки и культуры супернатант в коническую пробирку 15 мл.
   3. Удалите большие сотовой мусора от lysate центрифугированием низкой скорости (300 x g при 4 ° C на 3 мин). Затем перевести супернатанта, содержащий вирус (примерно 6 мл) на новой 15 мл Конические трубки для экспериментов на животных.
      Примечание: RRV готов быть titered, aliquoted и храниться или использоваться для дополнительных раундов амплификации. Долгосрочное воздействие комнатной температуры сократит возможности вирусной инфекции; вирус следует поместить на льду и хранятся при температуре-80 ° C или в жидком азоте.
3. Нагрузки, RRV в малообъемной (1 мл) инсулин шприц с иглой для инъекций неонатальной мыши 29 G.
   Примечание: Толстые иглы объемные шприцы легко привести к утечки наркотиков.
4. В течение 24 часов рождения применять для каждого новорожденного 20 мкл 1.2 x 10⁵ RRV ОРП/мл через и.п. маршрут; Используйте такой же объем физиологического раствора в качестве элемента управления.
   Примечание: Шприц, используемые в этом эксперименте является шприц 1мл инсулин. Зараженных мышей, которые не получали их матерей умерли в течение первых 2 дней по другим причинам не были включены в анализ.
5. Наблюдать все новорожденных мышей и взвесить их ежедневно. Как правило на шестой день после прививки RRV, желтуха появляется на уши и голой кожи, стул становится глинистого цвета, и мех становится жирной, предлагая создание модели Ба; Проверьте эти симптомы.
   Примечание: Ба может быть подтверждена раздел экспертиза ткани печени с H & E и иммуногистохимическое заявив. Мышей ба затем готовы для лечения ССПС.
   Предупреждение: Представил протокол предназначен для использования с современными животных и человека RV штаммов, которые должны быть обработаны в условиях 2-го уровня биобезопасности (BSL-2).

2. Серебряный синтеза наночастиц

1. Подготовить и характеризуют AgNPs как описано в^12,20.
   Примечание: Сведения о подготовке и характеризующих AgNPs были описаны в публикациях C. м. Че команда кафедры химии, Университет Гонконга^12,20. Конечная концентрация раствора составила 1 мм. Средний диаметр AgNPs было 10 Нм (диапазоне 5-15 Нм) и подтверждена электронной микроскопии.

3. Подготовка смеси серебряных наночастиц коллагена

Примечание: ССПС коллаген смесь подготавливается и характеризуется как описано ранее²¹ и хранить при 4 ° C. Все процедуры должны выполняться на льду.

1. Во-первых, для подготовки коллагена, добавить 490 мкл типа коллагена (4 мг/мл) в 1,5 мл трубку и поместите его на льду.
2. Добавить 100 мкл фосфат амортизированное saline (PBS, 10 x) коллагена и смешайте его с пипеткой.
   1. Для приготовления 1 Л 10 x PBS буфера, объедините 80 г NaCl, 2 г KCl и 35.8 g Na₂HPO₄^. 12H₂O 2.4 g KH₂PO₄ и store буфера при комнатной температуре.
3. Затем добавьте 10 мкл NaOH (0,2 М) выше решение.
   1. Подготовить 0,2 М NaOH, добавьте 8 г NaOH порошка в 1 Л дистиллированной воды.
4. Наконец 400 мкл AgNPs (1 мм) для коллагена и смешайте их с пипеткой.
   Примечание: Добавьте AgNPs последний даже смешивания. ССПС коллаген смесь следует хранить при 4 ° C; в противном случае он легко затвердевает при комнатной температуре.

4. мыши инъекционный метод

1. Администрировать инфицированных новорожденных мышей в обработанных RRV группе и.п. инъекции 50 мкл смеси коллагена ССПС после появления желтухи; выполните второй инъекции 3 d позднее.
   Примечание: Мышей в контрольной группе RRV (зараженных управления) даны же объем физиологического раствора, и мышей в обычной контрольной группе не имеют какого-либо лечения.
2. В начале инъекции, косо пресс мыши ногу с безымянным пальцем над правое бедро и ввести иглу медленно под углом 15° (рис. 1). По достижении поверхности нижнего края печени (рис. 2), около 0,5 см, придать ССПС коллаген смесь; затем медленно снять иглу.
   Примечание: Будьте осторожны, чтобы не ввести любой воздух в шприц как, а затем, неонатальной мыши могут быть убиты. Новорожденных мышей желудка и селезенки, в левой части живота, в желудок полон молока. Если инъекции администрируется с этой стороны, игла может легко ввести либо желудка, вызывая молоко поступать в брюшной полости, или селезенки, вызывая кровотечение.
   ВНИМАНИЕ: Обратите внимание на иглы, чтобы предотвратить любой палец травмы и не забудьте заменить колпачок иглы, удалите иглу и поместите его в Шарпс контейнер.
3. После инъекции Держите мышей из их клетки для 10 минут позволить ССПС коллаген смесь гель и предотвратить мать лизать укола. Затем вернуть их клетки мышей.
4. Наблюдать и записывать физическое выступлений всех мышей ежедневно, включая желтухи и вес тела, а также выживаемости.

5. кровь образец коллекции

Примечание: Крови приблизительно 120 мкл образцов, вставляя иглу в сердце. После центрифугирования сыворотка является сбор (около 70 мкл) для тестирования функции печени. Метод сбора крови является следующим.

1. Анестезировать мышей на девятой и 12 день после прививки RRV (который через 3 дня после лечения ССПС) с помощью 0,5-2,5% севофлюран.
2. Иммобилизации конечности мыши и стерилизовать верхний и нижний живот с 75% алкоголя.
3. Разоблачить диафрагмы путем разрезания мыши кожи, мышц и брюшины вдоль средней линии мечевидный ножницами; для удаления желудочно-кишечного тракта подвергать полностью Мышца диафрагмы используйте стерильным ватным тампоном.
4. Вставьте иглу (с 1 мл шприц выгружен инсулина) левого желудочка сердца и медленно потяните поршень шприца, чтобы получить объем максимальной крови. Затем перенесите 1,5 мл крови.
5. Разрешить трубки стоять 30 мин при комнатной температуре и центрифуги для 5 мин на 400 x g. Затем с помощью пипетки передачи, собрать и сохранить сыворотки для дальнейшего использования.
   Примечание: Во избежание повреждения диафрагмы, как диафрагма, что дефекты легко привести к пневмоторакса, смерти и свертываемость крови, тем самым предотвращая проб крови.

6. биохимических параметров обнаружения

1. Использование сыворотки, собранных в шаге 5.5 для обнаружения биохимических параметров.
2. Используйте автоматизированный биохимический анализатор для обнаружения следующих биохимических параметров: аланинаминотрансферазы (АЛТ), аспартатаминотрансферазы (АСТ), щелочной фосфатазы (ALP), общего белка (ТП), альбумин (ALB), глобулина (GLO), билирубин (TBIL), прямой билирубин (DBIL), косвенные билирубина (ИБИЛЬ) и общая желчных кислот (TBA).

7. внепеченочных холангиографии соблюдать проходимость внепеченочных желчных протоков

Примечание: Выполните весь процесс под микроскопом рассечение.

1. Полностью разоблачить, печени, желчного пузыря и внепеченочных желчных протоков с ватным тампоном.
2. Наблюдать и фотографировать внешний вид печени и желчных путей под микроскопом рассечение.
3. Использование офтальмологический щипцами осторожно провести дно желчного пузыря.
4. Загрузите 1 мл шприц с раствором метиленового синего (0,05 wt.% в H₂O). Медленно Вставьте иглу шприца в полости желчного пузыря; Затем возьмите иглы офтальмологический пинцетом и медленно влить 10 – 20 мкл рабочего раствора метиленового синего.
5. Наблюдать под микроскопом ли синий цвет проходит через гепатикохоледоха тощей кишки и сфотографировать.

8. сбор образцов свежей печени для гематоксилином и эозином

1. Исправьте свежие мыши печени тканей на ночь в формалина 10%.
2. Затем внедрить фиксированных тканей печени в парафин и раздел их.
3. DEWAX разделы, увлажняет их с серии этанола (например, 100%, 95%, 80% и 70% этанола в дистиллированной воде, каждый на 5 мин), выведение разделов ткани с применением окрасок гематоксилин, подвергать их дифференциации алкоголя соляной кислоты 1% и наконец, пятно разделы с эозином.
4. Наконец наблюдать гистопатология печени под микроскопом 40 X.

9. иммуногистохимическое окрашивание гематоксилином и эозином окрашенных тканей секций

1. После депарафинизации и станавливающим разделы, выполните извлечение антигена, погружаясь в разделах в буфер Tris-ЭДТА (Tris база 10 мм, 1 мм ЭДТА решение; рН 9,0) и Отопление их в микроволновую печь на 10 мин при 95 ° C.
2. Удаление эндогенной пероксидазы, подвергая разделов ткани за 10 мин до 3% раствором перекиси водорода.
3. Лечить разделы с 5% козьего сыворотки, чтобы блокировать неспецифического связывания.
4. Добавление первичного антитела кролика мышь NKG2D (1: 100) в разделы и инкубировать их на ночь при 4 ° C.
5. Инкубируйте секции с соответствующим вторичные антитела (HRP-меченых полимерный анти кролик системы) за 30 мин при комнатной температуре.
6. Визуализируйте иммуногистохимическое окрашивание с помощью 3, 3'-диаминобензидин (DAB) как хромогена.
7. Соблюдать разделы под микроскопом 40 X, получить изображения и приступить к анализировать их при необходимости.

10. анализ гранулярных

1. Аккуратно фарш ткани печени, передать его через стрейнер ячейки 70 мкм и центрифуги это 2 x 270 x g при 4 ° C на 4 мин.
2. Ресуспензируйте Пелле клеток в среде RPMI 1640 и проанализировать его на два цвета иммунофлюоресценции с помощью моноклональных антител.
3. Выполнять сотовой фенотипа, с использованием определенных маркеров клетк поверхности, в том числе флуоресцеин проспряганное Изотиоцианаты и фикоэритрин анти NKp46 (лимфоцитов НК; 1:1, 000) и анти CD4 (Т-клеток подтип; 1:1, 000), с проточный цитометр и анализ данных с программное обеспечение анализа данных потока цитометрии.
4. Выберите клеточных популяций согласно вперед/сторона разброс, ворота согласно изотипа контроля для учета флуоресценции любой фон и данных, подлежащих вторичный анализ, основанный на флуоресценции сигналы от отдельных антител.

Результаты

На основе установленных Ба мыши модели, инфицированных новорожденных мышей вводили инъекции и.п. подготовленные смеси коллагена ССПС 2 x после экспонирования желтухи. Мыши выживания был проверен на ежедневно, и были проведены испытания функции печени, патологии печен?...

Обсуждение

AgNPs обладают мощными антибактериальными свойствами широкого спектра и сильный проницаемость²²; Кроме того они используются для производства целого ряда антибактериальных лекарственных препаратов²³. Однако AgNPs может занять много времени, чтобы очистить после ?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
BALB/c mouse	Guangdong Medical Experimental Animal Center	SYXK2017-0174	Animal experiment
Rhesus rotavirus (RRV)	ATCC	ATCC VR-1739	Establish biliary atresia mouse model
MA104 cells	ATCC	ATCC CRL-2378.1	For laboratory use only
DMEM	Thermo Fisher	10569010	Mammalian Cell Culture
Fetal Bovine Serum	Thermo Fisher	10099141	Mammalian Cell Culture
collagen Type I	CORNING	354236	For research use only
PBS buffer	OXOID	BR0014G	For washing
NaOH	Sigma	1310-73-2	Adjust the PH value
AgNP			Antibacterial Note: The AgNps was a gift from Prof CM Che. in the Department of Chemistry, the University of Hong Kong.
Insulin syringe with integrated needle	BD	9161635S	For medical use
15 mL Centrifuge Tube	Corning	430791	For laboratory use only
1.5 mL Microcentrifuge Tube	GEB	CT0200-B-N	For laboratory use only
Microscope	Nikon	ECLIPSE-Ci	For laboratory use
Dissecting/Intravital microscope	Nikon	SMZ 1000	For laboratory use
anti-Mouse NKp46 FITC	eBioscience	11-3351	For research use only
anti-Mouse CD4 PE-Cyanine5	eBioscience	15-0041	For research use only
Monoclonal Mouse Anti-Human CD4	DAKO	20001673	For research use only
anti-NKG2D	RD	MAB1547	For research use only
BD FACSCanto Flow Cytometer	BD Biosciences	FACS Canto Plus	For laboratory use only