JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

نقدم هنا، بروتوكولا لعزل خلايا الكبد الماوس الأساسي صحية ووظيفية. وقدمت إرشادات للكشف عن البروتين الوليدة كبدي من الركازة التوسيم غير المشعة للمساعدة في فهم الآليات الأساسية تخليق البروتين في سياق التوازن الطاقة الأيض في الكبد.

Abstract

خلايا الكبد خلايا الكبد متني وممارسة وظائف ايضية متعددة، بما في ذلك تجميع وإفراز البروتينات ضروري للتوازن الطاقة الشاملة. خلايا الكبد الأولية المعزولة من الكبد مورين تشكل أداة بيولوجية قيمة لفهم الخصائص الوظيفية أو التغييرات التي تحدث في الكبد. هنا يمكننا وصف أسلوب للعزلة والثقافة من خلايا الكبد الماوس الأساسي قبل تنفيذ أسلوب نضح كولاجيناز خطوتين ومناقشة الاستفادة منها للتحقيق في استقلاب البروتين. هو perfused الكبد من الماوس الكبار التتابع مع حمض tetraacetic جليكول-مكررا (اجتا) وكولاجيناز، متبوعاً بعزل خلايا الكبد مع كثافة المخزن المؤقت التدرج. خلايا الكبد معزولة هذه قابلة للتطبيق على ألواح الثقافة والحفاظ على معظم الخصائص هبت لخلايا الكبد. يمكن استخدام خلايا الكبد هذه التقييمات استقلاب البروتين، بما في ذلك البروتين الوليدة مع الكواشف غير مشعة. ونحن تبين أن خلايا الكبد معزولة يتم التحكم فيها بسهولة وتشمل استقرار أعلى جودة وحجم تخليق البروتين مرتبطة باستقلاب الطاقة عن طريق استخدام رد فعل ربط الكيماوي انتقائية مع بروتين تيتراميثيلرهوداميني (طمره) طريقة الكشف والتحليلات الغربية النشاف. ولذلك، هذا الأسلوب قيمة للتحقيق في تخليق البروتين الوليدة الكبدية مرتبطة بالتوازن الطاقة. يحدد البروتوكول التالي المواد والأساليب لعزل خلايا الكبد الماوس الأساسية عالية الجودة، والكشف عن تخليق البروتين الوليدة.

Introduction

البروتين عنصر هام في تغذية، وحوالي 50% الوزن الجاف لجسم الإنسان يتكون من البروتينات التي لها العديد من الصفات البيولوجية ووظائف1. ونتيجة لذلك، تخليق البروتين أحد الأحداث التي تستهلك معظم الطاقة وتغيير في التمثيل الغذائي البروتين يرتبط جداً مع تطور الأمراض، بما في ذلك الأمراض الأيضية2،،من34. في الكبد، وحسابات تخليق البروتين الحيوي لحوالي 20-30 في المائة من الاستهلاك الإجمالي للطاقة5،6. وباﻹضافة إلى ذلك، وظيفة البروتينات ليس فقط سلبية أو بناء كتل من الكبد، ولكن عوامل نشطة أيضا التوسط في إشارة إينتراسيلولارلي أو اكستراسيلولارلي لتنظيم الأيض الجهازية7. على سبيل المثال، انخفاض مستويات الزلال، الذي يتم تصنيعه ويفرزها الكبد والبروتين الأكثر وفرة في بلازما8، يزيد من خطر النوع 2 السكري التنمية9،10، 11، في حين أن أعلى تركيز ألبومين المصل الحماية ضد تطوير المتلازمة الأيضية12. وعلاوة على ذلك، تشعر بانزعاج أو اضطراب البروتينات الكبدية الافرازية أو الغشاء زمنياً، والتي تعدل التوازن نسبة الكولسترول في الدم، بما في ذلك البروتينات الدهنية، ولدلر، و LRP1، يمكن أن يؤدي إلى تطوير مقاومة الأنسولين، والدهون، أو تصلب الشرايين 13-ولذلك، تحديد الآليات الفيزيولوجية المرضية الجزيئية التي تشارك في اضطرابات التمثيل الغذائي البروتين في الكبد ومضاعفاته الأيضية المرتبطة بها قد تكون مفيدة لاكتشاف رواية الدوائية نهج تؤخر ظهور أو علاج الأمراض الأيضية مثل مقاومة الأنسولين وداء السكري والكبد الدهني غير الكحولية.

تخليق البروتين محكم مرتبط بمركز الطاقة الخلوية (مثلاً، تشكيل واحد ببتيد السندات خلال الخطوة استطالة تخليق البروتين يتطلب سندات phosphodiester 414) وينظم مسارات الجزيئية التي بمعنى جملة بين الخلايا وداخلها توافر المغذيات15،16. أمبير-تنشيط بروتين كيناز (أمبك) هو واحد من أجهزة استشعار الطاقة داخل الخلايا التي تحافظ على التوازن الطاقة17. حالما يتم تنشيط أمبك عندما تصبح أقل مستويات الطاقة الخلوية، تعمل أمبك ولها ركائز المستهدفة لتحفيز مسارات تقويضي وتمنع الابتنائية العمليات بما في ذلك البروتين التوليف18،19. تنظيم تخليق البروتين هو توسط الفسفرة متعددة العوامل الترجمة والبروتينات ريبوسومال20. من المذكرة، الهدف الثدييات من ربمسن 1 معقدة (mTORC1)، محرك رئيسي تخليق البروتين، أحد الأهداف الرئيسية من أمبك21. تنشيط المسار mTORC1 يعزز نمو الخلايا وانتشارها بالبروتين تنشيط الترجمة وأوتوفاجي،من2021. ولذلك، فمن المنطقي أن تنشيط أمبك يمكن أن تمنع mTORC1 بوساطة البروتين التوليف22. وفي الواقع، تفعيل AMPK يصد ومباشرة فوسفوريلاتيس mTORC1 على بقايا ثريونين 2446 (Thr2446) مما أدى إلى المنظمة23 وقمع من البروتين الحيوي24. وعلاوة على ذلك، أمبك يمكن أن تمنع غير مباشر وظيفة mTORC1 الفسفرة والتنشيط من التصلب درني المعقدة 2 (TSC2)25 وهي الجهة المنظمة للمراحل الأولى من تتالي الإشارات mTORC1. وباختصار، التقلبات من هذه المسارات في الكبد وكثيراً ما يرتبط بتطور الأمراض الأيضية ولذلك هناك حاجة ماسة لإنشاء أدوات تجريبية فعالة التحقيق في دور هذه المسارات في تنظيم الطاقة و استقلاب البروتين في خلايا الكبد.

وهناك تشابه أقوى بين الخصائص الوظيفية لخلايا الكبد الأولية المعزولة و في فيفو خلايا الكبد من27،،من26 في المختبر المستمدة من الكبد الخلية خطوط28. وقد ثبت أن خلايا الكبد البشرية الأولية مشاركة 77% التشابه مع خزعات الكبد، بينما تعرض الخلايا HepG2، وهي خلايا سرطانية كبدية المتمايزة جيدا وتستخدم على نطاق واسع للتحقيق في وظائف الكبد، أقل من 48% في سياق ملامح التعبير الجيني29. ولذلك، استعمال خلايا الكبد الأولية، بدلاً من خلايا الثقافة مخلدة، له أهمية حيوية في التحقيق في وظيفة الكبد وعلم وظائف الأعضاء، وتتوفر العديد من البروتوكولات للعزلة والثقافة من خلايا الكبد الأولية خاصة من الفئران30،31. بينما خلايا الكبد في الفئران مفيدة مع عائد أعلى نسبيا من الخلايا، خلايا الكبد الماوس على إمكانيات أكبر في العديد من الجوانب العلمية بسبب توافر واسعة من الفئران المعدلة وراثيا. ومع ذلك، هناك العديد من التحديات التقنية في عزل خلايا صحية ووفيرة من الكبد الأولية من الفئران الخلوية والجزيئية-التقييمات المستندة إلى: أولاً، الإدراج القنية نتخلل في الكبد مع الكواشف المخزن المؤقت من الصعب جداً التعامل مع بسبب الوريد البابي الماوس صغيرة ورقيقة أو أدنى الوريد الأجوف؛ ثانيا، يمكن أن يسبب وقتاً أطول من تلاعب بالخلايا من خلال العزل الحد في الخلية الكمية والنوعية؛ أساليب الفصل الثالث، غير الانزيمية الميكانيكية يمكن أن تسفر عن أضرار جسيمة وإنتاج منخفضة عائد من خلايا الكبد الأولية المعزولة قابلة للتطبيق32،33. في الثمانينات، بدأ كولاجيناز نضح تقنية لعزل خلايا الكبد من الكبد من الحيوانات34. ويستند هذا الأسلوب على نضح كولاجيناز الكبد35،،من3637، ضخ الكبد مع الكالسيوم تشيلاتور حل38،39، الهضم الأنزيمي و الميكانيكية تفكك لحمه الكبد35. في الخطوة الأولى، هو perfused كبد ماوس مع المخزن مؤقت حرة كالسيوم [Ca2 +] يتضمن [Ca2 +] تشيلاتور (حمض tetraacetic الإيثيلنديامين، يدتا). في الخطوة الثانية، هو perfused في الكبد الماوس مع عازلة التي تحتوي على كولاجيناز يتحلل التفاعلات المصفوفة خارج الخلية الخلوية. خلافا للمخزن المؤقت المستخدم في خطوة واحدة، الوجود [Ca2 +] الأيونات في المخزن المؤقت للخطوة الثانية المطلوبة لنشاط كولاجيناز فعالة، قد الكبد هضمها بعد ذلك كذلك بلطف وميكانيكيا فصل استخدام الملقط بين كبسولة الكبد والأنسجة بارينتشيماتوس. أخيرا، تتم إزالة النسيج الضام بالتصفية والطرد المركزي اللاحقة يفصل بين خلايا الكبد سليمة من خلايا غير متني على حد سواء، وتتمثل غير الحية باستخدام الكثافة العازلة التدرج40،41 ،42. في هذه الدراسة، نعرض تقنية التروية كولاجيناز خطوتين معدلة لعزل خلايا الكبد الأولية من كبد ماوس للتحليل تخليق البروتين.

راديولابيلينج البروتينات يستخدم على نطاق واسع قياس مستويات التعبير، معدلات دوران الموظفين، وتحديد التوزيع البيولوجي ل البروتينات43 نظراً لحساسية عالية للكشف عن النشاط الإشعاعي44. ومع ذلك، يتطلب استخدام النظائر المشعة البحوث العالية التي تسيطر عليها ظروف وإجراءات45. تم تطوير طرق بديلة غير المشعة واكتسبت شعبية متزايدة. أن رد الفعل ربط الكيماوي انتقائية مع طريقة الكشف عن بروتين تيتراميثيلرهوداميني (طمره) هو واحد منهم ويقوم على رد الفعل الكيماوي الانتقائي بين أزيد وإضافة مجموعات46، التي يمكن أن تستخدم لتحليل الأحداث الخلوية مثل الكشف عن البروتين الوليدة والفئات الفرعية ل glycoproteins تعديل مع جماعة أزيد. تخليق البروتين الوليدة، يمكن أيضي دمج البروتينات L-أزيدوهوموالانيني (L-اها، هو تعديل لأزيد من الأحماض الأمينية) والكشف عنها بواسطة استخدام الأسلوب الكشف عن البروتين طمره47. باستخدام هذا الإنزيم في خلايا الكبد الماوس الأساسي، نحن تظهر أن معدل توليف البروتين الوليدة مشددة مرتبطة بتوافر ATP من الميتوكوندريا وتفعيل أمبك (الشكل 1).

وباختصار، الاستفادة من خلايا الكبد الماوس الأساسي أمر حاسم للتحقيق في استقلاب البروتين والطاقة والتحديد الكمي تخليق البروتين الوليدة قيمة لاكتساب رؤى في دور الفيزيولوجية من المسارات ذات الصلة بتنمية و علاج للأمراض التي تتمثل.

Protocol

ويتضمن هذا البروتوكول استخدام فئران المختبرات. رعاية الحيوان وإجراءات تجريبية أجريت وفقا للإجراءات التي أقرتها لجان الرعاية الحيوانية سينسيناتي الأطفال مستشفى المركز الطبي.

1-عزل خلايا الكبد الأساسي للماوس

  1. التحضير قبل عزلة
    1. إعداد 450 مل من 40% الكثافة المتدرجة المخزن المؤقت كما هو موضح في الجدول 1 وتبقى عند 4 درجة مئوية (15 مل/الماوس).
    2. إعداد 500 مل المتوسطة ويليامز كما هو موضح في الجدول 1 ، والحفاظ على 4 درجة مئوية.
    3. إعداد 500 مل دميم كما هو موضح في الجدول 1 ، والحفاظ على الجليد (30 مل في الماوس).
    4. إعداد 500 مل من المخزن المؤقت هبس (-) كما هو موضح في الجدول 1 والحفاظ على 42 درجة مئوية في حمام الماء (40 مل/الماوس).
    5. إعداد 500 مل حبس (+) المخزن المؤقت مع 0.3 ملغ/مل كولاجيناز نوع X كما هو موضح في الجدول 1 بحضانة 30 دقيقة في 42 درجة مئوية في حمام الماء (40 مل/الماوس).
    6. إعداد المضخة التروية بوضع أنابيب الإدارة (I.V) عن طريق الحقن الوريدي عبر دواسة القدم الإغلاق والتحقق من تدفق بيغ الحل دون فقاعات الهواء.
    7. الاحماء سخان أنبوب في 42درجة مئوية.
    8. يبرد الجهاز أجهزة الطرد المركزي إلى 4 درجات مئوية.
  2. التخدير والتروية
    1. تنظيف بمجالات العمل والمضخة.
    2. شطف من الأنبوب الرابع متصل بالمضخة عن طريق تشغيل 70% إيثانول جيدا لمدة 10 دقيقة.
    3. إزالة الإيثانول المتبقي من الأنبوب الرابع متصل بمضخة قبل الشطف مع دو كلياً لمدة 10 دقيقة.
    4. يمسح بالمقص والملقط مع الإيثانول 70%.
    5. ضع الماوس في وعاء من بلاستيك مع قاع فتحات الشباك وشاش غارقة في إيسوفلوراني 2 مل تحت الشبكة لتجنب الاتصال المباشر.
    6. تقويم عمق التخدير بدواسة ريفلكس (قرصه إصبع ثابتة).
    7. إزالة الماوس عندما وصلت إلى عمق التخدير المطلوب.
      ملاحظة: لا ينبغي وقت تحريض التخدير أكثر من 1 دقيقة.
    8. بناء مخروط الآنف باستخدام أنبوب مخروطي 15 مل مع لوحة غارقة في إيسوفلوراني 1 مل دفعت إلى نهاية الأنبوب.
    9. التحكم في عمق التخدير عن طريق تحريك مخروط الآنف أقرب أو بعيداً عن الخياشيم الماوس.
    10. ضع الماوس على منصة العمل مع الجانب البطني مواجها لأعلى.
    11. رش الإيثانول 70% فوق منطقة البطن للماوس وثم فتح تجويف البطن بإجراء شق كبير عرضية من باطن الجلد والغشاء البريتوني باستخدام مقص حاد وملقط مسنن.
    12. ثم، قم بقطع عمودية من طبقات البطن حتى تتعرض جميع أجهزة البطن تماما باستخدام مقص حاد وملقط مسنن.
    13. ويتعرض وضوح الخطوة الصغيرة والأمعاء الكبيرة تجاه الجانب الأيسر للماوس مع تلميح يعقم القطن حتى الكبد والوريد البابي، وأدنى الوريد الأجوف (IVC).
    14. إدراج قسطرة ز 24 في IVC فقط في التشعب بالوريد الكلوي الحق بعناية دون المصافحة بالأيدي لتجنب إصابة IVC والنزيف.
      ملاحظة: في حال حدوث نزيف في حين تقوم بإدراج القسطرة في IVC، ثم ينبغي محاولة إدراج القسطرة الجديدة في الوريد portal.
    15. إزالة الإبرة للقسطرة والتحكم في موضع قنية لتجنب الخروج IVC، ثم قم بتوصيل قنية ز 24 مع أنبوب التروية باستخدام الموصل.
      ملاحظة: تجنب وجود فقاعات الهواء قبل البدء في التروية.
    16. بدء نضح الكبد مع حبس الحارة (-) بمعدل تدفق 4 مل/دقيقة وقطع الوريد الطحال بسرعة استنزاف خارج الدم الداخلية باستخدام مقص.
      ملاحظة: إذا كان كانوليشن نجاح، سوف تبدأ الكبد لانش بسبب توزيع الدفق من المخزن المؤقت من IVC إلى الأوردة الكبدية. يتشكل الوريد البابي الاتحاد للاوردة المساريقي العلوي الطحال ومتفوقة؛ ولذلك، أنها آمنة تماما قطع الوريد الطحال حيث أنها كبيرة والبعيدة من الكبد.
    17. مواصلة التروية مع 35 مل من حبس الحارة (-).
      ملاحظة: سيصبح الكبد شاحب اللون إذا كان التروية الكافية، والماوس لا يزال على قيد الحياة تحت التخدير في هذه المرحلة.
  3. الهضم واستخراج
    1. نتخلل الكبد الماوس مع الحارة 35 مل من حبس (+) بما في ذلك كولاجيناز نوع X بمعدل تدفق 4 مل/دقيقة.
    2. كل بضع دقائق، المشبك على المنوال الطحال باستخدام الملقط ~ 10 s للسماح لوحدة التخزين بأكملها من حبس (+) منتشر في جميع الأجزاء التشريحية للكبد.
      ملاحظة: يبدأ الكبد الإنتفاخ بعد لقط على المنوال الطحال بسبب الازدحام المخزن المؤقت.
    3. صب 5 مل حبس الحارة المعدة (+) مع كولاجيناز نوع X في 100 مم طبق بيتري في نهاية عملية التروية.
    4. قطع الكبد بيرفوسيد من بقية أنحاء الجسم قبل إيقاف المضخة تجنب الدفق الدم في الكبد وإزالة المرارة بالملقط ثم يمسح الكبد بلطف بمنشفة ورقية لإزالة الدم.
    5. نقل الكبد إلى طبق بتري الذي يحتوي على 5 مل حبس الحارة المعدة (+) وإزالة الكبسولة الكبد برفق باستخدام الملقط مقلوب على التوالي.
      ملاحظة: الكبسولة الكبد هو طبقة رقيقة من الأنسجة الضامة التي تحيط بالكبد.
    6. تفريق نسيج متني بعناية باستخدام الملقط. إضافة 15 مل دميم الباردة إلى طبق بيتري.
      ملاحظة: المتوسط سوف تتحول غائم بسبب الخلايا متني إذا الكبد يهضم جيدا.
    7. هز الكبد ممزقة برفق للإفراج عن الخلايا متني المتبقية في المتوسط وإضافة آخر 15 مل دميم الباردة إلى طبق بتري للحصول على بقية الخلايا.
    8. نقل دميم في الكبد تم حله من خلال 100 ميكرومتر خلية مصفاة في أنبوب 50 مل مخروطية والاحتفاظ بالجليد.
  4. تنقية
    1. الطرد المركزي من تعليق خلية في ز 60 x دقيقة 2 في 4 درجات مئوية، بعناية وإزالة المادة طافية بالشفط بالتخلية وريسوسبيند بيليه في 10 مل دميم.
    2. أضف حراكه بيليه كطبقة رقيقة على رأس 40% الكثافة المتدرجة المخزن المؤقت، والطرد المركزي في 800 × ز لمدة 10 دقائق دون الفرامل في 4درجة مئوية.
    3. بعناية إزالة المادة طافية بما في ذلك الطبقة العليا (دميم) وطبقة وسطى (خلايا ميتة أو غير متني)، ولكن ليس الطبقة السفلي (بيليه: خلايا الكبد متني الأولية).
    4. ريسوسبيند الخلايا الأولية مع ه 2 – 3 مل وليام المتوسطة، ونقل إلى أنبوب 50 مل جديدة لتفادي تلوث خلايا ميتة على جدار الأنبوبة.
    5. إضافة المتوسط 7-8 مل وليام ه وتخلط بلطف والطرد المركزي في ز 800 x لمدة 1 دقيقة في 4 درجات مئوية.
    6. بعناية إزالة المادة طافية بالشفط بالتخلية وثم ريسوسبيند بيليه مرة أخرى مع 10 أو 20 أو 30 مل من المتوسطة وليام ه (وفقا لحجم بيليه).
    7. حساب عدد الخلايا باستخدام عداد الآلي خلية.
    8. البذور مع المتوسط وليام ه، والحفاظ اللوحة في حاضنة في 37درجة مئوية ح 2-3، ثم استبدال % with10 المتوسطة المتوسطة دميم FBS مع مكافحة المضادة لإزالة الخلايا ميتة أو فاتحة وبين عشية وضحاها الحضانة عند 37 درجة مئوية.
    9. وفي اليوم التالي الماوس الأساسي خلايا الكبد جاهزة للاستخدام التجريبي.

2-الكيماوي انتقائية ربط رد فعل المقايسة للكشف عن البروتين الوليدة

  1. وضع العلامات الاستقلابية
    1. (ما قبل المعالجة) يغسل خلايا الكبد الأولية مع برنامج تلفزيوني الحارة 37 درجة مئوية مرتين وإضافة احتياطيات متوسطة دميم خالية من الميثيونين لمدة 30 دقيقة إلى استنزاف الميثيونين هيولى.
      ملاحظة: L-أزيدوهوموالانيني، هو من الأحماض الأمينية والتناظرية إلى الميثيونين، ويحتوي على مجموعة أزيدو التي يمكن إدراجها في البروتينات خلال التركيب الحيوي للبروتينات الخلوية حيث أنه سيعزز استنفاد الميثيونين هيولى تغذية والتأسيس من أزيدوهوموالانيني ل في البروتينات المركبة حديثا لاستزراع خلايا الكبد الأولية.
    2. (العلاج) الحارة PBS مرتين يغسل خلايا الكبد الأولية مع 37 درجة مئوية وإضافة المتوسطة دميم خالية من الميثيونين مع 25 ميكرومترات اها (L-أزيدوهوموالانيني) ح 4 – 6.
    3. إضافة أي مادة كيميائية محددة (أي 10 ميكرومترات والروتينون) في متوسطة لمدة 4 – 6 ح في وجود اها بغية التحقيق في تأثيره على مستويات التعبير البروتين الوليدة.
    4. بعد الحضانة، إزالة المتوسطة بالشفط بالتخلية ويغسل خلايا الكبد الأولية مع برنامج تلفزيوني الباردة ثلاث مرات.
    5. إضافة 200 ميكروليتر تحلل العازلة اللوحة واحتضان لمدة 15-30 دقيقة على الجليد، ثم إمالة اللوحة وتتخذ الخلية كله في أنبوب 1.7 مل.
      ملاحظة: يمكنك يجب مراعاة تلك الخلية ليستي لزجة جداً أثناء الحصاد الخلية.
    6. Sonicate الخلية ليساتي على الجليد ل 5 s ثلاث مرات باستخدام سونيكاتور مسبار لجعل البروتينات وتفريق الحمض النووي.
    7. الطرد المركزي الخلية في 21,130 س ز لمدة 10 دقائق في 4 سج دوامة الخلية لمدة 5 دقائق، وبعد ذلك نقل المادة طافية واضحة في أنبوب جديد. قياس تركيز البروتين مرتين.
      ملاحظة: في هذه المرحلة، عينات البروتين يمكن تخزينها في-20 درجة مئوية لمدة أسبوعين إذا لم يتم استخدامها فورا.
  2. وسم البروتين الوليدة تعديل أزيد
    1. إعداد المكونات (ألف + باء) بإضافة 60 ميكروليتر من العنصر (A) للعنصر (ب).
      ملاحظة: الحل الذي يتحول إلى وردي مشرق اللون بعد إضافة العنصر (أ) إلى (ب).
    2. إعداد المخازن المؤقتة (د) و (ه) طبقاً للبروتوكول.
    3. يستغرق 20-40 ميكروغرام خلية ليستي وإضافة 50 ميكروليتر 2 × رد فعل المخزن المؤقت (المكون A + B)، ثم ضبط مستوى الصوت إلى 80 ميكروليتر بإضافة دو ودوامه ل 5 ق.
    4. إضافة 5 ميكروليتر CuSO4 (العنصر جيم)، ودوامه ل 5 ق.
    5. إضافة 5 ميكروليتر رد فعل المخزن المؤقت 1 المضافة (مكونات الطازجة د)، ثم دوامة ل 5 s وانتظر لمدة 3 دقائق.
    6. إضافة 10 ميكروليتر تشكيل رد فعل المخزن المؤقت 2 المضافة (المكون ه)، ثم دوامة ل 5 s وتدوير عينات لمدة 20 دقيقة في 4 درجات مئوية باستخدام جهاز متعدد المدورة.
      ملاحظة: الحل يتحول إلى اللون البرتقالي مشرق اللون بعد إضافة المكون (ه). وينبغي حماية العينات من الضوء أثناء الدوران.
    7. إضافة 300 ميكروليتر الميثانول ودوامه ل 5 ق، إضافة 75 كلوروفورم ميكروليتر ودوامه ل 5 s، ثم قم بإضافة 200 ميكروليتر دو ودوامه ل 5 ق.
    8. الطرد المركزي هذه العينات في 21,130 س ز و 4درجة مئوية لمدة 5 دقائق، ثم تجاهل المادة طافية مائي وإبقاء بيليه.
    9. إضافة 250 ميكروليتر الميثانول إلى الأنبوبة، ودوامه، وتدور مرة أخرى لمدة 5 دقائق في 21,130 س ز.
    10. تجاهل المادة طافية، ثم تغطية العينات مع النسيج خالية من الوبر وتسمح الكريات أيردري لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  3. تحليل صفحة والنشاف الغربية
    1. جعل بيليه في 20 ميكروليتر من تحميل المخزن المؤقت دون β-ميركابتوثانول، ودوامه لمدة 10 دقائق، والحرارة عند 70 درجة مئوية باستخدام كتلة الحرارة لمدة 10 دقائق. ثم تحميل العينات إلى 10% الحزب الديمقراطي الصربي هلام (1.5 مم) للكشف عن تيتراميثيلرهوداميني (طمره).
    2. الكشف عن إشارة اها استخدام ماسح ليزر وضع متغير كوانتيتيشن دقيقة من البروتينات الوليدة.
    3. أغسل الهلام مع دو لمدة 15 دقيقة.
    4. ثم، وصمة عار جل مخزونات النشر الاستراتيجي 10 في المائة مع كاشف صبغ أخذ سريعة وحساسة لمدة 15 – 60 دقيقة للكشف عن مجموع البروتينات كعنصر تحكم.
    5. إزالة وصمة عار للهلام مع دو ح 1 – 2، والحصول على الصورة باستخدام تصوير الأسفار الأشعة فوق البنفسجية.

النتائج

ويؤدي عزل خلايا الكبد الماوس الأساسي عائد من حوالي 20 × 106 مجموع الخلايا/الماوس. الأشيع، خلايا حية والمرفقة من الكبد الأولية تظهر مضلعة أو نموذجية سداسية في الشكل مع وضوح الحدود غشائي بعد 24 ساعة الحضانة (الشكل 2).

لتأكي...

Discussion

على الرغم من أن تم اقتراح العديد من خطوط الخلية الكبدية مخلدة واستخدامها للتحقيق في وظائف الكبد49،50،،من5152، تفتقر عموما إلى هذه الخلايا الهامة والأساسية وظائف خلايا الكبد طبيعية، مثل التعبير عن الزلال (الشك?...

Disclosures

الكتاب تبين لديهم لا تضارب في المصالح.

Acknowledgements

ونشكر الدكتور جونباي كبار المسئولين الاقتصاديين وهوا فيفيان للمدخلات العلمية والمناقشة. وأيد هذا العمل "المعهد الوطني للصحة" (NIH) (R01DK107530). وأيد T.N. المعزوفة من اليابان وكالة العلوم والتكنولوجيا. وأيد بمنحه من المعاهد الوطنية للصحة (P30DK078392) لمركز الجهاز الهضمي الأمراض البحوث الأساسية في سينسيناتي جزءا من هذه الدراسة.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
HEPES bufferFisher ScientificBP310-500
D-glucoseFisher ScientificD16-500
Ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-tetraacetic acidAmericanBioAB00505-00025
Antibiotic-Antimycotic (100x)Gibco15240-062
HBSS (10x) no calcium, magnesium, phenol redGibco14185-052
Calcium Chloride Dihydrate (CaCl2.2H2O)Fisher ScientificC79-500
Density gradient bufferGE Healthcare17-0891-02
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) low glucose, pyruvateGibco11885-084
Fetal Bovine SerumHycloneSH30910.03
Phosphate Buffered Saline (PBS) (1x)Gibco1897141
Williams medium E, no glutamineGibco12551-032
L-alanyl-L-glutamine dipeptide supplementGibco35050-061
Collagenase Type XWako Pure Chemical Industries039-17864
Perfusion pumpCole-ParmerMasterflex L/SEquipment
IV administration setEXELINT29081Equipment
A water bathREVSCIRS-PB-200Equipment
Tube heaterFisher ScientificIsotempEquipment
EthanolDecon Lab, Inc0-39613
IsofluranePHOENIX10250
Autoclaved Cotton TipsFisherbrand23-400-124
100 mm Petri DishTPP93100
Connector (Male Luer Lock Ring)Cole-Parmer instrumentEW-4551807
24 G cathetersTERUMOSurflo 24Gx3/4'
100 μm Filter (CELL STRAINERS)VWR10199-658
15 mL conical-bottom centrifuge tubesVWR89039-666
50 mL conical-bottom centrifuge tubesVWR89039-658
Chemoselective ligation reaction PROTEIN ANALYSIS DETECTION KIT, TAMRA ALKYNEInvitrogenC33370
AHA (L-azidohomoalanine)InvitrogenC10102
DMEM (methionine free)Gibco21013024
L-Cystine DihydrochlorideSIGMAC2526
Laemmli sample bufferBioRad161-0737
Protease Inhibitor CocktailSIGMAP9599
SDS solution (20%)BioRad161-0418
Tris-HCL (1M)American BioanalyticalAB14044-01000
Phosphatase Inhibitor CocktailSIGMAP5726
Protein concentration measuring Kit (Bovin Serum Albumin-BSA)BioRad500-0207
6-well tissue culture plateTPP92006
Digital HeatblockVWR12621-092Equipment
Multi-RotatorGrant-bioPTR-60Equipment
Ultrasonic SonicatorCole-ParmerGE130PBEquipment
Standard Heavy-Duty Vortex MixerVWR97043-566Equipment
A variable mode laser scannerGE Healthcare Life ScienceFLA 9500Equipment
Coomassie-dye reagentThermo Scientific24594
Inverted microscopeOlympusCKX53Equipment
Western Blotting apparatusBioRad1658004Equipment
CentrifugeEppendorf5424REquipment
Automated cell counterBioRadTC20Equipment
FluorChem R systemproteinsimple-Equipment
p-Ampka (T172) antibodyCell signaling2535
Total-AMPK antibodyCell signaling5832
Albumin antibodyCell signaling4929
beta actin antibodySanta Cruzsc-130656
Fine scissors and forceps

References

  1. Forbes, R. M., Cooper, A. R., Mitchell, H. H. The composition of the adult human body as determined by chemical analysis. Journal of Biological Chemistry. 203, 359-366 (1953).
  2. Charlton, M. R. Protein metabolism and liver disease. Baillieres Clinical Endocrinology and Metabolism. 10, 617-635 (1996).
  3. De, F. P., Lucidi, P. Liver protein synthesis in physiology and in disease states. Current Opinion in Clinical Nutrition and Metabolic Care. 5, 47-50 (2002).
  4. Stoll, B., Gerok, W., Lang, F., Haussinger, D. Liver cell volume and protein synthesis. Biochemical Journal. 287 (Pt 1), 217-222 (1992).
  5. Brown, G. C. Control of respiration and ATP synthesis in mammalian mitochondria and cells. Biochemical Journal. 284 (Pt 1), 1-13 (1992).
  6. Buttgereit, F., Brand, M. D. A hierarchy of ATP-consuming processes in mammalian cells. Biochemical Journal. 312 (Pt 1), 163-167 (1995).
  7. Morrison, C. D., Laeger, T. Protein-dependent regulation of feeding and metabolism. Trends in Endocrinology and Metabolism. 26, 256-262 (2015).
  8. Bernardi, M., Ricci, C. S., Zaccherini, G. Role of human albumin in the management of complications of liver cirrhosis. Journal of Clinical and Experimental Hepatology. 4, 302-311 (2014).
  9. Abbasi, A., et al. Liver function tests and risk prediction of incident type 2 diabetes: evaluation in two independent cohorts. PLoS. One. 7, e51496 (2012).
  10. Schmidt, M. I., et al. Markers of inflammation and prediction of diabetes mellitus in adults (Atherosclerosis Risk in Communities study): a cohort study. Lancet. 353, 1649-1652 (1999).
  11. Stranges, S., et al. Additional contribution of emerging risk factors to the prediction of the risk of type 2 diabetes: evidence from the Western New York Study. Obesity (Silver Spring). 16, 1370-1376 (2008).
  12. Jin, S. M., et al. Change in serum albumin concentration is inversely and independently associated with risk of incident metabolic syndrome. Metabolism. 65, 1629-1635 (2016).
  13. Sluis, B., Wijers, M., Herz, J. News on the molecular regulation and function of hepatic low-density lipoprotein receptor and LDLR-related protein 1. Current Opinion in Lipidology. 28, 241-247 (2017).
  14. Viollet, B., et al. Activation of AMP-activated protein kinase in the liver: a new strategy for the management of metabolic hepatic disorders. Journal of Physiology. 574, 41-53 (2006).
  15. Li, H., Lee, J., He, C., Zou, M. H., Xie, Z. Suppression of the mTORC1/STAT3/Notch1 pathway by activated AMPK prevents hepatic insulin resistance induced by excess amino acids. Amerian Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 306, E197-E209 (2014).
  16. Qian, S. B., et al. mTORC1 links protein quality and quantity control by sensing chaperone availability. The Journal of Biological Chemistry. 285, 27385-27395 (2010).
  17. Carling, D. The AMP-activated protein kinase cascade--a unifying system for energy control. Trends in Biochemical Sciences. 29, 18-24 (2004).
  18. Hardie, D. G., Scott, J. W., Pan, D. A., Hudson, E. R. Management of cellular energy by the AMP-activated protein kinase system. FEBS Letters. 546, 113-120 (2003).
  19. Li, H., et al. AMPK activation prevents excess nutrient-induced hepatic lipid accumulation by inhibiting mTORC1 signaling and endoplasmic reticulum stress response. Biochimica et Biophysica Acta. 1842, 1844-1854 (2014).
  20. Proud, C. G. Role of mTOR signalling in the control of translation initiation and elongation by nutrients. Current Topics in Microbiology and Immunology. 279, 215-244 (2004).
  21. Sarbassov, D. D., Ali, S. M., Sabatini, D. M. Growing roles for the mTOR pathway. Current Opinion in Cell Biology. 17, 596-603 (2005).
  22. Reiter, A. K., Bolster, D. R., Crozier, S. J., Kimball, S. R., Jefferson, L. S. Repression of protein synthesis and mTOR signaling in rat liver mediated by the AMPK activator aminoimidazole carboxamide ribonucleoside. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 288, E980-E988 (2005).
  23. Cheng, S. W., Fryer, L. G., Carling, D., Shepherd, P. R. Thr2446 is a novel mammalian target of rapamycin (mTOR) phosphorylation site regulated by nutrient status. Journal of Biological Chemistry. 279, 15719-15722 (2004).
  24. Howell, J. J., et al. Metformin Inhibits Hepatic mTORC1 Signaling via Dose-Dependent Mechanisms Involving AMPK and the TSC Complex. Cell Metabolism. 25, 463-471 (2017).
  25. Inoki, K., Zhu, T., Guan, K. L. TSC2 mediates cellular energy response to control cell growth and survival. Cell. 115, 577-590 (2003).
  26. Wilkening, S., Stahl, F., Bader, A. Comparison of primary human hepatocytes and hepatoma cell line Hepg2 with regard to their biotransformation properties. Drug Metabolism Disposition. 31, 1035-1042 (2003).
  27. Li, A. P., et al. Present status of the application of cryopreserved hepatocytes in the evaluation of xenobiotics: consensus of an international expert panel. Chemico-Biology Interactaction. 121, 117-123 (1999).
  28. Hengstler, J. G., et al. Cryopreserved primary hepatocytes as a constantly available in vitro model for the evaluation of human and animal drug metabolism and enzyme induction. Drug Metabolism and Reviews. 32, 81-118 (2000).
  29. Olsavsky, K. M., et al. Gene expression profiling and differentiation assessment in primary human hepatocyte cultures, established hepatoma cell lines, and human liver tissues. Toxicology and Applied Pharmacology. 222, 42-56 (2007).
  30. Shen, L., Hillebrand, A., Wang, D. Q., Liu, M. Isolation and primary culture of rat hepatic cells. Journal of Visualized Experiments. , (2012).
  31. Li, Y., Cai, S., Zhang, L., Li, X. Simultaneous isolation and primary culture of rat hepatocytes, hepatic stellate cells, Kupffer's cells and hepatic sinus endothelial cells. Nan. Fang Yi. Ke. Da. Xue. Xue. Bao. 34, 532-537 (2014).
  32. Edwards, M., Houseman, L., Phillips, I. R., Shephard, E. A. Isolation of mouse hepatocytes. Methods in Molecular Biology. 987, 283-293 (2013).
  33. Schreiber, G., Schreiber, M. The preparation of single cell suspensions from liver and their use for the study of protein synthesis. Subcellular Biochemistry. 2, 307-353 (1973).
  34. Klaunig, J. E., Goldblatt, P. J., Hinton, D. E., Lipsky, M. M., Trump, B. F. Mouse liver cell culture. II. Primary culture. In Vitro. 17, 926-934 (1981).
  35. Puviani, A. C., Ottolenghi, C., Tassinari, B., Pazzi, P., Morsiani, E. An update on high-yield hepatocyte isolation methods and on the potential clinical use of isolated liver cells. Comparative Biochemistry and Physiology A Molecular and Integrative Physiology. 121, 99-109 (1998).
  36. Park, K. H., Song, S. C. Morphology of spheroidal hepatocytes within injectable, biodegradable, and thermosensitive poly(organophosphazene) hydrogel as cell delivery vehicle. Journal of Biosciences and Bioengineering. 101, 238-242 (2006).
  37. Li, K., et al. Improved performance of primary rat hepatocytes on blended natural polymers. Journal of Biomedicine and Material Research Part A. 75, 268-274 (2005).
  38. Battle, T., Stacey, G. Cell culture models for hepatotoxicology. Cell Biology Toxicology. 17, 287-299 (2001).
  39. Kravchenko, L., Petrenko, A., Shanina, I., Fuller, B. A simple non-enzymatic method for the isolation of high yields of functional rat hepatocytes. Cell Biology International. 26, 1003-1006 (2002).
  40. Berry, M. N., Grivell, A. R., Grivell, M. B., Phillips, J. W. Isolated hepatocytes--past, present and future. Cell Biology and Toxicology. 13, 223-233 (1997).
  41. Jiang, Q. D., et al. Isolation and identification of bovine primary hepatocytes. Genetics and Molecular Research. 12, 5186-5194 (2013).
  42. Pertoft, H., Laurent, T. C., Laas, T., Kagedal, L. Density gradients prepared from colloidal silica particles coated by polyvinylpyrrolidone (Percoll). Analytical Biochemistry. 88, 271-282 (1978).
  43. Lipford, G. B., Feng, Q., Wright, G. L. A method for separating bound versus unbound label during radioiodination. Analytical Biochemistry. 187, 133-135 (1990).
  44. Mukai, T., et al. In-vivo evaluation of indium-111-diethylenetriaminepentaacetic acid-labelling for determining the sites and rates of protein catabolism in mice. Journal of Pharmacy and Pharmacology. 51, 15-20 (1999).
  45. Wilson, M. S. C., Saiardi, A. Importance of Radioactive Labelling to Elucidate Inositol Polyphosphate Signalling. Topics in Current Chemistry. 375, 14 (2017).
  46. Rostovtsev, V. V., Green, L. G., Fokin, V. V., Sharpless, K. B. A stepwise huisgen cycloaddition process: copper(I)-catalyzed regioselective "ligation" of azides and terminal alkynes. Angewandte Chemie International Edition. 41, 2596-2599 (2002).
  47. Banerjee, P. S., Ostapchuk, P., Hearing, P., Carrico, I. S. Unnatural amino acid incorporation onto adenoviral (Ad) coat proteins facilitates chemoselective modification and retargeting of Ad type 5 vectors. Journal of Virology. 85, 7546-7554 (2011).
  48. Hou, W. L., et al. Inhibition of mitochondrial complex I improves glucose metabolism independently of AMPK activation. Journal of Cell Molecular Medicine. 22, 1316-1328 (2018).
  49. Davalos, A., et al. miR-33a/b contribute to the regulation of fatty acid metabolism and insulin signaling. Proceedings of the National Academy of Science. , 9232-9237 (2011).
  50. DiPersio, C. M., Jackson, D. A., Zaret, K. S. The extracellular matrix coordinately modulates liver transcription factors and hepatocyte morphology. Molecular and Cellular Biology. 11, 4405-4414 (1991).
  51. Xu, L., et al. Human hepatic stellate cell lines, LX-1 and LX-2: new tools for analysis of hepatic fibrosis. Gut. 54, 142-151 (2005).
  52. Yang, L., Li, P., Fu, S., Calay, E. S., Hotamisligil, G. S. Defective hepatic autophagy in obesity promotes ER stress and causes insulin resistance. Cell Metabolism. 11, 467-478 (2010).
  53. Heinz, S., et al. Mechanistic Investigations of the Mitochondrial Complex I Inhibitor Rotenone in the Context of Pharmacological and Safety Evaluation. Science Reports. 7, 45465 (2017).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

140 L

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved