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要約

ここでは、健康で機能的なプライマリ マウス肝細胞の隔離のためのプロトコルを提案する.非放射性標識基板による肝新生タンパク質合成の検出については、肝臓でのエネルギー代謝の恒常性のコンテキストでのタンパク質合成の基になるメカニズムを理解するために提供されました。

要約

肝細胞は肝実質細胞で、全身のエネルギー代謝に不可欠なタンパク質の合成・分泌を含む複数の代謝機能に従事します。マウスの肝臓から分離した初代肝細胞は、機能性や肝臓で発生する変更を理解する貴重な生物学的ツールを構成します。ここ我々 二段コラゲナーゼ灌流法を実行することによって分離およびプライマリ マウス肝細胞の培養方法を説明し、蛋白代謝を調査するために利用します。成体マウスの肝臓は順番にエチレング リコール ビス四酢酸 (グリコールエーテルジアミン四酢酸)、コラゲナーゼ、密度勾配バッファーと肝細胞の分離に続いてにおいて灌流します。これらの分離肝細胞は培養皿で実行可能な肝細胞の寄附の特性の大半を維持します。これらの肝細胞は、非放射性試薬の新生タンパク質合成を含むタンパク質代謝の評価に使用できます。示す分離肝細胞が容易に制御 Tetramethylrhodamine (耽羅) 蛋白質と化学療法選択の ligation の反作用を利用してエネルギー代謝に関与する蛋白合成の高い質と量の安定性を構成します。検出法および西部のしみが付く分析。したがって、この方法はエネルギー恒常性に関与する肝初期蛋白合成を調査するためです。次のプロトコルは、材料と質の高いプライマリ マウス肝細胞の分離と新生タンパク質合成の検出方法について説明します。

概要

タンパク質は重要な栄養素と人体の乾燥重量の約 50% はいくつかの生物学的特性と機能1のあるタンパク質から成る。したがって、タンパク質合成はほとんどエネルギーがかかるイベントの一つ、タンパク質の代謝変化は高代謝性疾患2,3、4を含む病気の開発に関連付けられています。肝臓で蛋白質の生合成は、総エネルギー消費量5,6の約 20-30% を占めています。また、タンパク質の機能としてだけでなく、パッシブまたは建物のブロックもアクティブな信号を仲介する因子は、肝臓の細胞内や細胞外7全身の代謝を調節します。合成され、肝臓とプラズマ8の最も豊富な蛋白質によって分泌される血清アルブミンの減らされたレベルが 2 型糖尿病の開発9,10,のリスクを増加させる例えば、11、血清アルブミンの濃度が高く、メタボリック シンドローム12を開発することに対して保護一方。邪魔やリポタンパク質を来すと LRP1 を含む、コレステロール恒常性を調節する、分泌または膜区切のラット肝タンパク質の混乱がさらに、インスリン抵抗性、高脂血症、動脈硬化症の発展につながることができます。13したがって、蛋白質代謝障害肝臓とその関連付けられた代謝性合併症に関与している分子病態生理学的メカニズムの同定は、薬理学的小説を発見するため役に立つかもしれない。発症を遅らせるか、またはインスリン抵抗性、糖尿病、非アルコール性脂肪肝など代謝性疾患の治療へのアプローチします。

タンパク質の合成は、細胞のエネルギー状態に密接に結びついた (例えば、蛋白質合成の伸長段階 1 つのペプチド結合の形成が必要 4 リン酸ジエステル結合14) 感知の分子経路によって調節されていると間や細胞内栄養アベイラビリティ15,16。AMP 活性化プロテインキナーゼ (AMPK) は、17エネルギー恒常性を維持する細胞内のエネルギー センサーの 1 つです。AMPK がアクティブになったときに細胞のエネルギー レベルが低下 AMPK やその対象となる基板に異化経路を刺激し、タンパク質合成18,19を含む同化の過程を阻害する機能します。タンパク質合成の調節は、複数の翻訳因子とリボソームタンパク質20のリン酸化によって媒介されます。ノートの哺乳類ラパマイシン標的複雑な 1 (mTORC1)、タンパク質合成の主要なドライバーは、AMPK の21の主要なターゲットの 1 つです。MTORC1 経路の活性化は、刺激的なタンパク質翻訳とオートファジー20,21により細胞の成長と増殖を強化します。したがって、AMPK の活性化が22mTORC1 を介したタンパク質合成を抑制することが論理です。確かに、AMPK の活性化を打ち消すし、直接その不活性化23と24タンパク質生合成の抑制につながるスレオニン残基 2446 (Thr2446) で mTORC1 を廃止します。また、AMPK 直接抑制することがないリン酸化と結節性硬化症複合 2 (TSC2)25 mTORC1 シグナル伝達カスケードの上流の調節因子である活性化による mTORC1 機能。要するに、肝臓でこれらの経路の制御不全は、しばしば代謝性疾患の開発にリンクされて、従ってエネルギーの制御にこれらの細道の役割を調査するため効果的な実験ツールを確立する重要な必要性があると肝細胞の蛋白質新陳代謝。

分離肝細胞の機能特性と体内肝細胞より体外肝由来細胞ライン26,27,28との強い類似性があります。それが示されているプライマリひと肝細胞が肝生検の 77% の類似を共有する HepG2 細胞を分化肝がん細胞と肝機能を調べるための広くのコンテキストで 48% 未満を表示するのに対し遺伝子発現プロファイル、29をです。したがって、肝機能と生理学の調査に重要です不死化細胞ではなく、初代肝細胞の利用、分離肝細胞の培養に使用可能ないくつかのプロトコル30,31をラットから特に。ラット肝細胞は細胞の比較的高い収率で役に立つ、マウス肝細胞は遺伝的変調マウスで広く利用できるため多くの科学的な面で大きな可能性を持ってください。ただし、健康と豊富な肝細胞および分子に基づく評価のマウスからの分離にはいくつかの技術的な課題があります: まず、バッファー試薬と肝臓を灌流してカニューレ挿入は非常に扱いにくい小さくて細いマウス門脈または下大静脈; のため第二に、分離の過程で細胞の長い操作時間を引き起こす可能性が減少細胞の量と質。第三に、非酵素的機械的分離法は、厳しい損傷で起因し、実行可能な分離肝細胞32,33の低収量を生成できます。1980 年代、コラゲナーゼ灌流法は動物の34の肝臓から肝細胞を分離するため導入されました。この手法はコラゲナーゼ灌流肝35,36,の37、カルシウム キレート剤ソリューション38,39, 酵素消化肝臓の注入と肝実質35の機械的解離。最初のステップで [Ca2 +] キレート (エチレンジアミン四酢酸、EDTA) を含むカルシウム [Ca2 +] 空きバッファーをマウス肝臓は灌流します。2 番目の手順では、マウスの肝臓は細胞-細胞外マトリックスの相互作用を分解するコラゲナーゼを含むバッファーと灌流します。ステップ 1 で使用するバッファーとは異なり [Ca2 +] 2 番目のステップのバッファーでイオンの存在はその後消化肝臓はさらにゆっくりと機械的に分離する間鉗子を使用して、効果的なコラゲナーゼに必要な肝カプセルと柔組織。最後に、結合組織はフィルタ リングによって削除され、その後遠心分離両方非実質細胞から実行可能な肝細胞と肝細胞以外の生物密度勾配バッファー40,41 を使って、42。本研究ではタンパク質合成の分析のためのマウスの肝臓から肝細胞を分離する変更された 2 段階コラゲナーゼ灌流法を紹介します。

蛋白質のカイネティックス、広く発現レベル、離職率を定量化し、蛋白質43高感度放射能44の検出のための生物の分布を決定する使用されます。ただし、放射性同位元素の使用には、高精度制御研究の状況と手順45が必要です。非放射性方法は開発されているし、ますます人気を集めています。Tetramethylrhodamine (耽羅) タンパク質検出法と化学療法選択の ligation の反作用はそれらの 1 つ、アジドとアルキン グループ46、よう携帯電話のイベントを分析する利用できる間化学療法選択的反応に基づいています新生タンパク質の合成とサブクラス、アジド基で修飾糖タンパク質の検出します。新生タンパク質合成の L Azidohomoalanine (L AHA、アジ化修飾アミノ酸) 代謝蛋白質に組み込まれて、耽羅タンパク質検出法47を使用して検出します。プライマリ マウス肝細胞のこの試金を使用して、我々 はミトコンドリアから ATP の可用性に新生タンパク質合成速度がしっかりとリンクされている表示と AMPK 活性化 (図 1)。

要約すると、プライマリ マウス肝細胞の使用率はタンパク質とエネルギー代謝を調査することが重要と新生タンパク質合成の定量化は開発に関連する経路の生理学的役割についての洞察を得るため貴重であると肝疾患の治療。

プロトコル

このプロトコルには、実験用マウスの使用が含まれています。動物のケアと実験手順は、シンシナティ子供病院医療センター動物の世話委員会によって承認された手続きに従って行われました。

1. プライマリ マウス肝細胞の分離

  1. 前の分離準備
    1. 表 1と 4 ° C (15 mL/マウス) での説明に従って 450 mL の 40% 密度勾配バッファーを準備します。
    2. 表 1に示すようにウィリアムズの媒体の 500 mL を準備し、4 ° C で維持
    3. 表 1に示すように DMEM の 500 mL を準備し、氷 (30 mL/マウス) をします。
    4. 前述の表 1と水浴 (40 mL/マウス) の 42 ° C で維持に HBSS (-) バッファーの 500 mL を準備します。
    5. 風呂の水で 42 ° C で 30 分インキュベーションと表 1に示すようコラゲナーゼ型 X HBSS (+) バッファー 0.3 mg/mL と 500 mL を準備 (40 mL/マウス)。
    6. 気泡なしのソリューションをフラッシュの流れを確認することで、ラッチのフットペダルにわたって静脈内 (ふるさと) 管理チューブを配置することによって灌流ポンプを設定します。
    7. ウォーム アップ 42 管ヒーター° C
    8. 4 ° C に遠心機を冷却します。
  2. 麻酔と血流
    1. 作業領域とポンプをきれい。
    2. 10 分間徹底的に 70% エタノールを実行して、点滴のポンプに接続された管を洗います。
    3. 10 分間完全 DDW と洗浄によって点滴のポンプに接続された管から残留エタノールを削除します。
    4. はさみと 70% のエタノールで鉗子をふき取ります。
    5. プラスチック コンテナー メッシュ底と直接の接触を避けるためにメッシュの下に 2 mL イソフルランに浸したガーゼにマウスを配置します。
    6. ロバ ペダル反射 (しっかりつま先ピンチ) によって麻酔の深さ。
    7. 麻酔の目的の深さに達したときに、マウスを削除します。
      注: の麻酔導入時間は 1 分以上をしないでください。
    8. 15 mL コニカル チューブを用いたチューブの端にプッシュ 1 mL イソフルラン浸したパッド鼻の円錐形を作成します。
    9. 近づいたり、マウスの鼻の穴から鼻の円錐形を移動することによって麻酔の深さをコントロールします。
    10. 作業台に腹側を上にマウスを配置します。
    11. マウスの腹部領域の上の 70% のエタノールをスプレーし、鋭いハサミと歯の鉗子を用いた真皮と腹膜の大きな横切開することによって腹腔内を開きます。
    12. すべての腹部器官が完全に鋭いハサミと歯の鉗子を使用して露出までは、腹部のレイヤーの垂直方向のカットを行います。
    13. 小さな移動および大腸肝臓、門脈、下大静脈 (IVC) までオートクレーブ綿棒とマウスの左側に向かって明確に公開されます。
    14. 24 G カテーテルに挿入下大静脈右腎静脈の分岐だけで慎重に出血や下大静脈の損傷を避けるために手を振ることがなく。
      注: 出血は、下大静脈にカテーテルを挿入している間に発生した場合、門脈内に新しいカテーテルを挿入しようとする必要があります。
    15. カテーテルの針を削除し、IVC から抜け出すことを避けるためにカニューレの位置を制御、24 G カニューレを灌流チューブ コネクタを使用して接続します。
      注: は、空気泡の存在を避けるため、灌流を開始する前に。
    16. 4 mL/min の流速で暖かい HBSS (-) と肝灌流を開始し、すぐにはさみを使って内部の血の流出する脾静脈切断します。
      注: 穿刺に成功した場合、肝臓は肝静脈、下大静脈からバッファーの逆流分布により白くため開始されます。門脈、脾臓および腸間膜静脈; の共用体によって形成されます。そのため、以来、それは大きいと肝臓から遠位脾静脈をカットに非常に安全です。
    17. 暖かい HBSS (-) の 35 mL による血液灌流を続けます。
      注: 肝臓この段階で淡い色の灌流が不十分な場合、麻酔下でまだ生きているマウスになります。
  3. 分解と抽出
    1. 4 mL/min の流速で X 型コラゲナーゼを含む暖かい 35 ml HBSS (+) のマウス肝灌流します。
    2. 数分おきには ~ 10 の鉗子を使用して、脾静脈をクランプ s HBSS (+) 肝臓の解剖学的部分のすべてに拡散して全体のボリュームをできるようにします。
      注: 肝臓はバッファーの混雑により脾静脈をクランプ後うねりを開始します。
    3. X 型コラゲナーゼと 100 mm ペトリ皿灌流プロセスの終わりに準備暖かい HBSS (+) 5 mL を注ぐ。
    4. 肝臓への血液の逆流を防ぐ、鉗子で胆嚢を削除および、血液を取り出すための紙タオルで軽く肝臓を拭いてくださいするポンプを停止する前に体の残りの部分から灌流肝を切った。
    5. 5 mL 準備暖かい HBSS (+) が含まれているペトリ皿に肝臓を転送し、優しくストレート先端の鉗子を用いた肝カプセルを削除します。
      注: 肝カプセル肝臓周囲結合組織の薄い層であります。
    6. 実質組織を鉗子を使用して慎重に分散します。15 mL を追加し、シャーレに冷たい DMEM。
      注: 媒体が曇り実質細胞による場合に肝臓がよく消化します。
    7. 媒体に残留の実質細胞を解放し、別の 15 mL を加えて軽く引き裂かれた肝臓を振るセルの残りの部分を取得する、ペトリ皿に冷たい DMEM。
    8. 50 mL の円錐管に 100 μ m セル ストレーナーを介して溶存肝 DMEM を転送、氷で保ちます。
  4. 浄化
    1. 4 ° C で 2 分間 60 x g で細胞懸濁液を遠心分離機、慎重に真空吸引により上澄みを除去し、10 mL の DMEM にペレットを再懸濁します。
    2. 40% の密度勾配のバッファーの上に薄い層としてペレットの再懸濁を追加し、4 で 800 g xブレーキなし 10 分間遠心° C
    3. 下層ではないが、上層 (DMEM) と中間層 (デッド ・ オア ・非実質細胞) を含む上清を慎重に取り外します (ペレット: 肝実質細胞)。
    4. 2-3 mL ウィリアム中 E の一次電池を再懸濁します、チューブの壁に死んだ細胞の汚染を避けるために新しい 50 mL のチューブに転送。
    5. 7-8 mL ウィリアム媒体 E を追加、優しく、ミックス、4 ° C で 1 分 800 × g で遠心分離
    6. 真空吸引により上清を慎重に取り外し、ウィリアムの媒体 E (ペレットの大きさ) の 10、20、30 mL で再びペレットを再懸濁します。
    7. 自動化された細胞カウンターを使用して、セルをカウントします。
    8. ウィリアムの媒体 E 種子、インキュベーターで 37 にプレートを保持° C 2-3 h の死んでいるか接続されていないセルを削除する対策と 37 ° C で一晩インキュベート中 with10% FBS DMEM 培地を交換し、
    9. 次の日、プライマリ マウス肝細胞は実験用のため準備ができています。

2. 化学療法選択的結紮反応アッセイ新生タンパク質合成の検出のため

  1. 代謝ラベリング
    1. (前処理)37 ° C の暖かい PBS で初代肝細胞を 2 回洗浄し、細胞内のメチオニンを破壊する 30 分間メチオニン無料 DMEM 培地を留保を追加します。
      注: L-Azidohomoalanine、アミノ酸、メチオニンにアナログ、アジドフェニル部位、細胞内のメチオニンの枯渇、給餌を強化、細胞蛋白質の生合成中に蛋白質に組み込むことが、定款が含まれています培養肝細胞の新生タンパク質に L Azidohomoalanine。
    2. (治療)37 ° C と洗浄初代肝細胞は PBS を 2 倍暖かいし、25 μ M AHA (L Azidohomoalanine) 4-6 時間とメチオニン無料 DMEM 培地を追加します。
    3. 新生バイオマーカ発現量に及ぼす影響を調査するために 4-6 時間のための媒体の AHA の存在下での任意の特定化学物質 (すなわち10 μ M ロテノン) を追加します。
    4. インキュベーション後、真空吸引によりメディアを取り出して、3 回コールド PBS で初代肝細胞を洗浄します。
    5. プレートに 200 μ L 換散バッファーを追加し氷の上の 15-30 分間インキュベートし、プレートを傾けるし、1.7 mL チューブにライセート セル全体を取る。
      注: セルの収穫時にその細胞ライセートは非常に粘着性を守らなければなりません。
    6. 5 氷の上細胞ライセートを超音波照射 3 回タンパク質を可溶化し、DNA を分散するプローブの超音波発生装置を使用して s います。
    7. 渦セル 5 分ライセート 21,130 x g 4 oC で 10 分間にて、細胞を遠心し、新しい管に明確な上澄みを転送します。2 回タンパク質濃度を測定します。
      注: この段階では、蛋白質のサンプル格納できます-20 ° C で 2 週間のすぐに使用しない場合。
  2. アジ化変更新生タンパク質をラベル付け
    1. コンポーネント (A) を (B) 60 μ L の追加によってコンポーネント (A + B) を準備します。
      注: ソリューションは、(A) を (B) コンポーネントを追加した後の色で鮮やかなピンク色になります。
    2. バッファー (D) および (E) によると準備するプロトコル。
    3. 20-40 μ g 細胞ライセートを取るし、50 μ L 2 x 反応バッファーを追加 (コンポーネント A + B)、DDW と 5 の渦を追加して 80 μ L にボリュームを調整する s。
    4. 5 μ L を追加 CuSO4 (コンポーネント C)、および 5 の渦 s。
    5. 追加は 5 μ L 反応バッファー添加剤 1 (作りたてコンポーネント D)、5 s の渦、3 分待ちます。
    6. 10 μ L の再構成反応バッファー添加物 2 (コンポーネント E) 5 s、渦と多回転機を使用しての 4 ° C で 20 分の回転のサンプルを追加します。
      注: ソリューション コンポーネント (E) を追加した後に明るいオレンジ色になります。サンプルは、回転中に光から保護する必要があります。
    7. 300 μ L メタノールと 5 の渦を追加 s、75 μ L のクロロホルムと 5 の渦を追加 s、200 μ L DDW および 5 の渦を追加 s。
    8. 遠心分離機の g x 21,130 と 4 でサンプル° C、5 分間は、水溶液上澄みを廃棄し、ペレットを維持します。
    9. チューブ、渦、21,130 x g.で 5 分間のために再度スピン 250 μ L メタノールを追加します。
    10. 室温で 15 分間空気乾燥ペレットの上澄みを廃棄し、糸くずの組織サンプルをカバーでき
  3. ページの解析および西部にしみが付くこと
    1. 20 μ L の 10 分のヒート ブロックを使用して、バッファーなしβ-メルカプトエタノール、10 分の渦、70 ° C で熱を読み込みでペレットを可溶化します。10 %sds ゲル (1.5 mm) Tetramethylrhodamine (耽羅) 検出のためにサンプルをロードします。
    2. 可変モード レーザー スキャナーを用いた新生タンパク質の精密定量 AHA 信号を検出します。
    3. DDW でゲルを 15 分間洗ってください。
    4. 次に、コントロールとして総蛋白を検出する 15-60 分間高速で機密性の高い coomassie 色素試薬と 10 %sds ゲルを染色します。
    5. デ 1-2 h の DDW でゲルを染色し、UV 蛍光イメージャを使用してイメージを取得します。

結果

プライマリ マウス肝細胞の分離の結果約 20 x 106合計セル/マウスの収率で。組織学的に、ライブと接続された初代肝細胞多角形または典型的な六角形で明確に説明膜境界後 24 時間培養 (図 2)。

単離細胞が肝細胞であるかどうかを確認、プライマリ マウス単離肝細胞 (PMHs)、マウス萌芽期の繊?...

ディスカッション

これらの細胞が一般に重要かつ基本的な不足がいくつか不死化肝細胞を提案し、肝機能49,50,51,52を調査するために使用すると、アルブミン (図 3) の式など、通常の肝細胞の機能。広く認識されて、したがって、初代肝細胞を利用したが肝臓の生理学および培養とこれらの細?...

開示事項

作者を示す彼らは利害の対立があります。

謝辞

科学的な議論には、夫妻 Joonbae Seo とビビアン華をありがとうございます。この作品は、国立衛生研究所 (NIH) (R01DK107530) によって支えられました。濃度は, は、日本科学技術振興機構のさきがけによって支えられました。本研究の一部は、シンシナティの消化器病研究コアセンターの NIH (P30DK078392) からの助成金によって支えられました。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
HEPES bufferFisher ScientificBP310-500
D-glucoseFisher ScientificD16-500
Ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-tetraacetic acidAmericanBioAB00505-00025
Antibiotic-Antimycotic (100x)Gibco15240-062
HBSS (10x) no calcium, magnesium, phenol redGibco14185-052
Calcium Chloride Dihydrate (CaCl2.2H2O)Fisher ScientificC79-500
Density gradient bufferGE Healthcare17-0891-02
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) low glucose, pyruvateGibco11885-084
Fetal Bovine SerumHycloneSH30910.03
Phosphate Buffered Saline (PBS) (1x)Gibco1897141
Williams medium E, no glutamineGibco12551-032
L-alanyl-L-glutamine dipeptide supplementGibco35050-061
Collagenase Type XWako Pure Chemical Industries039-17864
Perfusion pumpCole-ParmerMasterflex L/SEquipment
IV administration setEXELINT29081Equipment
A water bathREVSCIRS-PB-200Equipment
Tube heaterFisher ScientificIsotempEquipment
EthanolDecon Lab, Inc0-39613
IsofluranePHOENIX10250
Autoclaved Cotton TipsFisherbrand23-400-124
100 mm Petri DishTPP93100
Connector (Male Luer Lock Ring)Cole-Parmer instrumentEW-4551807
24 G cathetersTERUMOSurflo 24Gx3/4'
100 μm Filter (CELL STRAINERS)VWR10199-658
15 mL conical-bottom centrifuge tubesVWR89039-666
50 mL conical-bottom centrifuge tubesVWR89039-658
Chemoselective ligation reaction PROTEIN ANALYSIS DETECTION KIT, TAMRA ALKYNEInvitrogenC33370
AHA (L-azidohomoalanine)InvitrogenC10102
DMEM (methionine free)Gibco21013024
L-Cystine DihydrochlorideSIGMAC2526
Laemmli sample bufferBioRad161-0737
Protease Inhibitor CocktailSIGMAP9599
SDS solution (20%)BioRad161-0418
Tris-HCL (1M)American BioanalyticalAB14044-01000
Phosphatase Inhibitor CocktailSIGMAP5726
Protein concentration measuring Kit (Bovin Serum Albumin-BSA)BioRad500-0207
6-well tissue culture plateTPP92006
Digital HeatblockVWR12621-092Equipment
Multi-RotatorGrant-bioPTR-60Equipment
Ultrasonic SonicatorCole-ParmerGE130PBEquipment
Standard Heavy-Duty Vortex MixerVWR97043-566Equipment
A variable mode laser scannerGE Healthcare Life ScienceFLA 9500Equipment
Coomassie-dye reagentThermo Scientific24594
Inverted microscopeOlympusCKX53Equipment
Western Blotting apparatusBioRad1658004Equipment
CentrifugeEppendorf5424REquipment
Automated cell counterBioRadTC20Equipment
FluorChem R systemproteinsimple-Equipment
p-Ampka (T172) antibodyCell signaling2535
Total-AMPK antibodyCell signaling5832
Albumin antibodyCell signaling4929
beta actin antibodySanta Cruzsc-130656
Fine scissors and forceps

参考文献

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