JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Здесь мы представляем протокол для изоляции здоровых и функциональных мыши гепатоцитов. Инструкции для обнаружения синтеза гепатопротеинов зарождающейся нерадиоактивные маркировки субстрата были предоставлены помочь понять механизмы, лежащие в основе синтеза белка в контексте гомеостаза энергии метаболизма в печени.

Аннотация

Гепатоциты Паренхиматозный клетки печени и заниматься несколько метаболические функции, в том числе синтез и секрецию белков, необходимых для системного энергетического гомеостаза. Основная гепатоцитов, изолированных из мышиных печени являются ценные биологические инструментом для понимания функциональных свойств или изменений, происходящих в печени. Здесь мы описывают метод для изоляции и культуры мыши гепатоцитов, выполняя двухэтапный метод коллагеназы перфузии и обсудить их использования для изучения метаболизма белков. Печень взрослой мыши последовательно увлажненную с этиленгликоль бис tetraacetic кислоты (EGTA) и коллагеназы, следуют изоляции гепатоцитов с буфером градиента плотности. Эти изолированных гепатоцитов жизнеспособной на культуре тарелки и сохранить большинство обеспеченных характеристики гепатоцитов. Эти гепатоцитов могут использоваться для оценки белкового обмена, включая синтез зарождающейся белка с нерадиоактивных реагентов. Мы покажем, что изолированных гепатоцитов легко контролируются и включать более высокие качество и объем стабильности синтеза белка, связаны с энергии метаболизма, используя реакции перешнуровки химио селективный с протеином тетраметилродамина (ТАМРА) метод обнаружения и западных blotting анализы. Таким образом этот метод является ценным для расследования синтеза гепатопротеинов зарождающейся, связаны с энергетического гомеостаза. Следующий протокол изложены материалы и методы для изоляции высокого качества первичных мыши гепатоцитов и выявление зарождающихся белкового синтеза.

Введение

Белок является важным элементом питания и примерно 50% от сухого веса тела человека состоит из белков, которые имеют несколько биологических черт и функции1. Следовательно синтез белка является одним из наиболее энергии много событий и изменения в метаболизме белков высоко связан с развитием заболеваний, включая болезни обмена веществ2,3,4. В печени биосинтез белка приходится приблизительно 20 – 30% от общей энергии потребления5,6. Кроме того, функция белки не только пассивно или строительные блоки печени, но также активное посредничество сигнал факторы внутриклеточно или внеклеточно регулировать системного метаболизма7. Например, снижение уровня сывороточного альбумина, который синтезируется и выделяется печени и наиболее распространенных белка в плазме8, увеличивает риск типа 2 диабет развития9,10, 11, тогда как более высокой концентрации сывороточного альбумина защитные против развивающихся метаболический синдром12. Кроме того нарушается или нарушение секреторной или мембраны граница печени белков, которые модулируют гомеостаза холестерин, липопротеиды, LDLR и LRP1, может привести к развитию сопротивление инсулина, гиперлипидемия, или атеросклероза 13. Таким образом, Идентификация молекулярных патофизиологических механизмов, которые участвуют в нарушение метаболизма белка в печени и ее связанные метаболических осложнений может быть полезным для обнаружения Роман фармакологической подходы к задержать наступление или лечения метаболических заболеваний, таких как сопротивление инсулина, диабет и безалкогольные жирная печень.

Синтез белка тесно связан с состоянием клеточной энергии (например, формирование одной облигации пептид во время удлинения шага синтеза белка требует 4 Фосфодиэфирная облигации14) и регулируется молекулярные пути, которые чувствуют и внутри cellular наличия питательных веществ15,16. Активирована AMP протеин киназы (AMPK) — один из датчиков внутриклеточных энергии, которые поддерживают энергетического гомеостаза17. AMPK активируется при клеточном уровнях энергии снижаются, AMPK и его целевых субстратов функция стимулирования катаболические пути и подавляют анаболических процессов, включая синтез белков18,19. Регуляции синтеза белка при посредничестве фосфорилирование несколько факторов перевод и рибосомных белки20. Следует отметить млекопитающих цель rapamycin комплекс 1 (mTORC1), основной движущей силой синтеза белка, является одной из основных целей AMPK21. Активации пути mTORC1 повышает клеточный рост и распространение путем стимулирования белка перевод и autophagy20,21. Таким образом вполне логично, что активация AMPK может ингибировать синтез белка mTORC1-опосредованной22. Действительно активация AMPK противодействует и непосредственно фосфорилирует mTORC1 на треонин остатков 2446 (2446чет) приводит к инактивации23 и подавление биосинтеза белка24. Кроме того AMPK косвенно может ингибировать mTORC1 функции фосфорилирования и активации клубневые склероз комплекс 2 (TSC2)25 -вверх регулятор mTORC1 сигнальный Каскад. Короче говоря, регуляции этих путей в печени часто связан с развитием метаболических заболеваний и поэтому крайне необходимо создать эффективные инструменты экспериментально расследовать роль этих путей регулирования энергии и метаболизм белков в гепатоцитах.

Есть сильнее сходство между функциональными свойствами изолированных гепатоцитов первичной и гепатоцитов в естественных условиях чем с в vitro печени производные клеток линии26,27,28. Было доказано, что первичного человека гепатоцитов разделяют 77% сходства с этим биопсии печени, тогда как HepG2 клеток, которые являются высокодифференцированных раковых клеток печени и широко используется для изучения функции печени, отображения менее 48% в контексте Экспрессия генов профилей29. Таким образом использование первичных гепатоцитов, а не увековечен культуры клеток, имеет жизненно важное значение в расследовании функции печени и физиологии, и доступны несколько протоколы изоляции и культуры первичной гепатоцитов особенно от крыс30,31. Хотя гепатоцитов крыс полезны с относительно более высокой доходности клеток, мыши гепатоциты имеют больший потенциал во многих научных аспектах благодаря широкой доступности генетически модулированного мышей. Однако, есть несколько технических проблем в изоляции здоровым и обильные первичной гепатоцитов от мышей для сотовых и молекулярно-на основе оценок: во-первых, очень трудно справиться канюля вставки к perfuse печени с буфера реагентов из-за малого и тонкий мыши воротной вены или нижней полой вены; Во-вторых более длительное время манипуляции клеток во время изоляции может вызвать сокращение клеток и их качество; в-третьих, неферментативного Механическое разделение методы могут привести к серьезному повреждению и производить низкая доходность жизнеспособных изолированных гепатоцитов первичной32,33. В 1980-х коллагеназа перфузии техника была введена для изоляции гепатоцитов из печень животных34. Этот метод основан на коллагеназы перфузии печени35,,3637, настой печени с кальция хелатором решения38,39, ферментативного пищеварения и механический диссоциации печеночной паренхимы35. На первом шаге мыши печени является увлажненную с кальция [Ca2 +] Бесплатная буфер, содержащий [Ca2 +] хелатором (Этилендиамин tetraacetic кислота, ЭДТА). На втором шаге мыши печени является увлажненную с буфером коллагеназы содержащих для гидролизуют сотовых внеклеточная матрица взаимодействия. В отличие от буфер, используемый на шаге 1, требуется наличие ионов [Ca2 +] в буфере второй шаг для деятельности эффективной коллагеназы, после чего усваивается печень должна быть далее осторожно и механически разделяются с помощью щипцов между печеночная капсулу и паренхиматозных тканях. Наконец соединительной ткани удаляется путем фильтрации, и последующим центрифугированием отделяет жизнеспособных гепатоцитов из не Паренхиматозный клеток, так и неживых гепатоцитов с использованием плотности градиента буфера40,41 ,42. В настоящем исследовании мы покажем перфузии коллагеназы модифицированных двухэтапный способ изолировать первичной гепатоцитов из печени мыши для анализа синтеза белка.

Radiolabeling белков широко используется для количественной оценки уровни выражения, текучесть кадров и определить биологические распределение43 белков из-за высокой чувствительность обнаружения радиоактивности44. Однако использование радиоактивных изотопов требует высоко контролируемых исследований обстоятельств и процедур,45. Альтернативные Нерадиоактивные методы были разработаны и получили все большую популярность. Реакции перешнуровки химио селективный с методом обнаружения белка тетраметилродамина (ТАМРА) является одним из них и основывается на химио селективные реакции между азид и алкины группы46, который может быть использован для анализа сотовой событий, таких как Обнаружение зарождающейся белкового синтеза и подклассы гликопротеинов, изменение с азидом группой. Для зарождающейся белкового синтеза L-Azidohomoalanine (L-AHA, аминокислота азид модифицированные) можно метаболически включены в белки и обнаружить с помощью метода обнаружения ТАМРА белка47. Используя этот assay мыши гепатоцитов, мы показываем, что тариф синтеза зарождающейся белок тесно связана с наличия СПС от митохондриальных и AMPK активации (рис. 1).

В целом, использование первичных мыши гепатоцитов имеет решающее значение для изучения метаболизма белка и энергии и количественной синтез новых белков является ценным для получения понимание Физиологическая роль путей, относящихся к развитию и лечение заболеваний, связанных с гепатоцитов.

протокол

Этот протокол содержит использования лабораторных мышей. Уход за животными и экспериментальной процедуры выполнялись в соответствии с процедурами, утвержденными животных ухода комитетов Цинциннати детей больница медицинского центра.

1. изоляция первичного мыши гепатоцитов

  1. Подготовка предварительной изоляции
    1. Подготовьте 450 мл 40% плотности градиента буфера, как описано в таблице 1 и хранить при 4 ° C (15 мл/мышь).
    2. Подготовка 500 мл среды Уильямс, как описано в таблице 1 и хранить при 4 ° C.
    3. Подготовка 500 мл DMEM, как описано в таблице 1 и держать на льду (30 мл/мышь).
    4. Подготовка 500 мл буфера HBSS (-), как описано в таблице 1 и держать при 42 ° C на водяной бане (40 мл/мышь).
    5. Подготовка 500 мл HBSS (+) буфер с 0.3 мг/мл коллагеназы типа X, как описано в таблице 1 с 30 минут инкубации при 42 ° C на водяной бане (40 мл/мышь).
    6. Настройка перфузионного насоса, поместив внутривенного (I.V) администрация трубы через защелкой педали и проверив поток промывочного раствора без пузырьков воздуха.
    7. Разминка трубки отопителя в 42° C.
    8. Охладьте вниз центрифуги машины до 4 ° C.
  2. Анестезия и перфузии
    1. Чистота области работы и насоса.
    2. Промойте насос подключен трубки IV, запустив 70% этанол тщательно за 10 мин.
    3. Удаление остаточного этанола из насоса подключен трубки IV промыв с DDW полностью за 10 мин.
    4. Протрите ножницы и щипцы с 70% этиловом спирте.
    5. Поместите указатель мыши в пластиковый контейнер с сеткой внизу и изофлюрановая пропитанной марлей 2 мл под сеткой, чтобы избежать прямого контакта.
    6. Ослов глубины анестезии на педаль рефлекс (фирмы мыс сжатие).
    7. Удаление мыши, когда он достиг желаемой глубины анестезии.
      Примечание: Время индукции анестезии должно быть не более 1 мин.
    8. Постройте носовой конус с помощью конической трубки 15 мл с 1 мл изофлюрановая пропитанной pad, толкнул к концу трубки.
    9. Контроль глубины анестезии, перемещая носовой конус ближе или дальше от мыши ноздри.
    10. Поместите курсор мыши на рабочей платформе с вентральной стороне, обращенной.
    11. Спрей на 70% спирте над брюшной области мыши, а затем открыть брюшной полости, сделав большой поперечный разрез дермы и брюшины с помощью острых ножниц и зубчатый щипцами.
    12. Затем сделайте вертикальный разрез брюшной слои до тех пор, пока все органы брюшной полости полностью предоставляются с помощью острых ножниц и зубчатый щипцами.
    13. Маленький шаг и толстой кишки к левой стороне мыши с наконечником из хлопка до печени, портальной вены и нижней полой вены (IVC) явно подвергаются.
    14. Вставьте 24 G катетер IVC только на бифуркации с правом почечной Вены тщательно без пожимая руки, чтобы избежать травм МКВ и кровотечения.
      Примечание: Если кровотечение возникает при вставке катетер в МКВ, то вы должны попытаться вставить новый катетер в Вену портал.
    15. Удаление иглы катетера и контролировать положение канюля, чтобы избежать попадания из МКВ, затем подключите 24 G канюля с перфузии трубки с помощью соединителя.
      Примечание: Избегайте наличия пузырьков воздуха перед началом перфузии.
    16. Запустите перфузии печени с теплой HBSS (-) при скорости потока 4 мл/мин и отрезать селезеночной вен быстро, чтобы слить внутреннего крови с помощью ножниц.
      Примечание: Если катетеризации является успешным, печень начнет бланшировать из-за распределения обратного потока буфера от IVC печеночных вен. Воротной вены формируется путем объединения селезеночной и Улучшенный брыжеечных вен; Таким образом это довольно безопасно отрезать селезеночной вены, так как он большой и дистальной из печени.
    17. Продолжать перфузии с 35 мл теплой HBSS (-).
      Примечание: Печень станет бледно цвета при адекватной перфузии, и мышь еще жив под наркозом на данном этапе.
  3. Пищеварение и добыча
    1. Perfuse мыши печени с теплой 35 мл HBSS (+) включая коллагеназы типа X со скоростью потока 4 мл/мин.
    2. Каждые несколько минут, зажим селезеночной вен с помощью щипцов для ~ 10 s разрешить весь объем HBSS (+) для диффузного во все анатомические части печени.
      Примечание: Печень начинает набухать после пережатия селезеночной вены из-за перегруженности буфера.
    3. Налейте 5 мл подготовленные теплым HBSS (+) с коллагеназы типа X 100 мм Петри в конце процесса перфузии.
    4. Отрежьте перфузии печени от остальной части тела перед остановкой насос, чтобы избежать обратного потока крови в печени, удаления желчного пузыря, щипцов, а затем протрите печени нежно с бумажным полотенцем для удаления крови.
    5. Передать печени Петри, которая содержит 5 мл подготовленные теплым HBSS (+) и удаления печени капсула, аккуратно с помощью прямой наконечником щипцы.
      Примечание: Капсулы печени является тонкий слой соединительной ткани, что окружающие печени.
    6. Разогнать Паренхиматозный тканей тщательно, используя пинцет. Добавить 15 мл холодной среде DMEM на Петри блюдо.
      Примечание: Средство превратит облачно благодаря Паренхиматозный клетки если печени хорошо усваивается.
    7. Встряхнуть разорванный печени осторожно, чтобы выпустить остаточное Паренхиматозный клетки в среду и добавить еще один 15 мл холодной DMEM на Петри блюдо для получения остальной части клетки.
    8. Передача DMEM с растворенными печени через 100 мкм ячейки сита в 50 мл Конические трубки и держать во льду.
  4. Очистка
    1. Центрифуга суспензию клеток на 60 x g на 2 мин при температуре 4 ° C, тщательно удалить супернатант, вакуум-аспирации и Ресуспензируйте гранулы в 10 мл DMEM.
    2. Добавить ресуспензированы гранулы как тонким слоем на вершине 40% плотности градиента буфер и центрифуги на 800 x g 10 мин без тормозов в 4° C.
    3. Тщательно удалить супернатант, включая верхний слой (DMEM) и средний слой (мертвых или не Паренхиматозный клетки), но не нижнего слоя (гранулы: первичный Паренхиматозный гепатоцитов).
    4. Ресуспензируйте Главные ячейки с 2 – 3 мл Уильям средних E и передать новый Тюбик 50 мл, чтобы избежать загрязнения мертвых клеток на стенке трубки.
    5. Добавление 7-8 мл Уильям среднего E, осторожно перемешать и центрифуги на 800 x г за 1 мин при 4 ° C.
    6. Тщательно удалить супернатант, вакуум-аспирации и затем Ресуспензируйте Пелле снова с 10, 20 или 30 мл среды E Уильяма (в зависимости от размера гранул).
    7. Подсчет ячеек с помощью счетчика автоматизированные ячейки.
    8. Семена с средних Уильяма Е, Держите пластины в инкубаторе 37° C в течение 2-3 ч, затем заменить средний with10% среднего FBS DMEM с анти анти для удаления мертвых или неприсоединенной клеток и для ночи инкубации при температуре 37 ° C.
    9. На следующий день мыши гепатоцитов готовы для экспериментального использования.

2. химио селективный лигирование реакции Assay для обнаружения зарождающейся белкового синтеза

  1. Метаболические маркировки
    1. (Предварительная обработка) Вымойте первичной гепатоцитов с 37 ° C теплой PBS дважды и добавить запасы метионин бесплатно DMEM среднего за 30 мин до разрушающим цитоплазматических метионина.
      Примечание: L-Azidohomoalanine, аминокислоты и аналого-метионина, содержит azido части молекулы, которые могут быть включены в белков во время биосинтеза клеточных белков, так что истощение цитоплазматических метионина повысит кормления и включение от L-Azidohomoalanine в вновь синтезируемых белков культивировали первичной гепатоцитов.
    2. (Лечение) Мойка первичного гепатоцитов с 37 ° C теплая PBS дважды и добавить средство DMEM метионин бесплатно с 25 мкм AHA (L-Azidohomoalanine) для 4-6 ч.
    3. Добавьте любые конкретные химические (т.е. 10 мкм ротенон) в средстве для 4-6 ч в присутствии Ана для того, чтобы изучить ее влияние на уровнях выражения протеина нарождающейся.
    4. После инкубации удалите средство, вакуум-аспирации и мыть первичной гепатоцитов с холодной PBS три раза.
    5. Добавить 200 мкл буфера lysis к пластине и Инкубируйте 15-30 минут на льду, затем наклонить тарелку и принимать клеточных lysate в 1,7 мл трубку.
      Примечание: Вы должны соблюдать что lysate клетки очень важно во время сбора урожая клеток.
    6. Sonicate lysate клетки на льду для 5 s три раза с помощью зонда sonicator чтобы солюбилизировать протеины последнего и дисперсных ДНК.
    7. Вихревой ячейки lysate за 5 мин, центрифуга lysate на 21,130 x g 10 мин на 4 oC ячейки, а затем передать ясно супернатант в новой трубки. Измерьте концентрацию белка дважды.
      Примечание: На данном этапе, образцы протеина могут храниться при температуре-20 ° C в течение двух недель если они не используются немедленно.
  2. Маркировка азид модифицированные зарождающейся белка
    1. Подготовка компонентов (A + B), добавив 60 мкл компонент (A) компонент (B).
      Примечание: Решение превращается в яркий розовый цвет после добавления компонента (A) (B).
    2. Подготовьте буферов (D) и (E) в соответствии с протоколом.
    3. Возьмите 20 – 40 мкг клеток lysate и добавьте 50 мкл 2 x буфер реакции (компонент A + B), затем отрегулируйте громкость до 80 мкл, добавляя DDW и вихревые для 5 s.
    4. Добавить 5 мкл CuSO4 (компонент C) и вихрь 5 s.
    5. Добавьте 5 мкл буфера реакции добавка 1 (свежеприготовленные компонента D), затем Вортекс для 5 s и ждать 3 мин.
    6. Добавьте 10 мкл воссоздана реакции буфера добавка 2 (компонент E), затем Вортекс для 5 s и поворот образцов для 20 минут при температуре 4 ° C с помощью Мульти-ротатор машины.
      Примечание: Решение превращается в яркий оранжевый цвет после добавления компонента (E). Образцы должны быть защищены от света во время вращения.
    7. Добавить 300 мкл метанола и вихревые для 5 s, добавьте 75 мкл хлороформе и вихревые для 5 s, затем добавить 200 мкл DDW и вихревые для 5 s.
    8. Центрифугуйте образцы на 21,130 x g и 4° C за 5 мин, затем отменить водный супернатант и держать гранулы.
    9. Добавить 250 мкл метанола в трубки, вихрь и спина снова за 5 минут на 21,130 x g.
    10. Отменить супернатанта, затем накрыть образцы безворсовой салфеткой и гранулы высохнуть в течение 15 минут при комнатной температуре.
  3. Анализ страницы и Западный blotting
    1. Солюбилизировать последнего Пелле в 20 мкл загрузки буфера без β-меркаптоэтанол, вихревые за 10 мин, тепла при 70 ° C с помощью блока тепла на 10 мин. Затем загрузите образцы в 10% геля SDS (1,5 мм) для обнаружения тетраметилродамина (ТАМРА).
    2. Определения AHA сигнала с помощью переменной режим лазерный сканер для точный количественный зарождающейся белков.
    3. Промойте гель с DDW за 15 мин.
    4. Затем пятно 10% гель SDS с реактивом быстро и чувствительных Кумасси краситель для 15-60 мин для определения общего белка как элемент управления.
    5. Снять пятно гель с DDW для 1-2 ч и приобрести изображение с помощью флуоресценции УФ-формирователь изображения.

Результаты

Основная мышь гепатоцитов изоляции приводит к урожайности приблизительно 20 х 106 всего клетки мыши. Гистологически живой и придает первичной гепатоцитов появляются полигональные или типичные гексагональной формы с четко изложены мембранное границы после 24 ч ин...

Обсуждение

Хотя несколько увековечен печеночных клеток линии были предложены и использованы для изучения функции печени49,50,51,52, эти клетки, как правило, недостает важных и основополагающих функции нормальной гепатоцитов, таки?...

Раскрытие информации

Авторы указывают, что они имеют без конфликта интересов.

Благодарности

Мы благодарим Drs. Joonbae Seo и Вивиан Hwa за их научного вклада и обсуждения. Эта работа была поддержана Национальным институтом здравоохранения (НИЗ) (R01DK107530). Т.н. была поддержана ПРЕСТО из Японии науки и техники Агентство. В рамках этого исследования была поддержана гранта NIH (P30DK078392) для пищеварительной заболеваний исследовательский центр Core в Цинциннати.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
HEPES bufferFisher ScientificBP310-500
D-glucoseFisher ScientificD16-500
Ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-tetraacetic acidAmericanBioAB00505-00025
Antibiotic-Antimycotic (100x)Gibco15240-062
HBSS (10x) no calcium, magnesium, phenol redGibco14185-052
Calcium Chloride Dihydrate (CaCl2.2H2O)Fisher ScientificC79-500
Density gradient bufferGE Healthcare17-0891-02
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) low glucose, pyruvateGibco11885-084
Fetal Bovine SerumHycloneSH30910.03
Phosphate Buffered Saline (PBS) (1x)Gibco1897141
Williams medium E, no glutamineGibco12551-032
L-alanyl-L-glutamine dipeptide supplementGibco35050-061
Collagenase Type XWako Pure Chemical Industries039-17864
Perfusion pumpCole-ParmerMasterflex L/SEquipment
IV administration setEXELINT29081Equipment
A water bathREVSCIRS-PB-200Equipment
Tube heaterFisher ScientificIsotempEquipment
EthanolDecon Lab, Inc0-39613
IsofluranePHOENIX10250
Autoclaved Cotton TipsFisherbrand23-400-124
100 mm Petri DishTPP93100
Connector (Male Luer Lock Ring)Cole-Parmer instrumentEW-4551807
24 G cathetersTERUMOSurflo 24Gx3/4'
100 μm Filter (CELL STRAINERS)VWR10199-658
15 mL conical-bottom centrifuge tubesVWR89039-666
50 mL conical-bottom centrifuge tubesVWR89039-658
Chemoselective ligation reaction PROTEIN ANALYSIS DETECTION KIT, TAMRA ALKYNEInvitrogenC33370
AHA (L-azidohomoalanine)InvitrogenC10102
DMEM (methionine free)Gibco21013024
L-Cystine DihydrochlorideSIGMAC2526
Laemmli sample bufferBioRad161-0737
Protease Inhibitor CocktailSIGMAP9599
SDS solution (20%)BioRad161-0418
Tris-HCL (1M)American BioanalyticalAB14044-01000
Phosphatase Inhibitor CocktailSIGMAP5726
Protein concentration measuring Kit (Bovin Serum Albumin-BSA)BioRad500-0207
6-well tissue culture plateTPP92006
Digital HeatblockVWR12621-092Equipment
Multi-RotatorGrant-bioPTR-60Equipment
Ultrasonic SonicatorCole-ParmerGE130PBEquipment
Standard Heavy-Duty Vortex MixerVWR97043-566Equipment
A variable mode laser scannerGE Healthcare Life ScienceFLA 9500Equipment
Coomassie-dye reagentThermo Scientific24594
Inverted microscopeOlympusCKX53Equipment
Western Blotting apparatusBioRad1658004Equipment
CentrifugeEppendorf5424REquipment
Automated cell counterBioRadTC20Equipment
FluorChem R systemproteinsimple-Equipment
p-Ampka (T172) antibodyCell signaling2535
Total-AMPK antibodyCell signaling5832
Albumin antibodyCell signaling4929
beta actin antibodySanta Cruzsc-130656
Fine scissors and forceps

Ссылки

  1. Forbes, R. M., Cooper, A. R., Mitchell, H. H. The composition of the adult human body as determined by chemical analysis. Journal of Biological Chemistry. 203, 359-366 (1953).
  2. Charlton, M. R. Protein metabolism and liver disease. Baillieres Clinical Endocrinology and Metabolism. 10, 617-635 (1996).
  3. De, F. P., Lucidi, P. Liver protein synthesis in physiology and in disease states. Current Opinion in Clinical Nutrition and Metabolic Care. 5, 47-50 (2002).
  4. Stoll, B., Gerok, W., Lang, F., Haussinger, D. Liver cell volume and protein synthesis. Biochemical Journal. 287 (Pt 1), 217-222 (1992).
  5. Brown, G. C. Control of respiration and ATP synthesis in mammalian mitochondria and cells. Biochemical Journal. 284 (Pt 1), 1-13 (1992).
  6. Buttgereit, F., Brand, M. D. A hierarchy of ATP-consuming processes in mammalian cells. Biochemical Journal. 312 (Pt 1), 163-167 (1995).
  7. Morrison, C. D., Laeger, T. Protein-dependent regulation of feeding and metabolism. Trends in Endocrinology and Metabolism. 26, 256-262 (2015).
  8. Bernardi, M., Ricci, C. S., Zaccherini, G. Role of human albumin in the management of complications of liver cirrhosis. Journal of Clinical and Experimental Hepatology. 4, 302-311 (2014).
  9. Abbasi, A., et al. Liver function tests and risk prediction of incident type 2 diabetes: evaluation in two independent cohorts. PLoS. One. 7, e51496 (2012).
  10. Schmidt, M. I., et al. Markers of inflammation and prediction of diabetes mellitus in adults (Atherosclerosis Risk in Communities study): a cohort study. Lancet. 353, 1649-1652 (1999).
  11. Stranges, S., et al. Additional contribution of emerging risk factors to the prediction of the risk of type 2 diabetes: evidence from the Western New York Study. Obesity (Silver Spring). 16, 1370-1376 (2008).
  12. Jin, S. M., et al. Change in serum albumin concentration is inversely and independently associated with risk of incident metabolic syndrome. Metabolism. 65, 1629-1635 (2016).
  13. Sluis, B., Wijers, M., Herz, J. News on the molecular regulation and function of hepatic low-density lipoprotein receptor and LDLR-related protein 1. Current Opinion in Lipidology. 28, 241-247 (2017).
  14. Viollet, B., et al. Activation of AMP-activated protein kinase in the liver: a new strategy for the management of metabolic hepatic disorders. Journal of Physiology. 574, 41-53 (2006).
  15. Li, H., Lee, J., He, C., Zou, M. H., Xie, Z. Suppression of the mTORC1/STAT3/Notch1 pathway by activated AMPK prevents hepatic insulin resistance induced by excess amino acids. Amerian Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 306, E197-E209 (2014).
  16. Qian, S. B., et al. mTORC1 links protein quality and quantity control by sensing chaperone availability. The Journal of Biological Chemistry. 285, 27385-27395 (2010).
  17. Carling, D. The AMP-activated protein kinase cascade--a unifying system for energy control. Trends in Biochemical Sciences. 29, 18-24 (2004).
  18. Hardie, D. G., Scott, J. W., Pan, D. A., Hudson, E. R. Management of cellular energy by the AMP-activated protein kinase system. FEBS Letters. 546, 113-120 (2003).
  19. Li, H., et al. AMPK activation prevents excess nutrient-induced hepatic lipid accumulation by inhibiting mTORC1 signaling and endoplasmic reticulum stress response. Biochimica et Biophysica Acta. 1842, 1844-1854 (2014).
  20. Proud, C. G. Role of mTOR signalling in the control of translation initiation and elongation by nutrients. Current Topics in Microbiology and Immunology. 279, 215-244 (2004).
  21. Sarbassov, D. D., Ali, S. M., Sabatini, D. M. Growing roles for the mTOR pathway. Current Opinion in Cell Biology. 17, 596-603 (2005).
  22. Reiter, A. K., Bolster, D. R., Crozier, S. J., Kimball, S. R., Jefferson, L. S. Repression of protein synthesis and mTOR signaling in rat liver mediated by the AMPK activator aminoimidazole carboxamide ribonucleoside. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 288, E980-E988 (2005).
  23. Cheng, S. W., Fryer, L. G., Carling, D., Shepherd, P. R. Thr2446 is a novel mammalian target of rapamycin (mTOR) phosphorylation site regulated by nutrient status. Journal of Biological Chemistry. 279, 15719-15722 (2004).
  24. Howell, J. J., et al. Metformin Inhibits Hepatic mTORC1 Signaling via Dose-Dependent Mechanisms Involving AMPK and the TSC Complex. Cell Metabolism. 25, 463-471 (2017).
  25. Inoki, K., Zhu, T., Guan, K. L. TSC2 mediates cellular energy response to control cell growth and survival. Cell. 115, 577-590 (2003).
  26. Wilkening, S., Stahl, F., Bader, A. Comparison of primary human hepatocytes and hepatoma cell line Hepg2 with regard to their biotransformation properties. Drug Metabolism Disposition. 31, 1035-1042 (2003).
  27. Li, A. P., et al. Present status of the application of cryopreserved hepatocytes in the evaluation of xenobiotics: consensus of an international expert panel. Chemico-Biology Interactaction. 121, 117-123 (1999).
  28. Hengstler, J. G., et al. Cryopreserved primary hepatocytes as a constantly available in vitro model for the evaluation of human and animal drug metabolism and enzyme induction. Drug Metabolism and Reviews. 32, 81-118 (2000).
  29. Olsavsky, K. M., et al. Gene expression profiling and differentiation assessment in primary human hepatocyte cultures, established hepatoma cell lines, and human liver tissues. Toxicology and Applied Pharmacology. 222, 42-56 (2007).
  30. Shen, L., Hillebrand, A., Wang, D. Q., Liu, M. Isolation and primary culture of rat hepatic cells. Journal of Visualized Experiments. , (2012).
  31. Li, Y., Cai, S., Zhang, L., Li, X. Simultaneous isolation and primary culture of rat hepatocytes, hepatic stellate cells, Kupffer's cells and hepatic sinus endothelial cells. Nan. Fang Yi. Ke. Da. Xue. Xue. Bao. 34, 532-537 (2014).
  32. Edwards, M., Houseman, L., Phillips, I. R., Shephard, E. A. Isolation of mouse hepatocytes. Methods in Molecular Biology. 987, 283-293 (2013).
  33. Schreiber, G., Schreiber, M. The preparation of single cell suspensions from liver and their use for the study of protein synthesis. Subcellular Biochemistry. 2, 307-353 (1973).
  34. Klaunig, J. E., Goldblatt, P. J., Hinton, D. E., Lipsky, M. M., Trump, B. F. Mouse liver cell culture. II. Primary culture. In Vitro. 17, 926-934 (1981).
  35. Puviani, A. C., Ottolenghi, C., Tassinari, B., Pazzi, P., Morsiani, E. An update on high-yield hepatocyte isolation methods and on the potential clinical use of isolated liver cells. Comparative Biochemistry and Physiology A Molecular and Integrative Physiology. 121, 99-109 (1998).
  36. Park, K. H., Song, S. C. Morphology of spheroidal hepatocytes within injectable, biodegradable, and thermosensitive poly(organophosphazene) hydrogel as cell delivery vehicle. Journal of Biosciences and Bioengineering. 101, 238-242 (2006).
  37. Li, K., et al. Improved performance of primary rat hepatocytes on blended natural polymers. Journal of Biomedicine and Material Research Part A. 75, 268-274 (2005).
  38. Battle, T., Stacey, G. Cell culture models for hepatotoxicology. Cell Biology Toxicology. 17, 287-299 (2001).
  39. Kravchenko, L., Petrenko, A., Shanina, I., Fuller, B. A simple non-enzymatic method for the isolation of high yields of functional rat hepatocytes. Cell Biology International. 26, 1003-1006 (2002).
  40. Berry, M. N., Grivell, A. R., Grivell, M. B., Phillips, J. W. Isolated hepatocytes--past, present and future. Cell Biology and Toxicology. 13, 223-233 (1997).
  41. Jiang, Q. D., et al. Isolation and identification of bovine primary hepatocytes. Genetics and Molecular Research. 12, 5186-5194 (2013).
  42. Pertoft, H., Laurent, T. C., Laas, T., Kagedal, L. Density gradients prepared from colloidal silica particles coated by polyvinylpyrrolidone (Percoll). Analytical Biochemistry. 88, 271-282 (1978).
  43. Lipford, G. B., Feng, Q., Wright, G. L. A method for separating bound versus unbound label during radioiodination. Analytical Biochemistry. 187, 133-135 (1990).
  44. Mukai, T., et al. In-vivo evaluation of indium-111-diethylenetriaminepentaacetic acid-labelling for determining the sites and rates of protein catabolism in mice. Journal of Pharmacy and Pharmacology. 51, 15-20 (1999).
  45. Wilson, M. S. C., Saiardi, A. Importance of Radioactive Labelling to Elucidate Inositol Polyphosphate Signalling. Topics in Current Chemistry. 375, 14 (2017).
  46. Rostovtsev, V. V., Green, L. G., Fokin, V. V., Sharpless, K. B. A stepwise huisgen cycloaddition process: copper(I)-catalyzed regioselective "ligation" of azides and terminal alkynes. Angewandte Chemie International Edition. 41, 2596-2599 (2002).
  47. Banerjee, P. S., Ostapchuk, P., Hearing, P., Carrico, I. S. Unnatural amino acid incorporation onto adenoviral (Ad) coat proteins facilitates chemoselective modification and retargeting of Ad type 5 vectors. Journal of Virology. 85, 7546-7554 (2011).
  48. Hou, W. L., et al. Inhibition of mitochondrial complex I improves glucose metabolism independently of AMPK activation. Journal of Cell Molecular Medicine. 22, 1316-1328 (2018).
  49. Davalos, A., et al. miR-33a/b contribute to the regulation of fatty acid metabolism and insulin signaling. Proceedings of the National Academy of Science. , 9232-9237 (2011).
  50. DiPersio, C. M., Jackson, D. A., Zaret, K. S. The extracellular matrix coordinately modulates liver transcription factors and hepatocyte morphology. Molecular and Cellular Biology. 11, 4405-4414 (1991).
  51. Xu, L., et al. Human hepatic stellate cell lines, LX-1 and LX-2: new tools for analysis of hepatic fibrosis. Gut. 54, 142-151 (2005).
  52. Yang, L., Li, P., Fu, S., Calay, E. S., Hotamisligil, G. S. Defective hepatic autophagy in obesity promotes ER stress and causes insulin resistance. Cell Metabolism. 11, 467-478 (2010).
  53. Heinz, S., et al. Mechanistic Investigations of the Mitochondrial Complex I Inhibitor Rotenone in the Context of Pharmacological and Safety Evaluation. Science Reports. 7, 45465 (2017).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

140AMPKL Azidohomoalanine

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены