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요약

여기, 우리는 건강 하 고 기능적인 기본 마우스 hepatocytes의 격리에 대 한 프로토콜을 제시. 비 방사성 라벨 기판 간 초기 단백질 합성을 탐지 하기 위한 지침에에서 에너지 대사 항상성의 맥락에서 단백질 합성을 기본 메커니즘을 이해할 수 있도록 제공 되었다.

초록

Hepatocytes 간 parenchymal 세포 고 합성 및 조직의 에너지 항상성에 필수적인 단백질의 분 비를 포함 한 여러 대사 기능을 갖습니다. 기본 hepatocytes murine 간에서 고립 된 간에서 발생 하는 변경 또는 기능 속성을 이해 하는 귀중 한 생물 도구를 구성 합니다. 여기 우리는 2 단계 콜라 관류 기법을 수행 하 여 기본 마우스 hepatocytes의 문화와 격리 하는 방법을 설명 하 고 단백질 대사 조사에 대 한 그들의 사용을 토론. 성인 마우스의 간은 순차적으로 에틸렌 글리콜-두번째 tetraacetic 산 (EGTA)와 콜라, hepatocytes 밀도 그라데이션 버퍼의 다음 끼얹는다. 이러한 격리 hepatocytes 문화 접시에 가능한 고 hepatocytes의 부여 특성의 대부분을 유지 한다. 이러한 hepatocytes 단백질 대사 비 방사성 시 약으로 초기 단백질 합성 등의 평가 대 한 사용할 수 있습니다. 우리는 격리 hepatocytes 쉽게 제어 하 고 구성 하는 단백질 합성 Tetramethylrhodamine (TAMRA) 단백질으로 항 암 치료-선택적 결 찰 반응을 이용 하 여 에너지 대사에 연결의 높은 품질과 볼륨 안정성을 보여 탐지 방법 그리고 서쪽 더 럽 히 분석입니다. 따라서,이 방법은 간 초기 단백질 합성에 에너지 항상성 연결을 조사 하는 데 유용 합니다. 다음 프로토콜 재료와 높은-품질 기본 마우스 hepatocytes의 격리 및 초기 단백질 합성의 검출을 위한 방법을 설명합니다.

서문

단백질 중요 한 영양 요소 이며 인체의 건조 중량의 약 50%는 여러 생물 학적 특성과 기능1단백질으로 구성 되어 있습니다. 따라서, 단백질 합성은 대부분 에너지 소모 이벤트 중 하나 이며 단백질 대사에 변경 매우 개발과 관련 된 대사 질환2,,34를 포함 하 여 질병의. 총 에너지 소비5,6의 약 20-30%는 간 단백질 생 합성을 차지 하 고. 또한, 단백질 기능 뿐만 아니라 수동 또는 빌딩 블록 또한 활성 신호를 중재 요인 하지만 간 침으로 또는 extracellularly7조직 물질 대사 조절 한다. 혈 청 알 부 민, 합성 고 간 및 플라즈마8에서 가장 풍부한 단백질 분 비의 감소 된 수준 2 형 당뇨병 개발9,10, 의 위험을 증가 하는 예를 들어, 11, 높은 혈 청 알 부 민 농도 변화 증후군12개발에 대 한 보호. 또한, 방해 또는 분 비 또는 막 도약 간장 단백질, 지 단백질, LDLR, 및 LRP1를 포함 하 여 콜레스테롤 항상성 조절의 인슐린 저항, 고 지 혈 증, 또는 동맥 경화 증의 발전으로 이어질 수 있습니다. 13. 따라서, 간 및 그것의 관련된 대사 합병증에 단백질 대사 장애에 관련 된 분자 pathophysiological 메커니즘의 식별에 유용할 수 있습니다 소설 약리 발견 발병 지체 또는 인슐린 저항, 당뇨병, 비알코올 지방 간 등 대사 질환 치료에 접근 한다.

단백질 합성 세포 에너지 상태에 밀접 하 게 연결 (예를들면, 단백질 합성의 신장 단계 동안 한 펩 티 드 결합의 형성 필요 4 phosphodiester 채권14) 분자 경로 감지 하 여 규제 인테르-와 intra-cellular 양분 가용성15,16. AMP 활성화 한 단백질 키 니 아 제 (AMPK) 에너지 항상성17유지 세포내 에너지 센서 중 하나입니다. AMPK는 세포 에너지 레벨 낮은 될 때 활성화 됩니다, 일단 AMPK 및 그 타겟된 기판 catabolic 경로 자극 하 여 단백질 합성18,19를 포함 하 여 동화 작용 과정을 억제 기능. 단백질 합성의 규칙은 여러 번역 요인과 ribosomal 단백질20의 인 산화에 의해 중재 됩니다. 메모의 포유류의 대상이 rapamycin 복잡 한 1 (mTORC1), 단백질 합성의 주요 드라이버 AMPK21의 주요 목표 중 하나입니다. MTORC1 통로의 활성화는 자극 단백질 번역과 autophagy20,21여 세포 성장과 확산을 향상 시킵니다. 따라서, AMPK의 활성화가 중재 하는 mTORC1 단백질 합성22를 억제할 수 있는 논리적 이다. 사실, AMPK의 활성화 중화 하 고 직접 트레오닌 잔류물 2446 (Thr2446)의 비활성화23 및 단백질 생 합성24의 억제에 mTORC1 phosphorylates. 또한, AMPK 수 직접 억제 하지 인 산화 그리고 활성화의 결 절 경화 증 복합 2 (TSC2)25 mTORC1 신호 폭포의 상류 레 귤 레이 터는 mTORC1 기능. 즉, 이러한 경로에 dysregulation 종종 대사 질환의 발전에 연결 되어, 따라서 에너지의 규정에 이러한 통로의 역할을 조사 하기 위해 효과적인 실험 도구를 설치 하는 중요 한 필요 하 고 hepatocytes에 단백질 대사입니다.

고립 된 기본 hepatocytes의 기능적 속성과 vivo에서 hepatocytes 보다 생체 외에서 간 파생 셀 라인26,,2728와 사이 강한 유사성이 있다. 그것은 보였다 주 인간의 hepatocytes 간 biopsies의 77% 유사성을 공유 HepG2 세포를 잘 분화 된 간 암 세포는 간 기능을 조사 하기 위해 널리 사용 되의 맥락에서 48% 미만 표시 하는 반면 유전자 발현29프로필. 따라서, 불멸 하 게 문화 셀, 보다는 오히려 기본 hepatocytes, 활용의 중요 간 기능과 생리학, 조사 이며 여러 프로토콜 분리와 기본 hepatocytes의 문화에 대 한 사용할 수 있습니다. 특히 쥐30,31에서 쥐 hepatocytes 셀의 상대적으로 높은 수익률으로 유용한 동안, 마우스 hepatocytes 유전자 변조 된 쥐의 넓은 가용성 때문에 많은 과학적 측면에서 큰 잠재력을 있다. 그러나, 세포 및 분자 기반 평가 대 한 마우스에서 건강 하 고 풍부한 기본 hepatocytes 격리에 여러 기술 도전이 있다: 첫째, 버퍼 시 약으로 간 perfuse에 캐 뉼 러 삽입은 매우 처리 하기 어려운 작고 얇은 마우스 문맥 또는 열 등 한 베 나 정 맥; 둘째, 격리 하는 동안 세포의 더 긴 조작 시간을 일으킬 수 있습니다 감소 셀 수량 및 품질; 셋째, 효소 비 기계적 분리 방법 심각한 손상 하 고 가능한 격리 기본 hepatocytes32,33의 낮은 수익률을 생산할 수 있습니다. 1980 년대, 콜라 관류 기술 hepatocytes 동물34의 간은에서 격리 하기 위한 도입 되었습니다. 이 메서드는 간35,,3637, 칼슘 chelator 솔루션38,39, 효소 소화와 간 주입의 콜라 관류에 기반 하 고 간 실질35의 기계적 분리. 첫 번째 단계에서 마우스 간은 칼슘 [Ca2 +] 무료 버퍼를 포함 하는 [캘리포니아2 +] chelator (ethylenediamine tetraacetic 산, EDTA) 끼얹는다. 두 번째 단계에서 마우스 간 세포-기질 상호 작용은 하 콜라 포함 된 버퍼와 함께 끼얹는다는. 1 단계에서 사용 되는 버퍼와는 달리 [캘리포니아2 +] 두 번째 단계의 버퍼에서 이온의 존재는 효과적인 콜라 활동, 후 소화 간 더 부드럽게 그리고 기계적으로 분리 될 사이 집게를 사용 하는 필요는 간장 캡슐 그리고 parenchymatous 조직입니다. 마지막으로, 결합 조직, 필터링 하 여 제거 되 고 후속 원심 분리 가능한 hepatocytes에서 모두 비 parenchymal 세포 및 비-생활 hepatocyte 밀도 그라데이션 버퍼40,41 사용 42. 현재 연구에서 우리는 기본 hepatocytes에서 단백질 합성의 분석에 대 한 마우스 간 격리 수정된 2 단계 콜라 관류 기술을 보여줍니다.

단백질의 radiolabeling 널리 이용 된다 계량 식 레벨, 이직 률, 방사능44의 탐지의 높은 감도 때문에 단백질43 의 생물 분포 결정 하. 그러나, 방사성 동위 원소를 사용 하 여 매우 제어 연구 상황 및 절차45를 요구 한다. 다른 비 방사능 방법 개발 되었습니다 하 고 점점 더 인기를 얻고 있다. Tetramethylrhodamine (TAMRA) 단백질 검출 방법으로 항 암 치료-선택적 결 찰 반응 그들 중 하나 이며 사이 아 지 드와 alkyne 그룹46와 같은 휴대 전화 이벤트를 분석 하는 이용 될 수 있는 선택적 항 암 치료 반응에 따라 초기 단백질 합성 및 glycoproteins 수정 아 지 드 그룹의 하위 클래스를 감지 합니다. 초기 단백질 합성에 대 한 L-Azidohomoalanine (L-아 하, 아 지 드 수정 아미노산) 수 metabolically 단백질에 통합 되며 TAMRA 단백질 검출 방법47를 사용 하 여 감지. 기본 마우스 hepatocytes에서이 분석 결과 사용 하 여 우리 초기 단백질 합성 속도 미토 콘 드리 아에서 ATP의 가용성에 밀접 하 게 연결 되어 표시 및 AMPK 활성화 (그림 1).

요약 하자면, 기본 마우스 hepatocytes의 활용 조사 단백질 및 에너지 대사에 중요 한 이며 초기 단백질 합성 측정 경로 개발에 관련 된 생리 적 역할에 대 한 통찰력을 확보 하는 데 유용 하 고 hepatocyte 관련 된 질병의 치료입니다.

프로토콜

이 프로토콜에는 실험실 쥐를 사용 하 여를 포함 되어 있습니다. 동물 관리 및 실험 절차는 신시내티 아동 병원 의료 센터의 동물 보호 위원회에 의해 승인 절차에 따라 수행 했다.

1입니다. 기본 마우스 Hepatocytes의 격리

  1. 사전 격리 준비
    1. 표 1 및 4 ° C (15 mL/마우스)에서 계속에 설명 된 대로 40% 밀도 그라데이션 버퍼의 450 mL를 준비 합니다.
    2. 표 1 에 설명 된 대로 윌리엄스 매체의 500 mL를 준비 하 고 4 ° c.에 계속
    3. 표 1 에 설명 된 대로 DMEM의 500 mL를 준비 하 고 얼음 (30 mL/마우스)에 계속.
    4. 표 1 과 물 탕 (40 mL/마우스)에서 42 ° C에서 유지에 설명 된 대로 HBSS (-) 버퍼의 500 mL를 준비 합니다.
    5. 물 목욕에서 42 ° C에서 30 분 외피와 함께 표 1 에 설명 된 대로 HBSS (+) 0.3 mg/mL와 버퍼의 500 mL 콜라 유형 X 준비 (40 mL/마우스).
    6. 래칭 발 페달에 걸쳐 정 맥 (테타) 관리 튜브를 배치 하 여 및 기포 없이 솔루션을 내 뿜 기의 흐름을 확인 하 여 재 관류 펌프를 설정 합니다.
    7. 워밍업-42에서 튜브 히터° c.
    8. 진정 4 ° c 원심 분리기 기계
  2. 마 취와 관류
    1. 작업 영역 및 펌프 청소.
    2. 철저 하 게 10 분 동안 70% 에탄올을 실행 하 여 펌프 연결 IV 관을 씻어.
    3. 10 분 동안 완전히 DDW와 rinsing 하 여 펌프 연결 4 관에서 잔여 에탄올을 제거 합니다.
    4. 70% 에탄올과 집게와가 위를 닦아냅니다.
    5. 플라스틱 용기와 직접 접촉을 피하기 위해 메쉬 밑 2 mL isoflurane 젖은 거 즈 메쉬 바닥에 마우스를 놓습니다.
    6. 엉덩이 페달 반사 (회사 발가락 핀치)에 의해 마 취의 깊이.
    7. 마 취의 원하는 깊이 도달 하면 마우스를 제거 합니다.
      참고: 마 취 유도 시간의 1 분 이상 수 없습니다.
    8. 코 콘 1 mL isoflurane 젖은 패드는 튜브의 끝에 15 mL 원뿔 튜브를 사용 하 여 구성 합니다.
    9. 가까이 또는 마우스 콧구멍에서 코 콘을 이동 하 여 마 취의 깊이 제어 합니다.
    10. 복 부 면이 위로 향하도록 작업 플랫폼에 마우스를 놓습니다.
    11. 마우스의 복 부 지역에 70% 에탄올을 스프레이 한 다음 이빨된 집게 날카로운가 위를 사용 하 여 진 피와 복 막의 큰 가로 절 개 하 여 복 부 구멍을 엽니다.
    12. 모든 복 부 장기는 날카로운가 위 이빨된 집게를 사용 하 여 완전히 노출 될 때까지 다음, 복 층의 수직 컷을 확인 합니다.
    13. 작은 이동 및 압력가 면 팁까지 간, 문맥, 그리고 열 등 한 베 나 정 맥 (IVC) 마우스의 왼쪽을 향해 큰 창 자 명확 하 게 노출 됩니다.
    14. 24 G 카 테 터에 삽입 IVC 오른쪽 신장 정 맥을 분기에 신중 하 게 IVC 및 출혈의 부상을 피하기 위해 악수 하지 않고.
      참고: 경우 출혈 IVC로 카 테 터를 삽입 하는 동안, 그럼 당신은 하려고 한다 포털 정 맥에 새로운 카 테 터를 삽입.
    15. 카 테 터의 바늘을 제거 하 고 IVC, 아웃 되지 않도록 정 맥의 위치 제어 다음 24 G 정 관류 튜브 커넥터를 사용 하 여 연결.
      참고:은 재 관류를 시작 하기 전에 공기 방울의 존재를 피하십시오.
    16. 4 mL/min의 유량에 따뜻한 HBSS (-)와 함께 간의 관류를 시작 하 고 신속 하 게가 위를 사용 하 여 내부 혈액 밖으로 배출 하는 비장 정 맥을 잘라.
      참고:는 cannulation 성공적 이면 간 간 맥 IVC에서 버퍼의 혈 류 분포 때문에 희게 시작 됩니다. 포털 정 맥 비장 하 고 우수한 mesenteric 정 맥;의 조합에 의해 형성 된다 따라서, 그것은 이후 큰 간에서 원심 비장 정 맥을 잘라 꽤 안전입니다.
    17. 계속 따뜻한 HBSS (-)의 35 mL를 관류 한다.
      참고: 간이이 단계에서 경우는 관류, 적절 한 색상과 마우스 마 취에서 아직 살아 창백 됩니다.
  3. 소화 및 추출
    1. HBSS (+)의 따뜻한 35 mL와 4 mL/min의 유량에 콜라 유형 X를 포함 한 마우스 간 perfuse
    2. 몇 분 마다 10 ~ 집게를 사용 하 여 비장 정 맥을 클램프 HBSS 간 모든 해 부 부분으로 확산 (+)의 전체 볼륨을 허용 하는 s.
      참고: 간 버퍼 정체로 인해 비장 정 맥을 클램핑 후 팽창 하기 시작 합니다.
    3. 100 mm 페 트리 접시 관류 프로세스의 끝에에 콜라 종류 x 준비 따뜻한 HBSS (+)의 5 mL를 붓으십시오.
    4. 간으로 혈액의 역류를 방지, 집게, 여 쓸 개를 제거 하 고 혈액을 제거 하려면 종이 타월로 부드럽게 간 다음 닦아 펌프를 중지 하기 전에 시체의 나머지 부분에서 perfused 간 차단.
    5. 준비 된 따뜻한 HBSS (+)의 5 mL를 포함 하는 배양 접시에 간 전송 하 고 똑바로 밀고 집게를 사용 하 여 부드럽게 간 캡슐을 제거 합니다.
      참고: 간 캡슐 그 간 둘러싼 결합 조직의 얇은 층 이다.
    6. 집게를 사용 하 여이 신중 하 게 분산 parenchymal 조직. 15 mL을 추가 찬 DMEM 배양 접시에.
      참고: 매체가 바뀝니다 흐린 parenchymal 세포 인 간 잘 소화 하는 경우.
    7. 찢어진된 간 매체에 잔여 parenchymal 세포를 추가 하는 또 다른 15 mL를 부드럽게 흔들어 세포의 나머지를 페 트리 접시에 차가운 DMEM.
    8. 50 mL 원뿔 튜브로 100 μ 셀 스 트레이너를 통해 녹은 간 DMEM 전송 및 얼음에 계속.
  4. 정화
    1. 60 x g 4 ° C에서 2 분 동안에 세포 현 탁 액을 원심, 신중 하 게는 상쾌한 진공 포부에 의해 제거 하 고 10 ml DMEM 펠 릿 resuspend.
    2. 40% 밀도 그라데이션 버퍼, 위에 얇은 층으로 resuspended 펠 릿을 추가 하 고 4에서 800 g x 브레이크 없이 10 분에 원심° c.
    3. 하위 레이어의 하지 하지만 상쾌한 상위 레이어 (DMEM) 등 중간 레이어 (죽은 또는 비 parenchymal 세포)를 조심 스럽게 제거 (펠 렛: 기본 parenchymal hepatocytes).
    4. 2-3 mL 윌리엄의 중간 e, 1 차 셀을 resuspend 하 고 튜브의 벽에서 죽은 세포의 오염을 피하기 위하여 새로운 50 mL 튜브에 전송.
    5. 7-8 mL 윌리엄의 매체 E를 추가 하 고 부드럽게, 혼합 하 고, 4 ° c.에 1 분 동안 800 x g에서 원심
    6. 진공 포부에 의해 상쾌한을 조심 스럽게 제거 하 고 다시 윌리엄의 매체 E (에 따라 펠 릿의 크기)의 10, 20 또는 30 mL와 펠 릿 resuspend.
    7. 자동된 셀 카운터를 사용 하 여 셀을 계산.
    8. 윌리엄의 매체 E와 종자, 37에서 인큐베이터에 접시를 계속° C 2-3 h는 다음 매체 with10% FBS DMEM 매체 대체 방지 죽 었 거 나 부착 되지 않은 세포를 제거 하 고 37 ° c.에 야간 보육에 대 한
    9. 다음 날, 주 마우스 hepatocytes 실험적인 사용을 위해 준비 되어 있다.

2. 항 암 치료-선택적 결 찰 반응 분석 결과 초기 단백질 합성의 검출에 대 한

  1. 신진 대사 라벨
    1. (전처리) 37 ° C 따뜻한 PBS 가진 기본 hepatocytes를 두번 세척 하 고 세포질 메티오닌 고갈 30 분 메티오닌 무료 DMEM 매체 보유 추가.
      참고: L-Azidohomoalanine, 아미노산은 메티오닌을 아날로그, 통합 될 수 있는 단백질으로 세포 단백질의 생 합성 중 세포질 메티오닌의 고갈 먹이 향상 시킬 것입니다 그렇게 azido moiety 및 법인 포함 L-Azidohomoalanine 교양된 기본 hepatocytes의 새로 합성된 단백질으로.
    2. (치료) 37 ° c 워시 기본 hepatocytes PBS를 두 번 따뜻하게 하 고 4-6 h 25 μ M AHA (L-Azidohomoalanine)와 메티오닌 무료 DMEM 매체를 추가 합니다.
    3. 초기 단백질 표정 수준에 미치는 영향을 조사 하기 위하여 아 하의 존재에 4-6 h에 대 한 매체에서 어떤 특정 화학 물질 (즉, 10 μ M로 테 논) 추가 합니다.
    4. 부 화, 후 진공 포부에 의해 매체를 제거 하 고 씻어 차가운 PBS 가진 기본 hepatocytes 세 번.
    5. 접시 200 μ 세포의 용 해 버퍼를 추가 하 고 얼음에 15-30 분 동안 품 어 다음 접시를 기울기 하시고 전체 세포 lysate 1.7 mL 튜브에 하십시오.
      참고: 당신은 그 세포 lysate 셀 수확 하는 동안 매우 끈 적는 관찰 해야 한다.
    6. 5 얼음에 세포 lysate를 sonicate 세 번 프로브 sonicator solubilize 단백질 및 DNA 분산 사용 하 여 s.
    7. 소용돌이 5 분, lysate 셀 세포 lysate에서 21,130 x g 4 oC에서 10 분 원심 하 고 맑은 상쾌한 새로운 튜브로 전송. 두 번 단백질 농도 측정 합니다.
      참고:이 단계에서 단백질 견본 저장할 수 있습니다-20 ° C에서 2 주 동안 그들은 즉시 사용 하지 않는 경우.
  2. 아 지 드 수정 초기 단백질 라벨
    1. 60 μ의 구성 요소 (A) (B)를 추가 하 여 구성 요소 (A + B)를 준비 합니다.
      참고: 솔루션 (A)를 (B) 구성 요소를 추가한 후 색상에서 밝은 분홍색으로 변합니다.
    2. 버퍼 (D)와 (E)에 따라 준비 하는 프로토콜.
    3. 20-40 μ g 세포 lysate 고 추가 반응 버퍼 x 50 μ 2 (구성 요소 A + B), 다음 DDW 5 소용돌이 추가 하 여 80 μ에 볼륨 조정 s.
    4. 추가 5 μ CuSO4 (구성 요소 C), 그리고 5와 동 s.
    5. 5 μ 반응 버퍼 첨가제 1 (갓된 구성 D), 그리고 5 s 소용돌이 3 분 대기를 추가 합니다.
    6. 10 μ 재구성 반응 버퍼 첨가제 2 (전자 부품), 5 s에 대 한 다음 소용돌이 및 다중 회전 기계를 사용 하 여 4 ° C에서 20 분에 대 한 회전 예제를 추가 합니다.
      참고: 솔루션 구성 요소 (E)를 추가한 후 밝은 오렌지 컬러로 바뀝니다. 샘플은 회전 하는 동안 빛 으로부터 보호 되어야 한다.
    7. 추가 300 μ 메탄올과 소용돌이 5 s, 75 μ 클로 프롬 및 5 소용돌이 추가 s, 다음 200 μ DDW와 5 소용돌이 추가 s.
    8. 21,130 g x 4에서 샘플 원심° C 5 분, 다음 수성 상쾌한 삭제 하 고 펠 릿을 유지.
    9. 250 μ 메탄올 튜브, 소용돌이, 그리고 21,130 x g. 에서 5 분 동안 다시 스핀에 추가
    10. 상쾌한, 삭제 후 보풀 조직으로 샘플을 커버 하 고 실 온에서 15 분 동안 건조를 펠 릿을 허용.
  3. 페이지 분석 및 서 부 럽
    1. 10 분 동안 열 블록을 사용 하 여 버퍼 없이 β-mercaptoethanol, 10 분 동안 소용돌이, 70 ° C에서 열 로드의 20 μ에 펠 릿 solubilize 그런 다음 Tetramethylrhodamine (TAMRA) 탐지에 대 한 10 %SDS 젤 (1.5 m m)로 샘플을 로드.
    2. 초기 단백질의 정확한 정량에 대 한 가변 모드 레이저 스캐너를 사용 하 여 AHA 신호를 감지 합니다.
    3. 15 분 동안 DDW와 젤을 씻어.
    4. 그런 다음 컨트롤으로 총 단백질을 검출 하기 위하여 15-60 분에 대 한 빠르고 민감한 coomassie 염료 시 약 10 %SDS 젤 얼룩.
    5. 제 1-2 h DDW와 젤 얼룩 하 고 UV 형광 영상 장치를 사용 하 여 이미지를 획득.

결과

기본 마우스 hepatocytes 격리 약 20 x 106 총 셀/마우스의 수율에서 결과. 조직학, 라이브 및 연결 된 기본 hepatocytes 표시 다각형 또는 전형적인 육각형 모양에 명확 하 게 설명 막 경계 후에 24 시간 보육 (그림 2).

고립 된 세포 주 hepatocytes 인지를 확인 하려면 우리는 고립 된 기본 마우스 hepatocytes (PMHs), ...

토론

비록 여러 불멸 하 게 간 셀 라인 제안 되 고 간 기능49,50,,5152를 조사 하는 데 사용, 이러한 세포 일반적으로 중요 하 고 근본적인 부족 알 부 민 (그림 3)의 식 등 정상적인 hepatocytes의 기능. 그것은 널리 인식, 따라서 기본 hepatocytes 활용 하는 것이 간 생리학, 문화, 경작 하 고 이러...

공개

저자 들은 관심의 없습니다 충돌을 나타냅니다.

감사의 말

우리가 그들의 과학적인 입력 및 토론에 대 한 박사 Joonbae 서 장 훈과 비비 안 화 감사합니다. 이 작품은 국립 보건원 (NIH) (R01DK107530)에 의해 지원 되었다. T.N. 일본 과학과 기술 기관에서 프레스 토에 의해 지원 되었다. 이 연구의 일부는 소화 질병 연구 핵심 센터 신시내티에 대 한 NIH (P30DK078392)에서 교부 금에 의해 지원 되었다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
HEPES bufferFisher ScientificBP310-500
D-glucoseFisher ScientificD16-500
Ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-tetraacetic acidAmericanBioAB00505-00025
Antibiotic-Antimycotic (100x)Gibco15240-062
HBSS (10x) no calcium, magnesium, phenol redGibco14185-052
Calcium Chloride Dihydrate (CaCl2.2H2O)Fisher ScientificC79-500
Density gradient bufferGE Healthcare17-0891-02
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) low glucose, pyruvateGibco11885-084
Fetal Bovine SerumHycloneSH30910.03
Phosphate Buffered Saline (PBS) (1x)Gibco1897141
Williams medium E, no glutamineGibco12551-032
L-alanyl-L-glutamine dipeptide supplementGibco35050-061
Collagenase Type XWako Pure Chemical Industries039-17864
Perfusion pumpCole-ParmerMasterflex L/SEquipment
IV administration setEXELINT29081Equipment
A water bathREVSCIRS-PB-200Equipment
Tube heaterFisher ScientificIsotempEquipment
EthanolDecon Lab, Inc0-39613
IsofluranePHOENIX10250
Autoclaved Cotton TipsFisherbrand23-400-124
100 mm Petri DishTPP93100
Connector (Male Luer Lock Ring)Cole-Parmer instrumentEW-4551807
24 G cathetersTERUMOSurflo 24Gx3/4'
100 μm Filter (CELL STRAINERS)VWR10199-658
15 mL conical-bottom centrifuge tubesVWR89039-666
50 mL conical-bottom centrifuge tubesVWR89039-658
Chemoselective ligation reaction PROTEIN ANALYSIS DETECTION KIT, TAMRA ALKYNEInvitrogenC33370
AHA (L-azidohomoalanine)InvitrogenC10102
DMEM (methionine free)Gibco21013024
L-Cystine DihydrochlorideSIGMAC2526
Laemmli sample bufferBioRad161-0737
Protease Inhibitor CocktailSIGMAP9599
SDS solution (20%)BioRad161-0418
Tris-HCL (1M)American BioanalyticalAB14044-01000
Phosphatase Inhibitor CocktailSIGMAP5726
Protein concentration measuring Kit (Bovin Serum Albumin-BSA)BioRad500-0207
6-well tissue culture plateTPP92006
Digital HeatblockVWR12621-092Equipment
Multi-RotatorGrant-bioPTR-60Equipment
Ultrasonic SonicatorCole-ParmerGE130PBEquipment
Standard Heavy-Duty Vortex MixerVWR97043-566Equipment
A variable mode laser scannerGE Healthcare Life ScienceFLA 9500Equipment
Coomassie-dye reagentThermo Scientific24594
Inverted microscopeOlympusCKX53Equipment
Western Blotting apparatusBioRad1658004Equipment
CentrifugeEppendorf5424REquipment
Automated cell counterBioRadTC20Equipment
FluorChem R systemproteinsimple-Equipment
p-Ampka (T172) antibodyCell signaling2535
Total-AMPK antibodyCell signaling5832
Albumin antibodyCell signaling4929
beta actin antibodySanta Cruzsc-130656
Fine scissors and forceps

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