A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Method Article
* These authors contributed equally
כאן, אנו מציגים עבור בידודו של העכבר הראשי בריא ופונקציונליים hepatocytes פרוטוקול. הוראות לגילוי סינתזה של חלבון nascent הכבד על ידי המצע תיוג לא רדיואקטיבי נמסרו כדי לעזור להבין את המנגנונים שבבסיס סינתזת החלבון בהקשר של הומאוסטזיס אנרגיה-מטבוליזם בכבד.
Hepatocytes הם תאים parenchymal של הכבד וקיום מספר פונקציות מטבוליות, כולל סינתזה הפרשת חלבונים חיוניים עבור אנרגיה מערכתית הומאוסטזיס. ראשי hepatocytes בודד מהכבד מאתר מהווים כלי ביולוגי חשוב להבין את מאפייני תפקודית או שינויים המתרחשים בכבד. בזאת אנחנו מתארים שיטה הבידוד והתרבות של העכבר הראשי hepatocytes על-ידי ביצוע טכניקה זלוף collagenase שני שלבים ולדון שלהם ניצול של חוקר חלבונים. הכבד של העכבר למבוגרים ברצף perfused עם אתילן גליקול-bis tetraacetic חומצה (EGTA) ו- collagenase, ואחריו את ניתוקה של hepatocytes עם המאגר הדרגתיות צפיפות. אלה hepatocytes מבודד קיימא על תרבות צלחות, לשמור על הרוב המכריע של מאפייני hepatocytes מצויד. אלה hepatocytes יכול לשמש עבור הערכות של חלבון מטבוליזם כולל סינתזה של חלבון המתהווה עם ריאגנטים שאינו רדיואקטיבי. אנחנו מראים כי hepatocytes מבודד נשלטים בקלות, מהווים יציבות איכות ונפח גבוה יותר של סינתזת חלבונים קשורה לחילוף חומרים של אנרגיה על-ידי ניצול התגובה מצדו הכימותרפיה סלקטיבית עם חלבון Tetramethylrhodamine (טמרה) שיטת זיהוי וניתוחים המערבי סופג. לכן, בשיטה זו הוא יקר עבור חוקר סינתזה של חלבון nascent הכבד קשור אנרגיה הומאוסטזיס. להלן כללי התנהגות מתווה של חומרים ושיטות על בידודו של העכבר הראשי באיכות גבוהה hepatocytes וזיהוי של סינתזת חלבונים המתהווה.
חלבון הוא מרכיב תזונתי חשוב, כ-50% מהמשקל היבש של גוף האדם מורכב של חלבונים אשר יש מספר תכונות ביולוגיות, פונקציות1. כתוצאה מכך, סינתזת החלבון הוא אחד האירועים רב רוב האנרגיה, שינוי חלבון מטבוליזם קשורה מאוד להתפתחות של מחלות, כולל מחלות מטבוליות-2,-3,-4. בכבד, חלבון ביוסינטזה חשבונות עבור 20-30% מכלל האנרגיה הכוללת צריכת5,6. בנוסף, הפונקציה חלבונים לא רק פסיבי או בניית בלוקים של הכבד, אבל גורמים מתווכים-אות פעיל גם intracellularly או extracellularly כדי לווסת את חילוף החומרים מערכתית7. למשל, הפחתת רמות של אלבומין, אשר מסונתז והוא מופרש על ידי הכבד ואת החלבון הנפוץ ביותר של פלזמה8, מגביר את הסיכון של סוג 2 סוכרת פיתוח9,10, 11, ואילו ריכוז גבוה יותר של אלבומין הוא מגן מפני לפתח תסמונת מטבולית12. יתר על כן, להפריע או שיבוש חלבונים הכבד הפרשה או מאוגד-ממברנה, אשר לווסת את הכולסטרול הומאוסטזיס, לרבות lipoproteins, LDLR LRP1, יכול להוביל להתפתחות של תנגודת לאינסולין, היפרליפידמיה או טרשת עורקים 13. לכן, הזיהוי של המנגנונים המולקולריים הקשורים pathophysiological המעורבים חלבון הפרעה מטבוליזם בכבד, סיבוכים מטבוליים המשויכת שלו עשוי להיות שימושי עבור גילוי הרומן תרופתי גישות מפגר תחילת או לטפל במחלות מטבוליות כגון עמידות לאינסולין, סוכרת, כבד שומני אלכוהוליים.
סינתזה של חלבון מקושר באופן הדוק למצב האנרגיה התאית (למשל, היווצרות של קשר פפטידי אחד במהלך השלב התארכות של סינתזת חלבונים דורש phosphodiester 4 אג ח14) הוא מוסדר על ידי מסלולים מולקולריים המרגישות אינטר - ו intra - cellular זמינות חומרי הזנה15,16. מופעל כח פרוטאין קינאז (AMPK) הוא אחד חיישנים תאיים אנרגיה לשמור על הומאוסטזיס אנרגיה17. ברגע AMPK מופעל כאשר רמות האנרגיה התאית הופכים התחתון, AMPK ותערובות יישוב שלה לפעול כדי לעורר מסלולים קטבולי ומעכבות התהליכים האנאבוליים כולל חלבון סינתזה18,19. התקנון של סינתזת חלבונים מתווך על ידי זירחון של מספר חלבונים ribosomal20וגורמי תרגום. ראוי לציין, בתרבית של היעד של rapamycin 1 מורכבים (mTORC1), מנהל התקן הגדולות של סינתזת חלבונים, היא אחת המטרות המרכזיות של AMPK21. הפעלה של הנתיב mTORC1 משפר את צמיחת תאים והתפשטות על ידי גירוי חלבון autophagy ותרגום20,21. לכן זה הגיוני כי הפעלה של AMPK יכול לעכב סינתזת חלבון בתיווך mTORC122. אכן, הפעלה של AMPK מנטרל, ישירות phosphorylates mTORC1 על שאריות תראונין 2446 (חמישי2446) המוביל שלה איון23 דיכוי חלבון ביוסינטזה24. יתר על כן, AMPK בעקיפין יכול לעכב mTORC1 פונקציה על ידי זרחון והפעלה של tuberous טרשת נפוצה מורכבים 2 (TSC2)25 המהווה הרגולטור במעלה הזרם של המפל איתות mTORC1. בקיצור, dysregulation של המסלולים הללו בכבד קשורה פעמים רבות התפתחות מחלות מטבוליות, ולכן אין צורך חיוני בהקמת יעיל ניסוי כלים לחקור את התפקיד של המסלולים הללו בוויסות של אנרגיה, חלבון מטבוליזם ב hepatocytes.
יש דמיון חזק בין מאפייני hepatocytes העיקרי מבודד פונקציונלי ויוו hepatocytes מאשר עם במבחנה הכבד-derived תא קווים26,27,28. הוכח כי ראשי hepatocytes האנושי לשתף 77% דמיון עם זה של ביופסיות כבד, בעוד HepG2 תאים, אשר הינם תאים סרטניים הכבד היטב הבדיל בשימוש נרחב כדי לחקור פונקציות הכבד, להציג פחות מ- 48% בהקשר של ביטוי גנים פרופילי29. לכן, ניצול hepatocytes הראשית, יותר מאשר מונצחים התרבות תאים, הוא בעל חשיבות בחקירת תפקוד הכבד, פיזיולוגיה, מספר פרוטוקולים זמינים עבור הבידוד והתרבות של ראשי hepatocytes במיוחד של חולדות30,31. אמנם hepatocytes עכברוש שימושיים עם תשואה גבוהה יחסית של תאים, hepatocytes העכבר יש פוטנציאל גדול בהיבטים מדעיים רבים בגלל הזמינות רחב של עכברים גנטית מאופנן. עם זאת, ישנם מספר אתגרים טכניים לבודד בריא ושופע hepatocytes העיקרי של עכברים עבור הערכות סלולאריים מולקולריים מבוססות: ראשית, בצינורית ההכנסה כדי perfuse את הכבד עם ריאגנטים מאגר קשה מאוד להתמודד עם בשל וריד שער קטן ורזה העכבר או הכלילי; שנית, זמן רב יותר מניפולציה של תאים בתקופת הבידוד יכול לגרום להפחתת תא בכמות ובאיכות; שיטות הפרדה מכניות השלישי, שאינם אנזימטי יכול לגרום נזק חמור ומפיקים תשואה נמוכה של קיימא hepatocytes העיקרי מבודד32,33. בשנות ה-80, טכניקה זלוף collagenase הוצג לבידוד hepatocytes מ הכבדים של חיות34. שיטה זו מבוססת על collagenase זלוף של הכבד35,36,37, אינפוזיה של הכבד עם סידן chelator פתרון38,39, עיכול אנזימטי, דיסוציאציה מכני של הכבד parenchyma35. בשלב הראשון, כבד עכבר הוא perfused עם סידן [Ca2 +] מאגר חינם המכילה [Ca2 +] chelator (חומצה tetraacetic ethylenediamine, EDTA). בשלב השני, הכבד העכבר הוא perfused עם מאגר המכיל collagenase כדי hydrolyze את האינטראקציות מטריצה חוץ-תאית הסלולר. בניגוד המאגר המשמש בשלב אחד, הנוכחות של יונים [Ca2 +] במאגר של השלב השני נדרשת לפעילות יעילה collagenase, לאחר מכן את הכבד מתעכל יש נוספת מכנית ובעדינות יופרדו באמצעות מלקחיים בין כמוסת הכבד ורקמות parenchymatous. לבסוף, רקמת חיבור מוסר על-ידי סינון, ומפריד צנטריפוגה עוקבות hepatocytes קיימא מתאי parenchymal הן, שאינם חיים hepatocyte עם השימוש של צפיפות מאגר הדרגתיות40,41 ,42. במחקר הנוכחי, אנו מראים טכניקה זלוף collagenase שני שלבים ששונה כדי לבודד hepatocytes העיקרי של כבד עכבר לניתוח של סינתזת החלבון.
Radiolabeling של חלבונים נעשה שימוש נרחב כדי לכמת את רמות הביטוי, שיעורי מחזור, לקבוע את התפלגות הביולוגי של חלבונים43 עקב הרגישות הגבוהה של גילוי הרדיואקטיביות44. עם זאת, השימוש של איזוטופים רדיואקטיביים דורש מחקר מבוקרת מאוד הנסיבות והנהלים45. שיטות אלטרנטיביות שאינו רדיואקטיבי פותחו, יש יותר ויותר זכו לפופולריות רבה. התגובה מצדו הכימותרפיה סלקטיבית עם שיטת זיהוי החלבון Tetramethylrhodamine (טמרה) הוא אחד מהם, והוא מבוסס על התגובה הכימותרפיה סלקטיבית בין אלקין ו קבוצות46, אשר יכול להיות מנוצל כדי לנתח הסלולר אירועים כגון זיהוי סינתזה של חלבון המתהווה, מחלקות של glycoproteins ששינה עם קבוצה אזיד. סינתזה של חלבון המתהווה, L-Azidohomoalanine (L-AHA, חומצת אמינו אזיד-השתנה) יכול להיות סמויה משולבים לחלבונים, שאותרו על-ידי שימוש בשיטת47זיהוי חלבונים טמרה. על-ידי שימוש assay הזה hepatocytes העכבר הראשי, אנו מראים כי קצב סינתזת חלבון nascent בחוזקה קשורה בזמינות של ATP מ מיטוכונדריאלי AMPK ההפעלה (איור 1).
לסיכום, ניצול של העכבר הראשי hepatocytes חיוני כדי לחקור את חילוף החומרים חלבון ואנרגיה, לכימות סינתזה של חלבון nascent יקר, להשגת תובנות תפקיד פיזיולוגי המסלולים הרלוונטיים לפיתוח ו לרפא מחלות הקשורות hepatocyte.
פרוטוקול זה מכיל את השימוש עכברי מעבדה. טיפול בבעלי חיים ונהלים ניסיוני בוצעו על פי הנהלים אושרו על ידי הוועדות טיפול בבעלי חיים של המרכז הרפואי של בית החולים לילדים בסינסינטי.
1. בידוד של העכבר הראשי Hepatocytes
2. הכימותרפיה סלקטיבית מצדו Assay התגובה איתור של סינתזת חלבונים המתהווה
העכבר הראשי hepatocytes בידוד תוצאות תשואה של 20 x 106 הכולל תאים/עכבר. בהיסטולוגיה, hepatocytes העיקרי בשידור חי ומצורפים להופיע מצולע או אופייני משושה במצב עם המתוארים בבירור גבולות עלי הלוואי קרומיים לאחר דגירה 24 שעות (איור 2).
?...
למרות מספר שורות תאי הכבד מונצחים יש כבר הציע והשתמשת לחקור פונקציות הכבד49,50,51,52, תאים אלה חסרים בדרך כלל חשוב ובסיסי פונקציות של hepatocytes רגיל, כגון הביטוי של אלבומין (איור 3). זה מוכר ברבים, לכן, כי ניצול hepat...
המחברים מציינים שיש להם שאין ניגודי אינטרסים.
אנו מודים ד"ר Joonbae Seo ו ויויאן Hwa עבור קלט מדעי ודיון שלהם. עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי לבריאות (NIH) (R01DK107530). T.N. נתמכה על ידי אוטם יפן המדע, הטכנולוגיה הסוכנות. חלק של מחקר זה נתמך על ידי מענק של NIH (P30DK078392) עבור מרכז הליבה המחקר של מחלות העיכול בסינסינטי.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
HEPES buffer | Fisher Scientific | BP310-500 | |
D-glucose | Fisher Scientific | D16-500 | |
Ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-tetraacetic acid | AmericanBio | AB00505-00025 | |
Antibiotic-Antimycotic (100x) | Gibco | 15240-062 | |
HBSS (10x) no calcium, magnesium, phenol red | Gibco | 14185-052 | |
Calcium Chloride Dihydrate (CaCl2.2H2O) | Fisher Scientific | C79-500 | |
Density gradient buffer | GE Healthcare | 17-0891-02 | |
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) low glucose, pyruvate | Gibco | 11885-084 | |
Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH30910.03 | |
Phosphate Buffered Saline (PBS) (1x) | Gibco | 1897141 | |
Williams medium E, no glutamine | Gibco | 12551-032 | |
L-alanyl-L-glutamine dipeptide supplement | Gibco | 35050-061 | |
Collagenase Type X | Wako Pure Chemical Industries | 039-17864 | |
Perfusion pump | Cole-Parmer | Masterflex L/S | Equipment |
IV administration set | EXELINT | 29081 | Equipment |
A water bath | REVSCI | RS-PB-200 | Equipment |
Tube heater | Fisher Scientific | Isotemp | Equipment |
Ethanol | Decon Lab, Inc | 0-39613 | |
Isoflurane | PHOENIX | 10250 | |
Autoclaved Cotton Tips | Fisherbrand | 23-400-124 | |
100 mm Petri Dish | TPP | 93100 | |
Connector (Male Luer Lock Ring) | Cole-Parmer instrument | EW-4551807 | |
24 G catheters | TERUMO | Surflo 24Gx3/4' | |
100 μm Filter (CELL STRAINERS) | VWR | 10199-658 | |
15 mL conical-bottom centrifuge tubes | VWR | 89039-666 | |
50 mL conical-bottom centrifuge tubes | VWR | 89039-658 | |
Chemoselective ligation reaction PROTEIN ANALYSIS DETECTION KIT, TAMRA ALKYNE | Invitrogen | C33370 | |
AHA (L-azidohomoalanine) | Invitrogen | C10102 | |
DMEM (methionine free) | Gibco | 21013024 | |
L-Cystine Dihydrochloride | SIGMA | C2526 | |
Laemmli sample buffer | BioRad | 161-0737 | |
Protease Inhibitor Cocktail | SIGMA | P9599 | |
SDS solution (20%) | BioRad | 161-0418 | |
Tris-HCL (1M) | American Bioanalytical | AB14044-01000 | |
Phosphatase Inhibitor Cocktail | SIGMA | P5726 | |
Protein concentration measuring Kit (Bovin Serum Albumin-BSA) | BioRad | 500-0207 | |
6-well tissue culture plate | TPP | 92006 | |
Digital Heatblock | VWR | 12621-092 | Equipment |
Multi-Rotator | Grant-bio | PTR-60 | Equipment |
Ultrasonic Sonicator | Cole-Parmer | GE130PB | Equipment |
Standard Heavy-Duty Vortex Mixer | VWR | 97043-566 | Equipment |
A variable mode laser scanner | GE Healthcare Life Science | FLA 9500 | Equipment |
Coomassie-dye reagent | Thermo Scientific | 24594 | |
Inverted microscope | Olympus | CKX53 | Equipment |
Western Blotting apparatus | BioRad | 1658004 | Equipment |
Centrifuge | Eppendorf | 5424R | Equipment |
Automated cell counter | BioRad | TC20 | Equipment |
FluorChem R system | proteinsimple | - | Equipment |
p-Ampka (T172) antibody | Cell signaling | 2535 | |
Total-AMPK antibody | Cell signaling | 5832 | |
Albumin antibody | Cell signaling | 4929 | |
beta actin antibody | Santa Cruz | sc-130656 | |
Fine scissors and forceps |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved