JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

כאן, אנו מציגים עבור בידודו של העכבר הראשי בריא ופונקציונליים hepatocytes פרוטוקול. הוראות לגילוי סינתזה של חלבון nascent הכבד על ידי המצע תיוג לא רדיואקטיבי נמסרו כדי לעזור להבין את המנגנונים שבבסיס סינתזת החלבון בהקשר של הומאוסטזיס אנרגיה-מטבוליזם בכבד.

Abstract

Hepatocytes הם תאים parenchymal של הכבד וקיום מספר פונקציות מטבוליות, כולל סינתזה הפרשת חלבונים חיוניים עבור אנרגיה מערכתית הומאוסטזיס. ראשי hepatocytes בודד מהכבד מאתר מהווים כלי ביולוגי חשוב להבין את מאפייני תפקודית או שינויים המתרחשים בכבד. בזאת אנחנו מתארים שיטה הבידוד והתרבות של העכבר הראשי hepatocytes על-ידי ביצוע טכניקה זלוף collagenase שני שלבים ולדון שלהם ניצול של חוקר חלבונים. הכבד של העכבר למבוגרים ברצף perfused עם אתילן גליקול-bis tetraacetic חומצה (EGTA) ו- collagenase, ואחריו את ניתוקה של hepatocytes עם המאגר הדרגתיות צפיפות. אלה hepatocytes מבודד קיימא על תרבות צלחות, לשמור על הרוב המכריע של מאפייני hepatocytes מצויד. אלה hepatocytes יכול לשמש עבור הערכות של חלבון מטבוליזם כולל סינתזה של חלבון המתהווה עם ריאגנטים שאינו רדיואקטיבי. אנחנו מראים כי hepatocytes מבודד נשלטים בקלות, מהווים יציבות איכות ונפח גבוה יותר של סינתזת חלבונים קשורה לחילוף חומרים של אנרגיה על-ידי ניצול התגובה מצדו הכימותרפיה סלקטיבית עם חלבון Tetramethylrhodamine (טמרה) שיטת זיהוי וניתוחים המערבי סופג. לכן, בשיטה זו הוא יקר עבור חוקר סינתזה של חלבון nascent הכבד קשור אנרגיה הומאוסטזיס. להלן כללי התנהגות מתווה של חומרים ושיטות על בידודו של העכבר הראשי באיכות גבוהה hepatocytes וזיהוי של סינתזת חלבונים המתהווה.

Introduction

חלבון הוא מרכיב תזונתי חשוב, כ-50% מהמשקל היבש של גוף האדם מורכב של חלבונים אשר יש מספר תכונות ביולוגיות, פונקציות1. כתוצאה מכך, סינתזת החלבון הוא אחד האירועים רב רוב האנרגיה, שינוי חלבון מטבוליזם קשורה מאוד להתפתחות של מחלות, כולל מחלות מטבוליות-2,-3,-4. בכבד, חלבון ביוסינטזה חשבונות עבור 20-30% מכלל האנרגיה הכוללת צריכת5,6. בנוסף, הפונקציה חלבונים לא רק פסיבי או בניית בלוקים של הכבד, אבל גורמים מתווכים-אות פעיל גם intracellularly או extracellularly כדי לווסת את חילוף החומרים מערכתית7. למשל, הפחתת רמות של אלבומין, אשר מסונתז והוא מופרש על ידי הכבד ואת החלבון הנפוץ ביותר של פלזמה8, מגביר את הסיכון של סוג 2 סוכרת פיתוח9,10, 11, ואילו ריכוז גבוה יותר של אלבומין הוא מגן מפני לפתח תסמונת מטבולית12. יתר על כן, להפריע או שיבוש חלבונים הכבד הפרשה או מאוגד-ממברנה, אשר לווסת את הכולסטרול הומאוסטזיס, לרבות lipoproteins, LDLR LRP1, יכול להוביל להתפתחות של תנגודת לאינסולין, היפרליפידמיה או טרשת עורקים 13. לכן, הזיהוי של המנגנונים המולקולריים הקשורים pathophysiological המעורבים חלבון הפרעה מטבוליזם בכבד, סיבוכים מטבוליים המשויכת שלו עשוי להיות שימושי עבור גילוי הרומן תרופתי גישות מפגר תחילת או לטפל במחלות מטבוליות כגון עמידות לאינסולין, סוכרת, כבד שומני אלכוהוליים.

סינתזה של חלבון מקושר באופן הדוק למצב האנרגיה התאית (למשל, היווצרות של קשר פפטידי אחד במהלך השלב התארכות של סינתזת חלבונים דורש phosphodiester 4 אג ח14) הוא מוסדר על ידי מסלולים מולקולריים המרגישות אינטר - ו intra - cellular זמינות חומרי הזנה15,16. מופעל כח פרוטאין קינאז (AMPK) הוא אחד חיישנים תאיים אנרגיה לשמור על הומאוסטזיס אנרגיה17. ברגע AMPK מופעל כאשר רמות האנרגיה התאית הופכים התחתון, AMPK ותערובות יישוב שלה לפעול כדי לעורר מסלולים קטבולי ומעכבות התהליכים האנאבוליים כולל חלבון סינתזה18,19. התקנון של סינתזת חלבונים מתווך על ידי זירחון של מספר חלבונים ribosomal20וגורמי תרגום. ראוי לציין, בתרבית של היעד של rapamycin 1 מורכבים (mTORC1), מנהל התקן הגדולות של סינתזת חלבונים, היא אחת המטרות המרכזיות של AMPK21. הפעלה של הנתיב mTORC1 משפר את צמיחת תאים והתפשטות על ידי גירוי חלבון autophagy ותרגום20,21. לכן זה הגיוני כי הפעלה של AMPK יכול לעכב סינתזת חלבון בתיווך mTORC122. אכן, הפעלה של AMPK מנטרל, ישירות phosphorylates mTORC1 על שאריות תראונין 2446 (חמישי2446) המוביל שלה איון23 דיכוי חלבון ביוסינטזה24. יתר על כן, AMPK בעקיפין יכול לעכב mTORC1 פונקציה על ידי זרחון והפעלה של tuberous טרשת נפוצה מורכבים 2 (TSC2)25 המהווה הרגולטור במעלה הזרם של המפל איתות mTORC1. בקיצור, dysregulation של המסלולים הללו בכבד קשורה פעמים רבות התפתחות מחלות מטבוליות, ולכן אין צורך חיוני בהקמת יעיל ניסוי כלים לחקור את התפקיד של המסלולים הללו בוויסות של אנרגיה, חלבון מטבוליזם ב hepatocytes.

יש דמיון חזק בין מאפייני hepatocytes העיקרי מבודד פונקציונלי ויוו hepatocytes מאשר עם במבחנה הכבד-derived תא קווים26,27,28. הוכח כי ראשי hepatocytes האנושי לשתף 77% דמיון עם זה של ביופסיות כבד, בעוד HepG2 תאים, אשר הינם תאים סרטניים הכבד היטב הבדיל בשימוש נרחב כדי לחקור פונקציות הכבד, להציג פחות מ- 48% בהקשר של ביטוי גנים פרופילי29. לכן, ניצול hepatocytes הראשית, יותר מאשר מונצחים התרבות תאים, הוא בעל חשיבות בחקירת תפקוד הכבד, פיזיולוגיה, מספר פרוטוקולים זמינים עבור הבידוד והתרבות של ראשי hepatocytes במיוחד של חולדות30,31. אמנם hepatocytes עכברוש שימושיים עם תשואה גבוהה יחסית של תאים, hepatocytes העכבר יש פוטנציאל גדול בהיבטים מדעיים רבים בגלל הזמינות רחב של עכברים גנטית מאופנן. עם זאת, ישנם מספר אתגרים טכניים לבודד בריא ושופע hepatocytes העיקרי של עכברים עבור הערכות סלולאריים מולקולריים מבוססות: ראשית, בצינורית ההכנסה כדי perfuse את הכבד עם ריאגנטים מאגר קשה מאוד להתמודד עם בשל וריד שער קטן ורזה העכבר או הכלילי; שנית, זמן רב יותר מניפולציה של תאים בתקופת הבידוד יכול לגרום להפחתת תא בכמות ובאיכות; שיטות הפרדה מכניות השלישי, שאינם אנזימטי יכול לגרום נזק חמור ומפיקים תשואה נמוכה של קיימא hepatocytes העיקרי מבודד32,33. בשנות ה-80, טכניקה זלוף collagenase הוצג לבידוד hepatocytes מ הכבדים של חיות34. שיטה זו מבוססת על collagenase זלוף של הכבד35,36,37, אינפוזיה של הכבד עם סידן chelator פתרון38,39, עיכול אנזימטי, דיסוציאציה מכני של הכבד parenchyma35. בשלב הראשון, כבד עכבר הוא perfused עם סידן [Ca2 +] מאגר חינם המכילה [Ca2 +] chelator (חומצה tetraacetic ethylenediamine, EDTA). בשלב השני, הכבד העכבר הוא perfused עם מאגר המכיל collagenase כדי hydrolyze את האינטראקציות מטריצה חוץ-תאית הסלולר. בניגוד המאגר המשמש בשלב אחד, הנוכחות של יונים [Ca2 +] במאגר של השלב השני נדרשת לפעילות יעילה collagenase, לאחר מכן את הכבד מתעכל יש נוספת מכנית ובעדינות יופרדו באמצעות מלקחיים בין כמוסת הכבד ורקמות parenchymatous. לבסוף, רקמת חיבור מוסר על-ידי סינון, ומפריד צנטריפוגה עוקבות hepatocytes קיימא מתאי parenchymal הן, שאינם חיים hepatocyte עם השימוש של צפיפות מאגר הדרגתיות40,41 ,42. במחקר הנוכחי, אנו מראים טכניקה זלוף collagenase שני שלבים ששונה כדי לבודד hepatocytes העיקרי של כבד עכבר לניתוח של סינתזת החלבון.

Radiolabeling של חלבונים נעשה שימוש נרחב כדי לכמת את רמות הביטוי, שיעורי מחזור, לקבוע את התפלגות הביולוגי של חלבונים43 עקב הרגישות הגבוהה של גילוי הרדיואקטיביות44. עם זאת, השימוש של איזוטופים רדיואקטיביים דורש מחקר מבוקרת מאוד הנסיבות והנהלים45. שיטות אלטרנטיביות שאינו רדיואקטיבי פותחו, יש יותר ויותר זכו לפופולריות רבה. התגובה מצדו הכימותרפיה סלקטיבית עם שיטת זיהוי החלבון Tetramethylrhodamine (טמרה) הוא אחד מהם, והוא מבוסס על התגובה הכימותרפיה סלקטיבית בין אלקין ו קבוצות46, אשר יכול להיות מנוצל כדי לנתח הסלולר אירועים כגון זיהוי סינתזה של חלבון המתהווה, מחלקות של glycoproteins ששינה עם קבוצה אזיד. סינתזה של חלבון המתהווה, L-Azidohomoalanine (L-AHA, חומצת אמינו אזיד-השתנה) יכול להיות סמויה משולבים לחלבונים, שאותרו על-ידי שימוש בשיטת47זיהוי חלבונים טמרה. על-ידי שימוש assay הזה hepatocytes העכבר הראשי, אנו מראים כי קצב סינתזת חלבון nascent בחוזקה קשורה בזמינות של ATP מ מיטוכונדריאלי AMPK ההפעלה (איור 1).

לסיכום, ניצול של העכבר הראשי hepatocytes חיוני כדי לחקור את חילוף החומרים חלבון ואנרגיה, לכימות סינתזה של חלבון nascent יקר, להשגת תובנות תפקיד פיזיולוגי המסלולים הרלוונטיים לפיתוח ו לרפא מחלות הקשורות hepatocyte.

Protocol

פרוטוקול זה מכיל את השימוש עכברי מעבדה. טיפול בבעלי חיים ונהלים ניסיוני בוצעו על פי הנהלים אושרו על ידי הוועדות טיפול בבעלי חיים של המרכז הרפואי של בית החולים לילדים בסינסינטי.

1. בידוד של העכבר הראשי Hepatocytes

  1. הכנות קדם בידוד
    1. להכין 450 מ ל 40% צפיפות מאגר הדרגתי כפי שמתואר בטבלה 1 ושמור ב 4 ° C (15 מ ל/עכבר).
    2. הכנת 500 מ"ל של וויליאמס בינוני כפי שמתואר בטבלה 1 ולשמור על 4 מעלות צלזיוס.
    3. הכנת 500 מ"ל של DMEM כפי שמתואר בטבלה 1 ולשמור על קרח (30 מ ל/עכבר).
    4. הכנת 500 מ"ל של מאגר HBSS (-) כפי שמתואר בטבלה 1 ושמור ב 42 ° C באמבט מים (40 מ ל/עכבר).
    5. הכנת 500 מ"ל של HBSS (+) מאגר עם 0.3 מ"ג/מ"ל Collagenase מסוג X כפי שמתואר בטבלה 1 עם הדגירה 30 דקות ב 42 ° C באמבט מים (40 מ ל/עכבר).
    6. הרכבתי את המשאבה זלוף על ידי הנחת הצנרת תוך ורידי של המינהל (העירוי) על פני דוושת רגל latching ועל -ידי בדיקת זרימת שטיפה פתרון ללא בועות אוויר.
    7. לחמם התנור שפופרת-42מעלות צלזיוס.
    8. לקרר את מכונת צנטריפוגה כדי 4 ° C.
  2. הרדמה זלוף
    1. לנקות את אזורי העבודה ואת המשאבה.
    2. לשטוף את הצינור הרביעי מחוברת משאבת על-ידי הפעלת 70% אתנול ביסודיות למשך 10 דקות.
    3. להסיר האתנול שיורית מהצינור הרביעי משאבת המחוברים על ידי שטיפה בעזרת DDW לחלוטין למשך 10 דקות.
    4. נגב את המספריים וחדים עם 70% אתנול.
    5. הצב את העכבר בתוך מיכל פלסטיק עם חלק תחתון רשת ועם פד ספוג איזופלוריין 2 מ"ל מתחת ברשת השינוי כדי להימנע ממגע ישיר.
    6. ישבנים העומק של הרדמה על ידי פדלים רפלקס (הבוהן המשרד צביטה).
    7. הסר את העכבר מתי זה הגיע העומק הרצוי של הרדמה.
      הערה: הזמן אינדוקציה של הרדמה לא צריך להיות יותר מ- 1 דקות.
    8. לבנות חרוט האף באמצעות צינור חרוטי 15 מ"ל עם משטח ספוג איזופלוריין 1 מ"ל דחף את קצה הצינורית.
    9. לשלוט העומק של הרדמה על ידי הזזת קונוס האף מתקרב או מן הנחיריים העכבר.
    10. הנח את העכבר על פלטפורמת עבודה עם הצד הבטני פונה כלפי מעלה.
    11. תרסיס אתנול 70% מעל אזור הבטן של העכבר ולאחר מכן פתח את חלל הבטן על ידי ביצוע חתך רוחבי גדול של הדרמיס ושל הצפק באמצעות מספריים חדות ומלקחיים במיתולגיות.
    12. לאחר מכן, לבצע חתך אנכי של השכבות בטן עד כל אברי הבטן חשופים לחלוטין באמצעות מספריים חדות ומלקחיים במיתולגיות.
    13. צעד קטן והמעיים גדול לכיוון הצד השמאלי של העכבר עם כותנה בלוק טיפ עד הכבד, וריד שער הכבד, הכלילי (IVC) חשופים באופן ברור.
    14. להכניס צנתר 24 G IVC רק ב ההסתעפות עם וריד הכליה בזהירות מבלי ללחוץ ידיים כדי למנוע את הפגיעה של IVC ודימום.
      הערה: אם הדימום מתרחש בעת הוספת הקטטר לתוך IVC, אז אתה צריך לנסות להוסיף את הצנתר חדש לתוך וריד השער.
    15. הסר את המחט של הקטטר לשלוט על המיקום של הצינורית כדי להימנע יוצא IVC, ולאחר מכן להתחבר 24 G בצינורית זלוף צינור על-ידי שימוש במחבר.
      הערה: למנוע הנוכחות של בועות אוויר לפני שמתחילים את זלוף.
    16. להתחיל את הטפטוף את הכבד עם חמים HBSS (-) בספיקה של 4 mL/min ולנתק את וריד הטחול במהירות כדי לנקז את הדם הפנימיים באמצעות מספריים.
      הערה: אם תעלות מוצלחת, הכבד יתחיל בלנש בשל חלוקת זרם אחורי להצפת המאגר של IVC וורידי הכבד. וריד שער הכבד נוצרת על ידי האיחוד של הטחול והסופריור ורידים מצע המעי העליון; לכן, זה די בטוח לחתוך את וריד הטחול מהיותו גדול ו דיסטלי מן הכבד.
    17. המשך זלוף 35 מ של חמים HBSS (-).
      הערה: הכבד יהיה חיוור צבע אם זלוף היא נאותה, והעכבר עדיין חי תחת הרדמה בשלב זה.
  3. עיכול, חילוץ
    1. Perfuse הכבד עכבר עם חמים 35 מ ל HBSS (+) כולל Collagenase מסוג X בספיקה של 4 mL/min.
    2. כל כמה דקות, מהדק את וריד הטחול באמצעות מלקחיים עבור ~ 10 s כדי לאפשר את כל נפח HBSS (+) לנטרל את כל חלקים אנטומיים של הכבד.
      הערה: הכבד מתחיל להתנפח לאחר מחבר חובק למעקה את וריד הטחול כתוצאה מגודש מאגר.
    3. שופכים 5 מ של HBSS חם מוכן (+) עם Collagenase מסוג X לתוך 100 מ מ פטרי בסוף התהליך זלוף.
    4. חתוך את הכבד perfused משאר חלקי הגוף לפני העצירה המשאבה כדי למנוע את זרם אחורי של דם לתוך הכבד, להסיר את כיס המרה על ידי מלקחיים ולאחר מכן נגב הכבד בעדינות בעזרת מגבת נייר כדי להסיר את הדם.
    5. להעביר את הכבד הפטרי אשר מכיל 5 מ של HBSS חם מוכן (+) ולהסיר את הקפסולה הכבד בעדינות בעזרת מלקחיים שקצהו ישר.
      הערה: הקפסולה הכבד הוא שכבה דקה של רקמת החיבור הזה סביב הכבד.
    6. לפזר את הרקמה parenchymal בקפידה על ידי עם המלקחיים. להוסיף 15 מ"ל DMEM קר לצלחת פטרי.
      הערה: המדיום יהפוך מעונן בשל תאים parenchymal אם הכבד טוב מתעכלת.
    7. לנער את הכבד קרועים בעדינות כדי לשחרר תאים parenchymal שיורית לתוך האמצעי ולהוסיף עוד 15 מ"ל DMEM קר אל הפטרי כדי לקבל את שאר התאים.
    8. העברת DMEM עם הכבד המומס דרך 100 μm תא מסננת לתוך צינור חרוטי 50 מ ל ולשמור בקרח.
  4. טיהור
    1. Centrifuge התליה תא ב 60 x g למשך 2 דקות ב 4 ° C, בזהירות להסיר את תגובת שיקוע על ידי השאיפה ואקום, resuspend בגדר ב 10 מ"ל DMEM.
    2. הוסף resuspended צנפה שכבה דקה על 40% צפיפות מאגר הדרגתיות, צנטריפוגה-800 x g 10 דקות בלי בלם ב-4מעלות צלזיוס.
    3. הסר בזהירות את תגובת שיקוע כולל השכבה העליונה (DMEM), השכבה האמצעית (תאים מתים או שאינם parenchymal), אבל לא את השכבה התחתונה (גלולה: ראשי parenchymal hepatocytes).
    4. Resuspend התאים הראשי עם E בינונית 2-3 מ"ל של וויליאם, ולהעביר הצינור 50 מ ל חדש כדי למנוע זיהום של תאים מתים על הקיר של הצינור.
    5. להוסיף בינוני של mL 7-8 ויליאם E, לערבב בעדינות ו צנטריפוגה-g 800 x עבור 1 דקות ב- 4 מעלות צלזיוס.
    6. הסר בזהירות את תגובת שיקוע על ידי השאיפה ואקום, ואז resuspend צנפה שוב עם 10, 20 או 30 מ בינוני של וויליאם E (בהתאם לגודל בגדר).
    7. ספירת התאים באמצעות מונה הניתן תא אוטומטית.
    8. זרע בינונית של וויליאם E, לשמור את הצלחת באינקובטור 37° C עבור h 2-3, לאחר מכן להחליף את with10 בינוני % FBS DMEM בינוני עם אנטי אנטי כדי להסיר תאים מתים או כעיגולים בצבע ועבור הדגירה לילה ב 37 º C.
    9. ביום למחרת, העכבר הראשי hepatocytes מוכנים לשימוש ניסיוני.

2. הכימותרפיה סלקטיבית מצדו Assay התגובה איתור של סינתזת חלבונים המתהווה

  1. תיוג מטבולית
    1. (טיפול קדם) לשטוף פעמיים hepatocytes ראשי עם 37 ° C PBS חמים ולהוסיף המדיום DMEM מתיונין-חופשית למשך 30 דקות לרוקן את מתיונין cytoplasmic שומרת לעצמה.
      הערה: L-Azidohomoalanine, היא חומצת אמינו ו אנלוגי מתיונין, מכיל את moiety azido אשר ניתן לשלב חלבונים במהלך ביוסינטזה של החלבונים כך דלדול של מתיונין cytoplasmic יהיה לשפר את תהליך ההזנה של התאגדות של L-Azidohomoalanine לחלבונים מסונתז החדש של hepatocytes העיקרי בתרבית.
    2. (טיפול) שטיפת hepatocytes ראשי עם 37 ° C לחמם PBS פעמיים ולהוסיף המדיום DMEM מתיונין-חופשית עם AHA μM 25 (L-Azidohomoalanine) עבור 4-6 שעות.
    3. להוסיף כל חומר כימי מסוים (כלומר 10 rotenone μM) האמצעי עבור 4-6 h בנוכחות של AHA על מנת לחקור את השפעתו על רמות ביטוי החלבון המתהווה.
    4. לאחר דגירה, להסיר את המדיום על ידי השאיפה ואקום, לשטוף hepatocytes ראשי עם PBS קר שלוש פעמים.
    5. להוסיף 200 מאגר פירוק μL לצלחת תקופת דגירה של 15-30 דקות על קרח, ואז הטיה לצלחת, לקחת את כל התא lysate לתוך צינור 1.7 מ.
      הערה: כדאי שתצפו. lysate תא זה הוא מאוד דביקה במהלך מהקצירה תא
    6. Sonicate תא lysate על קרח 5 s שלוש פעמים על-ידי שימוש sonicator בדיקה של solubilize את החלבונים ומעוררים את ה-DNA.
    7. מערבולת התא lysate במשך 5 דקות, centrifuge תא lysate ב 21,130 g x 10 דקות בבית 4 oC ולאחר מכן להעביר את תגובת שיקוע ברור לתוך צינור חדש. מודדים את ריכוז חלבון פעמיים.
      הערה: בשלב זה, דגימות חלבון ניתן לאחסן ב-20 מעלות צלזיוס במשך שבועיים אם הם לא השתמשו באופן מיידי.
  2. תיוג החלבון nascent אזיד-השתנה
    1. הכינו את הרכיבים (A + B) על-ידי הוספת μL 60 של הרכיב (A) רכיב (B).
      הערה: הפתרון פונה ורוד בהיר בצבע לאחר הוספת רכיב (א) (ב).
    2. להכין את buffers (ד) ו- (ה) לפי לפרוטוקול.
    3. . קח 20 – 40 μg תא lysate ולהוסיף 50 μL 2 x תגובת מאגר (רכיב A + B), ואז להתאים את עוצמת הקול כדי 80 μL על-ידי הוספת DDW מערבולת עבור 5 s.
    4. להוסיף 5 μL CuSO4 (רכיב C), ו מערבולת עבור 5 s.
    5. להוסיף 5 μL התגובה מאגר מוספים 1 (הרכיב הטרי D), לאחר מכן מערבולת עבור 5 s, להמתין 3 דקות.
    6. להוסיף 10 μL מחדש התגובה מאגר 2 מוספים (רכיב אלקטרוני), ואז מערבולת עבור 5 s ודוגמאות לסובב כעשרים דקות ב 4 ° C באמצעות מכונת מסובב מרובה.
      הערה: הפתרון פונה כתום בהיר בצבע לאחר הוספת רכיב (E). הדגימות צריכים להיות מוגנים מפני אור במהלך הסיבוב.
    7. להוסיף 300 מתנול μL ו מערבולת עבור 5 s, להוסיף μL כלורופורם 75 ו מערבולת עבור 5-s, לאחר מכן להוסיף 200 μL DDW ו מערבולת עבור 5 s.
    8. Centrifuge את הדגימות-21,130 x g ו- 4° C למשך 5 דקות, ואז למחוק את תגובת שיקוע מימית ולשמור בגדר.
    9. להוסיף 250 מתנול μL אל צינור, מערבולת, ספין שוב בשביל 5 דקות ב g x 21,130.
    10. למחוק את תגובת שיקוע, ואז לכסות את הדגימות עם רקמת נטולת ולאפשר את החבילות מילה נהדרת. למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
  3. דף ניתוח החיוורים ומכתים המערבי
    1. Solubilize בגדר ב 20 μL של טעינת מאגר ללא β-mercaptoethanol, מערבולת למשך 10 דקות, חום ב 70 ° C באמצעות חום בלוק 10 דקות. ואז לטעון את הדגימות לתוך 10% ג'ל מרחביות (1.5 מ מ) Tetramethylrhodamine (טמרה) זיהוי.
    2. לאתר את האות AHA משתמש בסורק לייזר מצב משתנה עבור כימות מדויק של חלבונים המתהווה.
    3. לשטוף את הג'ל עם DDW למשך 15 דקות.
    4. לאחר מכן, מכתים את הג'ל מרחביות 10% עם ריאגנט coomassie-צבע מהיר ורגיש 15 – 60 דקות לזהות חלבונים הכולל כפקד.
    5. מבטל את מכתים את הג'ל עם DDW עבור h 1 – 2 ולרכוש את התמונה באמצעות imager פלורסצנטיות UV.

תוצאות

העכבר הראשי hepatocytes בידוד תוצאות תשואה של 20 x 106 הכולל תאים/עכבר. בהיסטולוגיה, hepatocytes העיקרי בשידור חי ומצורפים להופיע מצולע או אופייני משושה במצב עם המתוארים בבירור גבולות עלי הלוואי קרומיים לאחר דגירה 24 שעות (איור 2).

?...

Discussion

למרות מספר שורות תאי הכבד מונצחים יש כבר הציע והשתמשת לחקור פונקציות הכבד49,50,51,52, תאים אלה חסרים בדרך כלל חשוב ובסיסי פונקציות של hepatocytes רגיל, כגון הביטוי של אלבומין (איור 3). זה מוכר ברבים, לכן, כי ניצול hepat...

Disclosures

המחברים מציינים שיש להם שאין ניגודי אינטרסים.

Acknowledgements

אנו מודים ד"ר Joonbae Seo ו ויויאן Hwa עבור קלט מדעי ודיון שלהם. עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי לבריאות (NIH) (R01DK107530). T.N. נתמכה על ידי אוטם יפן המדע, הטכנולוגיה הסוכנות. חלק של מחקר זה נתמך על ידי מענק של NIH (P30DK078392) עבור מרכז הליבה המחקר של מחלות העיכול בסינסינטי.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
HEPES bufferFisher ScientificBP310-500
D-glucoseFisher ScientificD16-500
Ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-tetraacetic acidAmericanBioAB00505-00025
Antibiotic-Antimycotic (100x)Gibco15240-062
HBSS (10x) no calcium, magnesium, phenol redGibco14185-052
Calcium Chloride Dihydrate (CaCl2.2H2O)Fisher ScientificC79-500
Density gradient bufferGE Healthcare17-0891-02
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) low glucose, pyruvateGibco11885-084
Fetal Bovine SerumHycloneSH30910.03
Phosphate Buffered Saline (PBS) (1x)Gibco1897141
Williams medium E, no glutamineGibco12551-032
L-alanyl-L-glutamine dipeptide supplementGibco35050-061
Collagenase Type XWako Pure Chemical Industries039-17864
Perfusion pumpCole-ParmerMasterflex L/SEquipment
IV administration setEXELINT29081Equipment
A water bathREVSCIRS-PB-200Equipment
Tube heaterFisher ScientificIsotempEquipment
EthanolDecon Lab, Inc0-39613
IsofluranePHOENIX10250
Autoclaved Cotton TipsFisherbrand23-400-124
100 mm Petri DishTPP93100
Connector (Male Luer Lock Ring)Cole-Parmer instrumentEW-4551807
24 G cathetersTERUMOSurflo 24Gx3/4'
100 μm Filter (CELL STRAINERS)VWR10199-658
15 mL conical-bottom centrifuge tubesVWR89039-666
50 mL conical-bottom centrifuge tubesVWR89039-658
Chemoselective ligation reaction PROTEIN ANALYSIS DETECTION KIT, TAMRA ALKYNEInvitrogenC33370
AHA (L-azidohomoalanine)InvitrogenC10102
DMEM (methionine free)Gibco21013024
L-Cystine DihydrochlorideSIGMAC2526
Laemmli sample bufferBioRad161-0737
Protease Inhibitor CocktailSIGMAP9599
SDS solution (20%)BioRad161-0418
Tris-HCL (1M)American BioanalyticalAB14044-01000
Phosphatase Inhibitor CocktailSIGMAP5726
Protein concentration measuring Kit (Bovin Serum Albumin-BSA)BioRad500-0207
6-well tissue culture plateTPP92006
Digital HeatblockVWR12621-092Equipment
Multi-RotatorGrant-bioPTR-60Equipment
Ultrasonic SonicatorCole-ParmerGE130PBEquipment
Standard Heavy-Duty Vortex MixerVWR97043-566Equipment
A variable mode laser scannerGE Healthcare Life ScienceFLA 9500Equipment
Coomassie-dye reagentThermo Scientific24594
Inverted microscopeOlympusCKX53Equipment
Western Blotting apparatusBioRad1658004Equipment
CentrifugeEppendorf5424REquipment
Automated cell counterBioRadTC20Equipment
FluorChem R systemproteinsimple-Equipment
p-Ampka (T172) antibodyCell signaling2535
Total-AMPK antibodyCell signaling5832
Albumin antibodyCell signaling4929
beta actin antibodySanta Cruzsc-130656
Fine scissors and forceps

References

  1. Forbes, R. M., Cooper, A. R., Mitchell, H. H. The composition of the adult human body as determined by chemical analysis. Journal of Biological Chemistry. 203, 359-366 (1953).
  2. Charlton, M. R. Protein metabolism and liver disease. Baillieres Clinical Endocrinology and Metabolism. 10, 617-635 (1996).
  3. De, F. P., Lucidi, P. Liver protein synthesis in physiology and in disease states. Current Opinion in Clinical Nutrition and Metabolic Care. 5, 47-50 (2002).
  4. Stoll, B., Gerok, W., Lang, F., Haussinger, D. Liver cell volume and protein synthesis. Biochemical Journal. 287 (Pt 1), 217-222 (1992).
  5. Brown, G. C. Control of respiration and ATP synthesis in mammalian mitochondria and cells. Biochemical Journal. 284 (Pt 1), 1-13 (1992).
  6. Buttgereit, F., Brand, M. D. A hierarchy of ATP-consuming processes in mammalian cells. Biochemical Journal. 312 (Pt 1), 163-167 (1995).
  7. Morrison, C. D., Laeger, T. Protein-dependent regulation of feeding and metabolism. Trends in Endocrinology and Metabolism. 26, 256-262 (2015).
  8. Bernardi, M., Ricci, C. S., Zaccherini, G. Role of human albumin in the management of complications of liver cirrhosis. Journal of Clinical and Experimental Hepatology. 4, 302-311 (2014).
  9. Abbasi, A., et al. Liver function tests and risk prediction of incident type 2 diabetes: evaluation in two independent cohorts. PLoS. One. 7, e51496 (2012).
  10. Schmidt, M. I., et al. Markers of inflammation and prediction of diabetes mellitus in adults (Atherosclerosis Risk in Communities study): a cohort study. Lancet. 353, 1649-1652 (1999).
  11. Stranges, S., et al. Additional contribution of emerging risk factors to the prediction of the risk of type 2 diabetes: evidence from the Western New York Study. Obesity (Silver Spring). 16, 1370-1376 (2008).
  12. Jin, S. M., et al. Change in serum albumin concentration is inversely and independently associated with risk of incident metabolic syndrome. Metabolism. 65, 1629-1635 (2016).
  13. Sluis, B., Wijers, M., Herz, J. News on the molecular regulation and function of hepatic low-density lipoprotein receptor and LDLR-related protein 1. Current Opinion in Lipidology. 28, 241-247 (2017).
  14. Viollet, B., et al. Activation of AMP-activated protein kinase in the liver: a new strategy for the management of metabolic hepatic disorders. Journal of Physiology. 574, 41-53 (2006).
  15. Li, H., Lee, J., He, C., Zou, M. H., Xie, Z. Suppression of the mTORC1/STAT3/Notch1 pathway by activated AMPK prevents hepatic insulin resistance induced by excess amino acids. Amerian Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 306, E197-E209 (2014).
  16. Qian, S. B., et al. mTORC1 links protein quality and quantity control by sensing chaperone availability. The Journal of Biological Chemistry. 285, 27385-27395 (2010).
  17. Carling, D. The AMP-activated protein kinase cascade--a unifying system for energy control. Trends in Biochemical Sciences. 29, 18-24 (2004).
  18. Hardie, D. G., Scott, J. W., Pan, D. A., Hudson, E. R. Management of cellular energy by the AMP-activated protein kinase system. FEBS Letters. 546, 113-120 (2003).
  19. Li, H., et al. AMPK activation prevents excess nutrient-induced hepatic lipid accumulation by inhibiting mTORC1 signaling and endoplasmic reticulum stress response. Biochimica et Biophysica Acta. 1842, 1844-1854 (2014).
  20. Proud, C. G. Role of mTOR signalling in the control of translation initiation and elongation by nutrients. Current Topics in Microbiology and Immunology. 279, 215-244 (2004).
  21. Sarbassov, D. D., Ali, S. M., Sabatini, D. M. Growing roles for the mTOR pathway. Current Opinion in Cell Biology. 17, 596-603 (2005).
  22. Reiter, A. K., Bolster, D. R., Crozier, S. J., Kimball, S. R., Jefferson, L. S. Repression of protein synthesis and mTOR signaling in rat liver mediated by the AMPK activator aminoimidazole carboxamide ribonucleoside. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 288, E980-E988 (2005).
  23. Cheng, S. W., Fryer, L. G., Carling, D., Shepherd, P. R. Thr2446 is a novel mammalian target of rapamycin (mTOR) phosphorylation site regulated by nutrient status. Journal of Biological Chemistry. 279, 15719-15722 (2004).
  24. Howell, J. J., et al. Metformin Inhibits Hepatic mTORC1 Signaling via Dose-Dependent Mechanisms Involving AMPK and the TSC Complex. Cell Metabolism. 25, 463-471 (2017).
  25. Inoki, K., Zhu, T., Guan, K. L. TSC2 mediates cellular energy response to control cell growth and survival. Cell. 115, 577-590 (2003).
  26. Wilkening, S., Stahl, F., Bader, A. Comparison of primary human hepatocytes and hepatoma cell line Hepg2 with regard to their biotransformation properties. Drug Metabolism Disposition. 31, 1035-1042 (2003).
  27. Li, A. P., et al. Present status of the application of cryopreserved hepatocytes in the evaluation of xenobiotics: consensus of an international expert panel. Chemico-Biology Interactaction. 121, 117-123 (1999).
  28. Hengstler, J. G., et al. Cryopreserved primary hepatocytes as a constantly available in vitro model for the evaluation of human and animal drug metabolism and enzyme induction. Drug Metabolism and Reviews. 32, 81-118 (2000).
  29. Olsavsky, K. M., et al. Gene expression profiling and differentiation assessment in primary human hepatocyte cultures, established hepatoma cell lines, and human liver tissues. Toxicology and Applied Pharmacology. 222, 42-56 (2007).
  30. Shen, L., Hillebrand, A., Wang, D. Q., Liu, M. Isolation and primary culture of rat hepatic cells. Journal of Visualized Experiments. , (2012).
  31. Li, Y., Cai, S., Zhang, L., Li, X. Simultaneous isolation and primary culture of rat hepatocytes, hepatic stellate cells, Kupffer's cells and hepatic sinus endothelial cells. Nan. Fang Yi. Ke. Da. Xue. Xue. Bao. 34, 532-537 (2014).
  32. Edwards, M., Houseman, L., Phillips, I. R., Shephard, E. A. Isolation of mouse hepatocytes. Methods in Molecular Biology. 987, 283-293 (2013).
  33. Schreiber, G., Schreiber, M. The preparation of single cell suspensions from liver and their use for the study of protein synthesis. Subcellular Biochemistry. 2, 307-353 (1973).
  34. Klaunig, J. E., Goldblatt, P. J., Hinton, D. E., Lipsky, M. M., Trump, B. F. Mouse liver cell culture. II. Primary culture. In Vitro. 17, 926-934 (1981).
  35. Puviani, A. C., Ottolenghi, C., Tassinari, B., Pazzi, P., Morsiani, E. An update on high-yield hepatocyte isolation methods and on the potential clinical use of isolated liver cells. Comparative Biochemistry and Physiology A Molecular and Integrative Physiology. 121, 99-109 (1998).
  36. Park, K. H., Song, S. C. Morphology of spheroidal hepatocytes within injectable, biodegradable, and thermosensitive poly(organophosphazene) hydrogel as cell delivery vehicle. Journal of Biosciences and Bioengineering. 101, 238-242 (2006).
  37. Li, K., et al. Improved performance of primary rat hepatocytes on blended natural polymers. Journal of Biomedicine and Material Research Part A. 75, 268-274 (2005).
  38. Battle, T., Stacey, G. Cell culture models for hepatotoxicology. Cell Biology Toxicology. 17, 287-299 (2001).
  39. Kravchenko, L., Petrenko, A., Shanina, I., Fuller, B. A simple non-enzymatic method for the isolation of high yields of functional rat hepatocytes. Cell Biology International. 26, 1003-1006 (2002).
  40. Berry, M. N., Grivell, A. R., Grivell, M. B., Phillips, J. W. Isolated hepatocytes--past, present and future. Cell Biology and Toxicology. 13, 223-233 (1997).
  41. Jiang, Q. D., et al. Isolation and identification of bovine primary hepatocytes. Genetics and Molecular Research. 12, 5186-5194 (2013).
  42. Pertoft, H., Laurent, T. C., Laas, T., Kagedal, L. Density gradients prepared from colloidal silica particles coated by polyvinylpyrrolidone (Percoll). Analytical Biochemistry. 88, 271-282 (1978).
  43. Lipford, G. B., Feng, Q., Wright, G. L. A method for separating bound versus unbound label during radioiodination. Analytical Biochemistry. 187, 133-135 (1990).
  44. Mukai, T., et al. In-vivo evaluation of indium-111-diethylenetriaminepentaacetic acid-labelling for determining the sites and rates of protein catabolism in mice. Journal of Pharmacy and Pharmacology. 51, 15-20 (1999).
  45. Wilson, M. S. C., Saiardi, A. Importance of Radioactive Labelling to Elucidate Inositol Polyphosphate Signalling. Topics in Current Chemistry. 375, 14 (2017).
  46. Rostovtsev, V. V., Green, L. G., Fokin, V. V., Sharpless, K. B. A stepwise huisgen cycloaddition process: copper(I)-catalyzed regioselective "ligation" of azides and terminal alkynes. Angewandte Chemie International Edition. 41, 2596-2599 (2002).
  47. Banerjee, P. S., Ostapchuk, P., Hearing, P., Carrico, I. S. Unnatural amino acid incorporation onto adenoviral (Ad) coat proteins facilitates chemoselective modification and retargeting of Ad type 5 vectors. Journal of Virology. 85, 7546-7554 (2011).
  48. Hou, W. L., et al. Inhibition of mitochondrial complex I improves glucose metabolism independently of AMPK activation. Journal of Cell Molecular Medicine. 22, 1316-1328 (2018).
  49. Davalos, A., et al. miR-33a/b contribute to the regulation of fatty acid metabolism and insulin signaling. Proceedings of the National Academy of Science. , 9232-9237 (2011).
  50. DiPersio, C. M., Jackson, D. A., Zaret, K. S. The extracellular matrix coordinately modulates liver transcription factors and hepatocyte morphology. Molecular and Cellular Biology. 11, 4405-4414 (1991).
  51. Xu, L., et al. Human hepatic stellate cell lines, LX-1 and LX-2: new tools for analysis of hepatic fibrosis. Gut. 54, 142-151 (2005).
  52. Yang, L., Li, P., Fu, S., Calay, E. S., Hotamisligil, G. S. Defective hepatic autophagy in obesity promotes ER stress and causes insulin resistance. Cell Metabolism. 11, 467-478 (2010).
  53. Heinz, S., et al. Mechanistic Investigations of the Mitochondrial Complex I Inhibitor Rotenone in the Context of Pharmacological and Safety Evaluation. Science Reports. 7, 45465 (2017).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

140hepatocytesnascent AMPKrotenoneL Azidohomoalanine

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved