تصور المورفولوجية الساق الحركية محاور عصبية من خلال بشرة الكبار

Summary

هنا يصف لنا وضع بروتوكول لتصور استهداف محواري مع بروتين الفلورسنت في الساقين الكبار من المورفولوجية التثبيت والمتصاعدة، والتصوير، والتصوير بعد انتهاء الخطوات.

Abstract

نفذت معظم العمل لمواصفات الخلايا العصبية في نماذج أصعب وراثيا وفسيولوجيا مثل ج. ايليجانس، اليرقات المورفولوجية ، والأسماك، والتي جميعها الانخراط في حركات أوندولاتوري (مثل الزحف أو السباحة) كطريقة أساسية للحركة. ولكن أكثر تطورا فهم المواصفات الفردية الخلايا العصبية الحركية (مينيسوتا) – على الأقل فيما يتعلق بإبلاغ علاجات الأمراض – يطالب نظام يستهدف أيضا أفضل نماذج مخططات الحركة المعقدة القائمة على أطرافهم الفقاريات. النظام الحركي المورفولوجية الكبار المسؤولين عن المشي تلبي جميع هذه المعايير بسهولة، في هذا النموذج أنه من الممكن لدراسة مواصفات عدد صغير من الساق تمييزها بسهولة MNs (حوالي 50 MNs كل جولة) كلا استخدام واسعة مجموعة من الأدوات الوراثية قوية، وفي سياق الفسيولوجية لوضع خطة تحرك تستند إلى طرف من أطرافهم. هنا يصف لنا وضع بروتوكول لتصور تعصيب عضلة الساق في يطير الكبار.

Introduction

مثل الفقاريات أطرافهم، وساقه الكبار المورفولوجية ينقسم إلى شرائح. ويتضمن كل ساق يطير عضلات 14، كل منها يضم عدة ألياف العضلات^1،2. تقع جثث خلية MNs الساق الكبار في T1 (بروثوراسيك)، T2 (ميسوثوراسيك)، والعقد T3 (ميتاثوراسيك) على كل جانب من الحبل البطني العصب (فنك)، هيكلي مشابه للحبل الشوكي الفقاريات (الشكل 1). وهناك ما يقرب من 50 MNs في كل العقد، التي تستهدف عضلات في أربعة أجزاء من الساق عن (كوكسا، تروتشانتير، وعظم الفخذ، والساق) (الشكل 1)³. الأهم من ذلك، يحتوي كل ساق الكبار الفردية MN هوية فريدة من نوعها مورفولوجية التي هي النمطية للغاية بين الحيوانات^3،4. كل هذه MNs فريدة مستمدة من 11 من الخلايا الجذعية، يسمى نيوروبلاستس (مكتب الإحصاء الوطني) المنتجة للمحطة MNs خلال مراحل اليرقات^3،4. في نهاية كل مراحل اليرقات تفرق MNs بوستميتوتيك غير ناضجة أثناء التحول للحصول على العرش الجذعية محددة وأهداف المحطة الطرفية محواري التي تعرف بهم مورفولوجيا فريدة من نوعها^3،4. سابقا قمنا باختبار الفرضية القائلة بأن مدونة اندماجي لعوامل النسخ (TFs) تعين مورفولوجية فريدة من نوعها لكل ساق المورفولوجية الكبار MN⁵. كنموذج، قمنا باستخدام النسب ب أحد الأنساب NB 11 التي تنتج سبعة من أصل MNs وأثبتت أن مدونة اندماجي TFs المعرب عنها في الساق الكبار بوستميتوتيك MNs يملي على مورفولوجيس الفردية. قبل ريبروجرامينج مدونة TF MNs قد تمكنا من تبديل MN مورفولوجيس بطريقة يمكن التنبؤ بها. ونحن ندعو هذه TFs: mTFs (TFs المورفولوجية)⁵.

واحدة من أصعب الأجزاء من التحليلات المورفولوجية للكبار MNs تصور محاور عصبية عن طريق بشرة سميكة والسيارات-فلوري بدقة عالية. نحن عادة ما تسمية محاور عصبية مع معلم غشاء بروتينات فلورية خضراء التي يتم التعبير عنها في MNs مع نظام ثنائي تعبير، مثل دفجلوت-Gal4/UAS-mCD8::GFP أو دفجلوت-QF/QUAS mCD8::GFP، حيث دفجلوت تشكل دافعا قويا في ⁶من موتونيورونس. من خلال الجمع بين هذه الأدوات مع تقنيات الاستنساخ الأخرى مثل تحليل فسيفساء بعلامة ريبريسيبلي (ماركم)⁷، ورابطة الدول المستقلة-ماركم⁸أو ماركمبوو⁵، نحن يمكن تقييد التعبير التجارة والنقل للفئات السكانية الفرعية لإجراء تحليل المظهرية MNs من محاور عصبية أسهل. ونحن قد ولدت بروتوكول بغية إبقاء الساق مورفولوجيا محواري MN سليمة للتعمير 3D التصوير واللاحقة بمعالجة مسائل معينة مضمنة في الساق المورفولوجية الكبار مثل التثبيت (1) بشأن الهياكل الداخلية لفريق الخبراء البالغين دون التأثير على مورفولوجيا إكسون والتعبير الفلورسنت الذاتية، وعضلات الساق، (2) تركيب المحطة للمحافظة على الهيكل العام لإطار ساترة وفي الاتجاه المناسب للتصوير، و (3) معالجة للحصول على بشرة الصور الخلفية، فضلا عن إشارة الفلورسنت محواري. بينما هذا البروتوكول تفصيلي للكشف عن التعبير الفلورسنت في مينيسوتا محاور عصبية، أنه يمكن تطبيقها على تصور مكونات أخرى من الساق نيوروموسكولاتوري في المفصليات.

Protocol

1-الساق التشريح والتثبيت

1. تأخذ لوحة زجاج متعدد جيدا وتعبئة العدد المناسب من الآبار مع الإيثانول 70%. إضافة 15 – 20 CO₂-الذباب تخديره (من الجنس وأي عمر) لكل منهما جيدا باستخدام فرشاة، بلطف ربت الذباب إلى الحل الإيثانول حتى الذباب مغمورة تماما.
   ملاحظة: هذه الخطوة لإزالة hydrophobicity بشرة. عدم غسل لأكثر من 1 دقيقة، لأن هذا يزيد من السيارات-الأسفار بشرة.
2. شطف الذباب 3 مرات مع الحل المنظفات الفاعل النطاق 0.3% في 1 × الفوسفات مخزنة المالحة (PBS). يبقى الذباب في هذا الحل لمالا يقل عن 10 دقيقة.
   ملاحظة: أفضل ثابتة الساقين عندما بما في ذلك المنظفات، الذي من المرجح أن زيادة تغلغل مثبت داخل الساق.
3. ضع لوحة متعددة جيدا على الجليد جنبا إلى جنب مع أنبوب بارافورمالدهيد 4% (منهاج عمل بيجين).
   ملاحظة: إعداد جديدة 4% منهاج العمل من 16% PFA إيثانول حرة أسهم حل أمر بالغ الأهمية.
4. استخدام الملقط لإزالة الرأس والبطن من الذباب دون إلحاق الضرر بالجزء المتعلق بالصدر أو الساقين.
   ملاحظة: إزالة البطن يسهل عقد الطاير وتشريح الساقين.
5. تشريح الساقين من الجزء الصدري مع الملقط والساقين في الآبار التي تحتوي على 4% منهاج عمل بيجين. لهذا، دفع بلطف ولكن بحزم عند تقاطع كوكسا الصدر باستخدام طرف الملقط غرامة حتى ينفصل الساق.
6. إصلاح ساقيه في 4% منهاج العمل بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية (حوالي 20 ح مجموع).
7. تغسل الساقين مع 0.3% الفاعل النطاق الحل المنظفات في برنامج تلفزيوني 1 x، 5 x لمدة 20 دقيقة.
8. استبدال غسالة المخزن المؤقت مع تصاعد المتوسطة. إبقاء الساق في وسط تصاعد لمدة يوم واحد على الأقل قبل تصاعد للسماح اختراق الساق كاملة.
   ملاحظة: إذا كان متوسط التركيب عالية اللزوجة، تمييع المتوسط المتصاعدة إلى 80% مع برنامج تلفزيوني 1 x لأنه يمكن أن يسبب التغير المفاجئ في اللزوجة بشرة انهيار وتلف الهيكل العام لفريق الخبراء. اعتماداً على برنامج تشغيل Gal4 ، يمكن الحفاظ على الذباب 1 إلى 3 أسابيع في 4 درجات مئوية في تركيب وسائط حتى المتصاعدة.

2. تركيب المحطة

1. وضع حوالي 20 ميليلتر من والغليسيرول 70% على الجانب الأيسر من الشريحة المجهر، والغطاء مع ساترة² مربع 22 × 22 مم (الشكل 2 أ، ب). "الماصة؛" حوالي 10 ميليلتر من تصاعد المتوسطة على طول خط الموازي وعلى مسافة صغيرة من الحافة اليمنى لهذا ساترة. إضافة آخر ميليلتر 30 من تصاعد المتوسطة كذلك على الجانب الأيسر من الشريحة (الشكل 2).
   ملاحظة: عند تطبيق ساترة على الساقين (انظر أدناه) المتوسطة المتصاعدة بلطف ستنتشر تحت ساترة وما حولها في الساقين دون تشريد لهم.
2. استخدام الملقط غرامة رفع الساق من الحل ووضعها بلطف على المتوسطة المتصاعدة قرب ساترة اليسرى. القيام بنفسه بالنسبة لكل ساق ومواءمتها من الأعلى إلى الأسفل (الشكل 2D).
   1. رفع ونقل الساقين في قطره متوسط الذي عقد بين كل النصائح الملقط. توجيه الساقين بطريقتين، هما: الجانب الخارجي لأعلى أو لأسفل.
3. حالما يتم محاذاة بشكل صحيح جميع الساقين (حتى يمكن تركيبة على ساقيه إلى 6 – 8)، وضع ساترة ثانية أكثر الساقين أن هذا ساترة يعتمد قليلاً على ساترة الموضوعة سابقا (الشكل 2E) للسماح للفضاء بين ساترة والنسيج، وأن منع الساقين من الحصول على معطوب (الشكل 2).
   ملاحظة: بدلاً من ذلك، استخدام الآبار ملصقا أو الشمع تقويم الأسنان لإنشاء مسافة بين ساترة والشريحة.
4. استخدام طلاء الأظافر تأمين موقف كوفيرسليبس في كل زاوية (الشكل 2 واو).
   ملاحظة: الأنسجة جاهز الآن للصورة.

3-تصوير

1. قم بإعداد مسار واحد على استخدام الليزر 488 نانومتر والكشف عن اثنين في نفس الوقت للحصول على كل من الأسفار بروتينات فلورية خضراء وبشرة السيارات-الأسفار. استخدام عنصر تحكم النطاق أو عرض شريط التمرير في الإطار الطيفية من إطار مسار الضوء من البرمجيات، وتعيين نطاق كشف واحد كاشف (كشف 1) بين 498 – 535 نانومتر والآخر (كاشف 2) بين 566-652 شمال البحر الأبيض المتوسط.
   ملاحظة: عادة، الكاشف 1 يجب أن يكون جهاز كشف جاسب والكاشف 2 أنبوب ضوئي. قناة 498-535 على النحو الأمثل بالكشف عن إشارة بروتينات فلورية خضراء ولكن أيضا بالكشف عن السيارات الأسفار من بشرة. ومع ذلك، يكشف القناة 566 – 652 فقط صف السيارات من بشرة (الشكل 3A).
2. استخدام 20 X أو 25 X النفط الهدف الغمر، 1024 × 1024 بكسل، وعمق 12 بت، وتعيين تباعد ض 1 ميكرومتر. يسكن بكسل تعيين الوقت المايكروثانيه تقريبا 1.58، ومتوسط 2 إطارات/الصورة. استخدام الأهداف مع ارتفاع الفتحة العددية.
3. قم بتعيين كافة الإعدادات الأخرى، اعتماداً على مجهر [كنفوكل] وبرامج التصوير المستخدمة.
   1. تأكد من الحصول على إشارة بشرة أكثر إشراقا من كاشف 566 – 652 بدلاً من كاشف 498 – 535. للقيام بذلك، استخدام القوة الليزر نفسه من 488-الليزر للكشف عن كلا. استخدام علامات الإشباع، أولاً ضبط كسب كاشف 1 للحصول على إشارة بروتينات فلورية خضراء مشرق بما يكفي (الشكل 3، د). ثم قم بضبط كسب كاشف 2 التأكد من أن بعض المناطق مع إشارة بشرة عالية (حواف الساقين والمفاصل) تنتج إشارة التشبع في هذا الكاشف (الشكل 3، E).
   2. حالة الساق ممتدة وكبيرة جداً بحيث يمكن تصويرها في إطار واحد، استخدم خيار بلاط أو الموقف من برامج التصوير المجهر.
4. إعادة بناء الصور النهائية أما باستخدام المجهر الملكية برامج التصوير أو استخدام إيماجيج/فيجي مجانية (انظر أدناه).

4-وظيفة التصوير التجهيز

1. افتح المكدس [كنفوكل] في إيماجيج/فيجي.
   1. استخدام البرنامج المساعد بيوفورماتس (الإضافات | بيو-تنسيقات | المستورد بيوفورماتس) في فيجي لفتح الصور التي ليست في. تنسيق TIF من الملكية التصوير حزم البرمجيات⁹.
2. تقسيم القنوات عن طريق تحديد الصورة | لون | تقسيم القنوات.
   ملاحظة: إذا قدمت الصور من عدة مواقع ويجب أن يكون معاد، استخدم في اقتران خياطة في فيجي من البرنامج المساعد (الإضافات > Stitching > خياطة بيرويس)^10،11.
3. لاستقطاع إشارة بشرة من إشارة بروتينات فلورية خضراء، افتح "الحاسبة الصورة" (عملية | صورة الإله الحاسبة): حدد المكدس من كاشف 1 ك 1 صورة (بروتينات فلورية خضراء + بشرة) (الشكل 4A)، في إطار العملية حدد طرح، وحدد المكدس من كاشف 2 كصورة 2 (بشرة) (الشكل 4 باء). كنتيجة لذلك، يتم الحصول على فقط إشارة بروتينات فلورية خضراء الذاتية (التجارة والنقل) (الشكل 4).
   1. إعادة دمج هذا المكدس (بروتينات فلورية خضراء) مع مكدس 'بشرة فقط' التي تم الحصول عليها من كاشف 2 (الشكل 4 باء الصورة | لون | دمج القنوات) للحصول على صورة RGB تضم إشارة التجارة والنقل الخاصة بالانسجة، فضلا عن إشارة بشرة، مما يساعد على تحديد العرش إكسون داخل أجزاء الساق (الشكل 4).
   2. ضبط التباين والسطوع لكل صورة (صورة | ضبط | Brightness/Contrast) ومن ثم توليد صورة RGB واحدة (صورة | نوع | لون RGB).
      ملاحظة: لإنشاء إسقاط الحد أقصى من Z-المكدس (صورة | مكدسات | المشروع Z...)، استخدم أقصى شدتها الإسقاط لإشارة بروتينات فلورية خضراء ومتوسط كثافة لبشرة، التي يمكن تعديلها ثم للسطوع قبل دمج القناتين.
4. بدلاً من ذلك، استخدام ماكرو للطرح التلقائي ومعالجة الصور في إيماجيج/فيجي. نسخ النص في تكميلية 1 ملف في محرر الماكرو (الإضافات | جديد | الماكرو) وحفظ الماكرو في مجلد الإضافات وإعادة تشغيل إيماجيج/فيجي مرة واحدة لتكون قادرة على استخدام الماكرو.
   1. لاستخدام الماكرو، افتح المكدس [كنفوكل]، وفتح النافذة/السطوع (صورة | ضبط | Brightness/Contrast). ثم قم بتشغيل الماكرو (البرنامج المساعد | الماكرو | تشغيل) واتبع التعليمات.
   2. عندما طلب منه تحديد العملية (نافذة الحاسبة الصورة)، اختر الصورة 1 مكدس الذاكرة المؤقتة 1 (التجارة والنقل) والصورة 2 مكدس 2 (بشرة) و طرح.
      ملاحظة: الماكرو تنشئ صورة إسقاط قصوى من إشارة بروتينات فلورية خضراء المجهزة (MAX_Result stack1)، إسقاط متوسط لبشرة (AVG_stack2)، نتيجة للطرح المكدس بشرة من المكدس التجارة والنقل (نتيجة stack1)، وغير المجهزة بشرة المكدس (stack2).
   3. عندما طلب منه ضبط التباين، استخدم عناصر التحكم في نافذة التحكم بالسطوع/لضبط السطوع الصورة الإسقاط القصوى للتجارة والنقل، والإسقاط المتوسط لبشرة، لتوليد صورة RGB مدمجة لكلا إشارات تبين التجارة والنقل في الأخضر، وأهاب باللون الرمادي. دمج نتيجة stack1، و stack2، وبالمثل إنشاء كومة بروتينات فلورية خضراء وبشرة المجمعة التي يمكن استخدامها في المرحلة القادمة.
5. تصور الساقين في ثلاثة أبعاد، استخدام البرمجيات 3D المتخصصة مع المكدسات الذي تم إنشاؤه حديثا (4E الشكل).
   1. افتح المكدس RGB باستخدام برنامج ثلاثي الأبعاد (انظر الجدول للمواد). في إطار حوار منبثق، حدد كافة القنوات في قسم التحويل وضع وإدخال حجم فوكسل (حجم بكسل).
      ملاحظة: يرد كافة المعلومات الضرورية في ملفات الصور من برنامج المجهر الملكية أيا كانت قيد الاستخدام.
   2. في القناة 2 وحدة نمطية (بروتينات فلورية خضراء إشارة)، انقر بالزر الأيمن واختر العرض | فولرين. ثم الأيسر في الوحدة النمطية فولرين. في المقطع خصائص (أسفل يسار الشاشة) انقر فوق يسار على تحرير وحدد volrengreen.col. في القناة 1 وحدة نمطية (بشرة إشارة) بزر الماوس الأيمن وحدد العرض | فولرين. ثم الأيسر في الوحدة النمطية فولرين. في الأيسر مقطع خصائص متقدمة و حدد التسريح وإعادة الإدماج (عرض شفافة مثل الأشعة)، ثم ضبط قيمة غاما لرؤية الخلفية بشرة (4E الشكل).
   3. لتوليد استدارة ثلاثية الأبعاد، انقر بالزر الأيمن على الوحدة النمطية مكدس الذاكرة المؤقتة للمشروع. ثم حدد تحريك | تدوير. الأيسر على الوحدة النمطية للتدوير.
   4. في خصائص المقطع انقر فوق استخدام مركز بوكس. في الوحدة النمطية تدوير زر الماوس الأيمن فوق وحدد حساب | صانع الفيلم. في الوحدة النمطية صانع الفيلم انقر فوق زر الماوس الأيسر. في المقطع خصائص الأيسر الأيسر على خيارات متقدمة (أعلى يمين المقطع خصائص).
   5. في الحقل اسم الملف ملء اسم تناوب الفيلم. في مجال نوعية الكتابة 1 (جودة كحد أقصى). ترك الإطار في 200 إذا كان هو المطلوب تناوب s 8.3 (هذا الرقم يمكن انخفض أو ارتفع إلى تعديل سرعة الدوران). ثم اضغط على تطبيق (الزر الأخضر، واليسار السفلي من المقطع خصائص (انظر الفيديو 1)).

النتائج

كما هو موضح في الشكل 4، يسمح هذا الإجراء تصوير ممتازة من محاور عصبية المسمى بروتينات فلورية خضراء في الساقين المورفولوجية الكبار، جنبا إلى جنب مع بهم العرش المحطة الطرفية. الأهم من ذلك هو الحصول على إشارة بروتينات فلورية خضراء نظيفة دون أي تلوث من ال?...

Discussion

بشرة المورفولوجية الكبار والمفصليات الأخرى، التي تحتوي على العديد من الصبغات الداكنة، يشكل عقبة رئيسية لعرض هياكل داخل أجسامهم. وبالإضافة إلى ذلك، أنها بشدة الفلورسنت السيارات التي تتفاقم بالتثبيت. هاتان السمتان إشكالية جداً بالنسبة للملاحظات من الأصباغ الفلورية أو الجزيئات داخل الجس?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ethanol absolute	Fisher	E/6550DF/17	Absolute analytical reagent grade
nonionic surfactant detergent	Sigma-Aldrich	T8787	Triton X-100, for molecular biology
Fine forceps	Sigma-Aldrich	F6521	Jewelers forceps, Dumont No. 5
Glass multi-well plate	Electron Microscopy Sciences	71563-01	9 cavity Pyrex, 100 mm x 85 mm
PFA	Thermofisher	28908	Pierc 16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free
Glycerol	Fisher BioReagents	BP 229-1	Glycerol (Molecular Biology)
Spacers	Sun Jin Lab Co	IS006	iSpacer, four wells, around 12 μL working volume per well, 7 mm diameter, 0.18 mm deep
Square 22 mm x 22 mm coverslips	Fisher Scientific	FIS#12-541-B	No.1.5-0.16 to 0.19 mm thick
Mounting Medium	Vector Laboratories	H-1000	Vectashield Antifade Mounting Medium
Confocal microscope	Carl Zeiss		LSM780; objective used LD LCI Plan-Apochromat 25X/0.8 Imm Korr DIC M27 (oil/ silicon/glycerol/water immersion) (420852-9871-000)
imaging software	Carl Zeiss		ZEN 2011
3D-Image software	ThermoFisher Scientific		Amira 6.4
ImageJ	National Institutes of Health	https://imagej.nih.gov/ij/	ImageJ/FIJI