大人のキューティクルをショウジョウバエ脚運動ニューロン軸索を可視化します。

要約

ここで固定、取付け、イメージング、およびイメージ作成後の手順でショウジョウバエの大人の足に蛍光タンパク質を持つ軸索ターゲットを視覚化するプロトコルについて述べる。

要約

神経の仕様の仕事の大半は、 Cなどの遺伝学的および生理学的にも扱いやすいモデルで行われています。線虫、ショウジョウバエの幼虫、魚、すべての歩行の彼らの主なモードとして (のようなクロールまたは水泳) 波動運動に従事します。しかしより個々 の運動ニューロン (MN) の仕様の理解を洗練された-少なくとも疾患の治療に知らせるという点で-より良いモデルの複雑な付加物に基づいた歩行スキームを均等に扱いやすいシステムを要求脊椎動物。アダルトショウジョウバエ運動システム歩いて担当を満たしているこれらすべての条件は、簡単にこのモデルでは、少数の容易に識別脚 MNs (足あたり約 50 MNs) の仕様を検討することが可能だから両方を使って広大です強力な遺伝学的ツールと付属物に基づいた歩行スキームの生理のコンテキストでは配列です。ここで大人のフライで脚筋の神経支配を視覚化するプロトコルについて述べる。

概要

脊椎動物の四肢のようなショウジョウバエの大人の脚は、セグメントに編成されます。各フライの脚には、複数の筋線維^1,2を含む 14 の筋肉が含まれています。大人の脚 MNs の細胞体は、T1 (老熟)、(キリギリス)、T2 と T3 (誘発) 大脳腹側神経索 (VNC) 脊椎脊髄 (図 1) に類似した構造の両側にあります。対象筋 (coxa、転子、大腿骨、脛骨) の同側の脚の 4 つのセグメント (図 1)³、各神経節約 50 MNs があります。重要なは、それぞれ個々 の大人の脚 MN は、動物^3,4間のステレオタイプが強くユニークな形態の id です。これらのすべてのユニークな MNs は神経芽細胞 (NBs) 幼生^3,4脚 MNs の生産と呼ばれる 11 の幹細胞から派生しました。すべて幼虫の段階の終わりに彼らの特定樹状アーバーと、ユニークな形態の^3、4を定義する軸索ターミナルのターゲットを取得する変態未熟な後 MNs を区別します。以前転写因子 (TFs) の組合せのコードが各ショウジョウバエ大人の脚は MN⁵のユニークな形態を指定する仮説をテストしました。モデルとして系統 B、MNs のうち 7 つを生成し、TFs 後大人の脚 MNs で表現の組合せコードが彼らの個々 の形態を指定することを示した 11 NB 系統の 1 つを使用しました。MNs の TF のコードを reprograming に予測可能な方法で MN の形態を切り替えることがきました。我々 はこれらの TFs を呼び出す: Mtf (形態 TFs)⁵。

大人の MNs の形態学的分析の最も困難な部分の 1 つは高解像度の厚さと自動蛍光キューティクルを介して軸索を視覚化します。我々 は通常DVglut Gal4などのバイナリ表現システムと MNs で表される膜タグ GFP と軸索をラベル/UA mCD8::GFPまたはDVglut QF/擬 mCD8::GFP, DVglutが強いドライバーで表されます運動ニューロン⁶。抑制型マーカー (MARCM)⁷、cis MARCM⁸、または MARCMbow⁵とモザイク解析など他のクローン技術と、これらのツールを組み合わせて、我々 は表現型の分析を行う MNs のサブポピュレーションを GFP 発現を制限できます。簡単に軸索。大人の脚の内部構造の (1) の固定など大人のショウジョウバエ脚に固有の特定の問題に取り組むことによって脚 MN 軸索形態のイメージングおよび後続の三次元再構成のためそのままを維持するためにプロトコルを生成します。軸索形態、内因性の蛍光式、脚の筋肉に影響を与えずに観察の下でそしてイメージング、および (3) 画像のキューティクルを取得する処理のための適切な方向の全体的な構造を維持するために脚の (2) の取付背景として軸索の蛍光信号。このプロトコルは、MN 軸索における蛍光発現の検出のために詳述されている、間は、節足動物の脚 neuromusculature の他のコンポーネントの可視化に適用できます。

プロトコル

1. 足の解剖と固定

1. ガラスのウェル プレートと塗りつぶし 70% エタノールと井戸の適切な数を取る。15-20 CO₂を追加-それぞれに (セックスとあらゆる年齢のいずれか) の麻酔をかけられたハエも、ブラシを使用して軽くエタノール溶液にハエ ハエが完全に水中に沈むまで。
   注: この手順は、キューティクルの疎水性を取り除くことです。これはキューティクルの自己蛍光を増加するため、1 分以上洗浄しないでください。
2. 1 リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) x 0.3% 非イオン性界面活性剤の洗剤液で 3 回ハエをすすいでください。少なくとも 10 分のためのこのソリューションにハエを保ちます。
   注: 洗剤が足の内側固定液の浸透性を高める可能性があるを含むとき足は固定より良いです。
3. 4% パラホルムアルデヒド (PFA) チューブと一緒に氷上ウェル プレートを配置します。
   注: 新鮮な 4% の準備 16 %pfa エタノール フリー ストック溶液から PFA は重要です。
4. 胸部のセグメントまたは足を損なうことがなく頭とハエの腹部を削除するのに鉗子を使用します。
   注: 腹部の取り外し簡単、フライを押しながら足を解剖します。
5. 鉗子で胸部のセグメントから足を分析し、4% を含んでいる井戸に足を置く PFA。このため、微細鉗子の先端を使用して脚が引き抜いて coxa 胸郭ジャンクションで優しく、しっかりとを押してください。
6. 4 %pfa は 4 ° C (約 20 h 合計) で一晩で足を修正します。
7. 1x PBS で 0.3% ノニオン界面活性剤の洗剤液、5 x 20 分間足を洗います。
8. メディアをマウントを洗浄バッファーを交換してください。取付脚にその完全な浸透を可能にする前に少なくとも 1 日のメディアをマウントに足をしてください。
   注: メディアをマウントが高粘度の場合は、粘度の急激な変化を崩壊し、足全体の構造に損傷を与えるキューティクルを引き起こすので、80% に 1 × PBS のメディアをマウントを希釈します。Gal4ドライバーによってハエは取り付けまでメディアのマウントの 4 ° C で 1 ~ 3 週間保存できます。

2. 脚取付

1. 正方形 22 x 22 mm² coverslip (図 2 a、 B) でカバーして顕微鏡スライドの左側に約 20 μ L の 70% のグリセロールを配置します。メディアをマウントし、小さな距離でこの coverslip の右端から平行な線に沿って約 10 μ L をピペットします。スライド (図 2) の右側にさらにメディアをマウントの別の 30 μ L を追加します。
   注: 脚 (下記参照)、coverslip を適用するときメディアをマウント優しく広がっていく、coverslip の下と足の周りそれらをずらすことがなく。
2. 微細鉗子を用いたソリューションから脚を持ち上げ、そっと左 coverslip 近くメディアをマウントの上に置きます。区間ごとに同じことを行うし、上から下 (図 2 D) に配置。
   1. 転送鉗子の両方のヒントの間に開催中のドロップで足を持ち上げて。2 つの方法で脚を方向づける: 外的な側面の上下。
3. (最大 6-8 に脚を取り付けることができます) すべての足が合って、一度上に置く 2 番目 coverslip 足この coverslip かかって少し上、以前に配置した(図 2 e)領域を確保し、coverslip と組織の間にするよう取得破損している (図 2) から足を防止します。
   注: また、coverslip とスライドの間にスペースを作成するのにステッカー井戸や矯正ワックスを使用します。
4. 各端 (図 2 f) coverslips の地位を確保してマニキュアを使用します。
   メモ: 組織、画像の準備ができています。

3. イメージング

1. GFP 蛍光とキューティクル自動蛍光の両方を取得する 488 nm レーザーおよび 2 つの検出器を同時に使用して 1 つのトラックを設定します。ソフトウェアのウィンドウを光パスのスペクトル ウィンドウの範囲コントロールまたはスライダーの表示を使用して、検出の範囲を設定 1 つ検出器 (1 器) 498-535 nm と他の 1 つの間 (検出器 2) 566-652 nm の間。
   注: 通常、1 検出器べき GaAsP 検出器と検出器 2 光電子増倍管。498 535 チャネル最適 GFP シグナルを検出するが、またキューティクルから自動蛍光を検出します。しかし、566-652 チャネルはキューティクル (図 3 a) から自動蛍光だけを検出します。
2. 20 X を使用または 25 倍油浸対物レンズ、1024 x 1024 ピクセルの解像度、12 ビット深度と 1 μ m ピクセルの設定滞留時間約 1.58 μ s として 2 フレーム/画像を平均と Z 間隔を設定します。高開口数と目標を使用します。
3. 共焦点顕微鏡とイメージング ソフトウェアを使用しているに応じて、他のすべての設定を設定します。
   1. 498-535 検出器ではなく 566-652 検出器から明るいキューティクル信号を取得することを確認します。これを行うには、するには、両方器用 488 レーザーのレーザー出力の同じを使用します。十分に明るい GFP 信号 (図 3 b, D) を取得する 1 検出器のゲインを調整最初飽和マーカーを使用して。(図 3E) この検出器の飽和信号を高いキューティクル信号 (足関節の端) と一部の地域に生成を確保する 2 検出器のゲインを調整します。
   2. 脚を拡張し、単一のフレームのイメージを作成するのには大きすぎる場合は、顕微鏡イメージング ソフトウェアからタイルまたは位置オプションを使用します。
4. イメージング ソフトウェアや ImageJ/フィジー フリーウェア (下記参照) を使用して独自の顕微鏡を使用していずれかの最終的な画像を再構築します。

4. 投稿画像の処理

1. ImageJ/フィジーの共焦点スタックを開きます。
   1. Bioformats プラグインを使用 (プラグイン |バイオ形式 |Bio-formats 輸入) フィジーではないイメージを開きます。独自のイメージング ソフトウェア パッケージ⁹から TIF 形式です。
2. 画像を選択して、チャンネルを分割 |カラー |チャンネルの分割。
   注: いくつかの位置からの画像が行われていて、再結合する必要があります、使用ペアワイズ ステッチからフィジーのプラグイン (プラグイン > ステッチ > ペアワイズ ステッチ)^10,11。
3. GFP のキューティクル信号を減算するイメージ電卓を開く (プロセス |イメージ電卓): 画像 1 (GFP + キューティクル) として検出器 1 からスタックを選択 (図 4 a)、操作ウィンドウ [減算を選択し、画像 2 (キューティクル) (図 4 b) として検出器 2 からスタックを選択します。その結果、内因性の GFP シグナル (GFP) だけは (図 4) が取得されます。
   1. このスタック (GFP) 検出器 2 から得られたキューティクル専用のスタックを併合 (図 4 b 画像 |カラー |チャンネルを統合)、脚のセグメント (図 4) 軸索のアーバーを識別することができますキューティクル信号と同様に、組織固有の GFP 信号の構成される RGB 画像を取得します。
   2. 各画像のコントラストと明るさを調整 (画像 |調整 |Brightness/Contrast)、単一の RGB イメージを生成 (画像 |種類 |RGB カラー)。
      注: Z スタックの最大投影を生成する (の画像 |スタック |Z プロジェクト...)、GFP の信号と 2 つのチャネルを結合する前に明るさを調整できます、キューティクルの平均強度の最大強度投影を使用します。
4. また、自動減算と ImageJ/フィジーの画像の処理のため、マクロを使用します。補足的なファイル 1 のマクロ エディターでテキストをコピー (プラグイン |新しい |マクロ)、プラグイン フォルダーにマクロを保存し、マクロを使用できるように一度 ImageJ/フィジーを再起動します。
   1. マクロを使用する共焦点スタックを開き、明るさ/コントラスト] ウィンドウを開きます (画像 |調整 |Brightness/Contrast)。マクロを実行して (プラグイン |マクロ |実行) し、指示に従います。
   2. 操作 (画像 [電卓] ウィンドウ) を指定するように求めるメッセージが表示されたら、(GFP) スタック 1 として画像 1、画像 2 スタック 2 として (表皮)、および減算を選択します。
      注: マクロは、GFP 信号処理 (stack1 の MAX_Result) の最大投影画像を生成しますキューティクル (AVG_stack2) GFP スタック (stack1 の結果)、未処理のキューティクル スタックの減算の結果の平均の投影キューティクル スタック (stack2)。
   3. コントラストを調整するように求めるメッセージが表示されたら、明るさ/コントロール ウィンドウのコントロールを使用して、GFP を示す両方の信号を RGB マージされた画像を生成する、キューティクルの平均の投影の GFP の最大投影画像の明るさ/コントラストを調整するには緑と灰色でキューティクル。同様に次の段階で使用することができます結合された GFP とキューティクルのスタックを生成する stack1 と stack2 の結果をマージします。
5. 3 つの次元に足を視覚化し、新しく生成されたスタック (図 4E) と専用の 3 D ソフトウェアを使用します。
   1. 3 D ソフトウェアで RGB のスタックを開く (材料の表を参照してください)。ポップアップ ダイアログ ウィンドウ モード変換」セクションですべてのチャンネルを選択し、ボクセル (ピクセルの量) のサイズを入力します。
      注: すべての必要な情報は、使用されているどのような独自の顕微鏡のソフトウェアからイメージ ファイルに含まれます。
   2. チャネル 2 モジュール (gfp) を右クリックし、選択表示 | volren。次に、 volren モジュールをクリックします。(画面左下) の [プロパティ] セクションで編集を左クリックし、 volrengreen.colを選択します。チャンネル 1 モジュール (キューティクル信号) を右クリックし、選択表示 | volren。次に、 volren モジュールをクリックします。高度で選択ddr (透明なレントゲン写真のような表示) の [プロパティ] セクションで左クリックで、キューティクル背景 (図 4E) を参照してくださいにガンマ値を調整します。
   3. 3 D 回転を生成するには、プロジェクトのスタック モジュールを右クリックします。選択アニメーション | 回転。回転モジュールをクリックします。
   4. プロパティセクションはbbox センターを使用をクリックします。回転モジュールを右クリックし、選択計算 | ムービー メーカー。ムービー メーカーでは、モジュールは、マウスの左ボタンをクリックします。左上詳細を左クリックして [プロパティ] セクション ([プロパティ] セクションの右上)。
   5. ファイル名フィールドで映画回転の名前を入力します。品質フィールド 1 (最高の品質) を記述します。200 のフレームのままに 8.3 の s 回転が必要な場合 (この数を減少または回転の速度を変更するのには増加することができます)。(緑のボタン、プロパティ セクション (を参照してくださいビデオ 1) の左下)適用を押します。

結果

図 4に示すとおり、この手順はそのターミナル アーバーと共に大人のショウジョウバエ脚で GFP 標識軸索の優れたイメージングをできます。重要なの脚キューティクルによって放出される蛍光から任意の汚染のないクリーンな GFP 信号が得られます。キューティクルからの信号は、GFP 信号 (ビデオ 1、図 1、

ディスカッション

多くの暗い顔料を含んだ大人のショウジョウバエと他の節足動物のキューティクルは、自分の体の内部構造を表示するための主要な障害です。さらに、それは強く固定によって悪化している自動蛍光です。これらの 2 つの機能は、蛍光染料または外骨格を持つ動物の体内分子の観測は非常に問題になります。

手順については、ラボで日常的に使用する軸索軌道と大人の

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ethanol absolute	Fisher	E/6550DF/17	Absolute analytical reagent grade
nonionic surfactant detergent	Sigma-Aldrich	T8787	Triton X-100, for molecular biology
Fine forceps	Sigma-Aldrich	F6521	Jewelers forceps, Dumont No. 5
Glass multi-well plate	Electron Microscopy Sciences	71563-01	9 cavity Pyrex, 100 mm x 85 mm
PFA	Thermofisher	28908	Pierc 16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free
Glycerol	Fisher BioReagents	BP 229-1	Glycerol (Molecular Biology)
Spacers	Sun Jin Lab Co	IS006	iSpacer, four wells, around 12 μL working volume per well, 7 mm diameter, 0.18 mm deep
Square 22 mm x 22 mm coverslips	Fisher Scientific	FIS#12-541-B	No.1.5-0.16 to 0.19 mm thick
Mounting Medium	Vector Laboratories	H-1000	Vectashield Antifade Mounting Medium
Confocal microscope	Carl Zeiss		LSM780; objective used LD LCI Plan-Apochromat 25X/0.8 Imm Korr DIC M27 (oil/ silicon/glycerol/water immersion) (420852-9871-000)
imaging software	Carl Zeiss		ZEN 2011
3D-Image software	ThermoFisher Scientific		Amira 6.4
ImageJ	National Institutes of Health	https://imagej.nih.gov/ij/	ImageJ/FIJI