Visualizar Drosophila pierna axones de la neurona de Motor a través de la cutícula del adulto

Resumen

Aquí se describe un protocolo para visualizar la orientación axonal con una proteína fluorescente en piernas de adultos del Drosophila por fijación, montaje, proyección de imagen y la proyección de imagen de pasos.

Resumen

La mayoría del trabajo sobre la especificación neuronal se ha realizado en modelos genético y fisiológico manejables como C. elegans, Drosophila larvas y peces, que participan en movimientos ondulatorios (como gatear o natación) como su principal modo de locomoción. Sin embargo, una más sofisticación comprensión de la especificación de cada motoneurona (MN), por lo menos en cuanto a informar a terapias de la enfermedad, exige un sistema igualmente manejable que mejor modela los sistemas complejos basados en apéndices de locomoción de vertebrados. El adulto Drosophila aparato locomotor encargado de caminar cumple todos estos criterios con facilidad, ya que en este modelo es posible estudiar la especificación de un número pequeño de piernas fácilmente distinguido MNs (aproximadamente 50 minutos por pierna) usan una gran matriz de herramientas genéticas de gran alcance y en el contexto fisiológico de un sistema de locomoción basado en el apéndice. Aquí se describe un protocolo para visualizar la inervación del músculo de la pierna en una mosca adulta.

Introducción

Como la extremidad vertebrada, la pierna de adultos del Drosophila está organizada en segmentos. Cada pata de mosca contiene 14 músculos, cada uno de los cuales consta de múltiples fibras musculares^1,2. Los cuerpos celulares de los MNs de pierna adulto se encuentran en la T1 (protorácico), T2 (mesotorácicos) y T3 (metathoracic) ganglios a cada lado de la cuerda ventral del nervio (VNC), un estructural análoga a la médula espinal vertebrada (figura 1). Hay aproximadamente 50 minutos en cada uno de los ganglios, cuyo objetivo los músculos en cuatro segmentos de la pierna ipsolateral (coxa, trocánter, fémur y tibia) (figura 1)³. Lo importante, cada pierna adulto individual MN tiene una única identidad morfológica que es altamente estereotipada entre animales^3,4. Todos estos MNs únicas derivan de 11 células madre, llamadas neuroblastos (NBs) produciendo MNs de la pierna durante los estadios larvarios^3,4. Al final de las etapas larvales todos los MNs postmitotic inmaduros diferencian durante la metamorfosis al adquirir sus árboles dendríticos específicos y objetivos terminal axonales que definen su morfología única^3,4. Previamente hemos probado la hipótesis de que un código de combinatorio de factores de transcripción (TFs) especifica la morfología única de cada pata de adultos del Drosophila MN⁵. Como modelo, se utilizó el linaje B, uno de los 11 linajes NB que produce siete de los MNs y demostró que un código combinatorio de TFs en pierna adulto postmitotic MNs dicta sus morfologías individuales. Por reprogramación del código TF de MNs hemos podido cambiar morfologías MN de manera predecible. Llamamos estos TFs: SMN (morfológicos TFs)⁵.

Una de las partes más difíciles de los análisis morfológicos de adultos MNs es visualizar los axones a través de una cutícula gruesa y auto-fluorescente con alta resolución. Generalmente la etiqueta de axones con un GFP etiquetadas de membrana que se expresa en el MNs con un sistema binario de la expresión, como DVglut-Gal4/UAS-mCD8::GFP o DVglut QF / QUAS mCD8::GFP, donde DVglut es un fuerte conductor expresado en motoneurons⁶. Al combinar estas herramientas con otras técnicas clonales tales como análisis de mosaico con un marcador repressible (MARCM)⁷, MARCM cis⁸o MARCMbow⁵, podemos restringir la expresión de GFP en subpoblaciones de MNs haciendo el análisis fenotípico de axones más fácil. Hemos generado un protocolo para mantener la pierna morfología axonal MN intacto para la imagen y posterior reconstrucción 3D abordando cuestiones intrínsecas a la pierna de Drosophila adulta tales como (1) fijación de las estructuras internas de la pierna adulto sin afectar la morfología de axón, endógena expresión fluorescente y musculatura de la pierna, (2) montaje de la pierna para preservar la estructura general bajo un cubreobjetos y con la orientación adecuada para la proyección de imagen y (3) de procesamiento de imágenes para obtener la cutícula fondo como señal fluorescente axonal. Aunque este protocolo ha sido detallada para la detección de la expresión fluorescente en axones MN, puede aplicarse para visualizar otros componentes del neuromusculature de la pierna en los artrópodos.

Protocolo

1. disección y fijación de la pierna

1. Tomar una placa de cristal de varios pocillos y número apropiado llenado de pozos con etanol al 70%. Añadir 15-20 CO₂-moscas anestesiados (de cualquier sexo y cualquier edad) a cada uno bien y usando un cepillo, frote suavemente las moscas en la solución de etanol hasta que moscas son completamente sumergidas.
   Nota: Este paso es eliminar la hidrofobicidad de la cutícula. No se lave durante más de 1 minuto, porque esto aumenta auto fluorescencia de la cutícula.
2. Enjuague las moscas 3 veces con solución de detergente de surfactante no iónico de 0,3% en el 1 x de tampón fosfato salino (PBS). Mantenga las moscas en esta solución durante al menos 10 minutos.
   Nota: Las piernas se fijan mejor cuando incluyendo detergente que es probable que aumente la penetración del fijador en la pierna.
3. Coloque una placa multi-bien en el hielo junto con un tubo de 4% paraformaldehido (PFA).
   Nota: La preparación del fresco 4% PFA de una solución stock libre 16% PFA etanol es crítico.
4. Utilizar pinzas para quitar la cabeza y el abdomen de las moscas sin dañar el segmento torácico o las piernas.
   Nota: Quitar el abdomen hace más fácil mantener la mosca y diseccionar las piernas.
5. Diseccionar las piernas desde el segmento torácico con pinzas y coloque las patas en los pozos que contienen 4% PFA. Para ello, presione suavemente pero con firmeza en el cruce de cadera tórax con la punta de la pinza fina hasta que la pierna se separa.
6. Fijar las patas en el 4% PFA durante la noche a 4 ° C (aproximadamente 20 h total).
7. Lavar las piernas con detergente surfactante no iónico de 0.3% en PBS 1 x, 5 x 20 min.
8. Vuelva a colocar el tampón de lavado con medio de montaje. Mantenga la pierna en medio de montaje para al menos un día antes del montaje para permitir su penetración total en la pierna.
   Nota: Si el medio de montaje es altamente viscoso, diluir el medio de montaje al 80% con PBS 1 x debido al cambio repentino de viscosidad puede causar la cutícula y dañar la estructura global de la pierna. Según el conductor de Gal4 , moscas pueden conservarse durante 1 a 3 semanas a 4 ° C en los medios de montaje hasta el montaje.

2. pierna de montaje

1. Colocar aproximadamente 20 μl de glicerol al 70% en el lado izquierdo de un portaobjetos y cubrir con un cubreobjetos de² cuadrado 22 x 22 mm (figura 2A, B). Pipetear 10 μl de medio de montaje a lo largo de una línea paralela y a una pequeña distancia desde el borde derecho de este cubreobjetos. Añadir otro 30 μl de medio de montaje más a la derecha de la diapositiva (figura 2).
   Nota: Cuando se aplica un cubreobjetos sobre las piernas (véase abajo) el medio de montaje suavemente extenderá bajo el cubreobjetos y alrededor de las piernas sin les desplazamiento de.
2. Con unas pinzas finas Levante la pierna de la solución y ponga suavemente en el medio de montaje cerca de cubreobjetos izquierdo. Lo mismo para cada pierna y alinearlos de arriba hacia abajo (Figura 2D).
   1. Levantar y transferir las piernas en una gota de medio entre ambas puntas de las pinzas. Orientar las piernas de dos maneras: lado externo hacia arriba o hacia abajo.
3. Una vez que todas las patas (hasta 6 – 8 patas pueden montarse) estén alineadas correctamente, ponga un cubreobjetos segundo sobre las patas que este cubreobjetos descansa ligeramente sobre el cubreobjetos previamente colocado (Figura 2E) para permitir el espacio entre el cubreobjetos y el tejido y evitar que las piernas de conseguir dañado (figura 2).
   Nota: Alternativamente, utilizar etiqueta pozos o cera de ortodoncia para crear espacio entre el cubreobjetos y la diapositiva.
4. Utilice un esmalte de uñas para fijar la posición de los cubreobjetos en cada esquina (figura 2F).
   Nota: El tejido está ahora a la imagen.

3. la proyección de imagen

1. Establecer una sola pista usando el láser de 488 nm y dos detectores simultáneamente para obtener la fluorescencia de GFP y cutícula auto-fluorescencia. Mediante el control de rango o la pantalla de control deslizante en la ventana espectral de la ventana de la trayectoria de la luz del software, establece el alcance de la detección de un detector (detector 1) entre 498 – 535 nm y la de la otra (detector 2) entre 566 652 nm.
   Nota: Normalmente, el detector 1 debe ser un detector de GaAsP y el detector 2 un tubo fotomultiplicador. El canal de 498 535 óptimo detecta señal GFP pero también detecta fluorescencia automático desde la cutícula. Sin embargo, el canal de 566 – 652 detecta sólo la fluorescencia del auto de la cutícula (Figura 3A).
2. Use un 20 X o 25 X objetivo de inmersión, resolución de 1024 x 1024 Pixeles, 12 bits de profundidad de aceite y establecer el espaciado Z 1 μm. Set pixel detención tiempo como μs aproximadamente 1,58 y media imagen de Marcos 2. Utilizar objetivos con apertura numérica alta.
3. Configurar todos los otros ajustes, dependiendo del microscopio confocal y software de uso.
   1. Asegúrese de obtener una señal más brillante de la cutícula del detector 566-652 en lugar del detector 498 – 535. Para ello, utilice la misma energía del laser del laser de 488 para ambos detectores. Primero usando los marcadores de saturación, ajustar la ganancia del detector 1 para obtener una señal lo suficientemente brillante de GFP (figura 3B, D). Ajuste la ganancia del detector 2 para asegurarse de que algunas áreas con señal de alto de la cutícula (bordes de las piernas, articulaciones) producen una señal saturada en este detector (figura 3, E).
   2. Si la pierna es extendida y demasiado grande para ser reflejada en un solo cuadro, utilice la opción posición de azulejo o desde el software de proyección de imagen del microscopio.
4. Reconstruir las imágenes finales ya sea usando el microscopio patentado software de imágenes o utilizar ImageJ/FIJI freeware (véase abajo).

4. post procesamiento de imágenes

1. Abra la pila confocal en ImageJ/FIJI.
   1. Usar el plugin de Bioformats (Plugins | Bio-formatos | Importador bio-Formats) en FIJI para abrir imágenes que no están en. Formato TIF de propietario de paquetes de software⁹.
2. Dividir los canales seleccionando imagen | Color | Dividir canales.
   Nota: Si imágenes de varias posiciones se hicieron y deben ser recombinadas, utilice los pares plugin en FIJI de la costura (Plugins > costura > Pairwise costura)^10,11.
3. Para restar la señal de la cutícula de la señal de la GFP, abrir la calculadora de imagen (proceso | Calculadora de la imagen): seleccione la pila del detector 1 imagen 1 (GFP + cutícula) (Figura 4A), en la ventana de operación seleccione restary seleccionar la pila del detector 2 imagen 2 (cutícula) (Figura 4B). Como resultado, sólo la señal endógena de la GFP (GFP) se obtiene (figura 4).
   1. Unir nuevamente esta pila (GFP) con la pila 'sólo cutícula' obtenida de detector 2 (Figura 4B imagen | Color | Combinar canales) para obtener una imagen RGB que consta de la señal GFP de tejidos específicos, así como la señal de la cutícula, que ayuda a identificar los cenadores del axón dentro de los segmentos de la pierna (figura 4).
   2. Ajustar contraste y brillo de cada imagen (imagen de| Ajustar | Brightness/Contrast) y luego generar una sola imagen RGB (imagen de| Tipo | Color RGB).
      Nota: Para generar una proyección máxima de la pila de Z (imagen | Pilas | Proyecto Z...), uso de proyección de máxima intensidad para la GFP señal y la intensidad media de la cutícula, que luego se puede ajustar para brillo antes de la fusión de los dos canales.
4. Alternativamente, utilice una macro para resta automático y procesamiento de imágenes ImageJ/Fiji. Copiar el texto suplementario 1 archivo en el editor de macros (Plugins | Nuevo | Macro), guardar la macro en la carpeta de Plugins y reiniciar ImageJ/FIJI una vez para poder utilizar la macro.
   1. Para utilizar la macro, abra la pila confocal y la ventana de brillo/contraste (imagen de| Ajustar | Brightness/Contrast). Ejecute la macro (Plugin | Macro | Ejecutar) y siga las instrucciones.
   2. Cuando se le preguntó para especificar la operación (ventana de la calculadora de imagen), seleccione 1 imagen como pila 1 (GFP), imagen 2 como pila 2 (cutícula) y restar.
      Nota: La macro genera una imagen de la proyección máxima de la señal procesada de GFP (MAX_Result de stack1), una proyección media de la cutícula (AVG_stack2), el resultado de la resta de la pila de la cutícula de la pila GFP (resultado de stack1) y los no procesados pila de cutícula (stack2).
   3. Cuando se le preguntó a ajustar el contraste, utilice los controles en la ventana de control de brillo para ajustar el brillo/contraste de la imagen de la proyección máxima de GFP y de la proyección media de la cutícula, para generar una imagen fusionada de RGB de ambas señales mostrando la GFP en verde y la cutícula en gris. Combinar resultado de stack1 y stack2, asimismo generar una combinado pila GFP y cutícula que puede ser utilizada en la siguiente etapa.
5. Para visualizar las piernas en tres dimensiones, utiliza software 3D especializado con las pilas recién generadas (figura 4E).
   1. Abra la pila RGB con software 3D (véase Tabla de materiales). En la ventana de diálogo emergente, seleccione todos los canales en la sección de conversión de modo e introduzca el tamaño de un voxel (volumen de un píxel).
      Nota: Toda la información necesaria está contenida en los archivos de imagen de cualquier software propietario microscopio uso.
   2. El módulo de canal 2 (señal GFP), haga clic derecho y seleccionar pantalla | volren. A continuación, haga clic en el módulo volren. En la sección de propiedades (parte inferior izquierda de la pantalla) haga clic en izquierda en editar y seleccione volrengreen.col. El módulo de canal 1 (señal de cutícula) con el botón derecho y seleccione pantalla | volren. A continuación, haga clic en el módulo volren. En la sección de propiedades haga clic en avanzadas y seleccione ddr (una pantalla de radiografía como transparente), luego ajuste el valor de gamma para ver el fondo de la cutícula (figura 4E).
   3. Para generar un giro 3D, haga clic en el módulo de pila de proyecto. A continuación, seleccione animar | girar. Haga clic en el módulo de gire.
   4. En las propiedades de sección haga clic en utilizar bbox centro. En el módulo de rotación con el botón derecho y seleccione computar | cineasta. En el módulo de cineasta haga clic en el botón izquierdo del ratón. En la sección de propiedades haga clic izquierdo en Advanced (parte superior derecha de la sección de propiedades).
   5. En el campo de nombre de archivo llene el nombre de la rotación de la película. En cuanto a calidad , escriba 1 (máxima calidad). Deja marco a 200 si se desea una rotación s 8.3 (este número puede ser reducido o aumentado para modificar la velocidad de la rotación). Continuación, pulse aplicar (botón verde, parte inferior izquierda de la sección de propiedades (ver Video 1)).

Resultados

Como se muestra en la figura 4, este procedimiento permite la proyección de imagen excelente de axones GFP marcado en piernas de Drosophila adultas, junto con sus cenadores del terminal. Lo importante es que se obtiene una señal limpia de GFP sin ninguna contaminación de la fluorescencia emitida por la cutícula de la pierna. La señal de la cutícula puede combinarse entonces con la señal de la GFP para identificar el posicionamiento de los axon...

Discusión

La cutícula de la Drosophila adulta y de otros artrópodos, que contiene muchos pigmentos oscuros, es un obstáculo importante para la visualización de estructuras dentro de su cuerpo. Además, es fuertemente auto fluorescente que es hecho peor por la fijación. Estas dos características son muy problemáticas para las observaciones de colorantes fluorescentes o moléculas dentro del cuerpo de los animales con un exoesqueleto.

El procedimiento que hemos descrito y que habitualmente utilizam...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ethanol absolute	Fisher	E/6550DF/17	Absolute analytical reagent grade
nonionic surfactant detergent	Sigma-Aldrich	T8787	Triton X-100, for molecular biology
Fine forceps	Sigma-Aldrich	F6521	Jewelers forceps, Dumont No. 5
Glass multi-well plate	Electron Microscopy Sciences	71563-01	9 cavity Pyrex, 100 mm x 85 mm
PFA	Thermofisher	28908	Pierc 16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free
Glycerol	Fisher BioReagents	BP 229-1	Glycerol (Molecular Biology)
Spacers	Sun Jin Lab Co	IS006	iSpacer, four wells, around 12 μL working volume per well, 7 mm diameter, 0.18 mm deep
Square 22 mm x 22 mm coverslips	Fisher Scientific	FIS#12-541-B	No.1.5-0.16 to 0.19 mm thick
Mounting Medium	Vector Laboratories	H-1000	Vectashield Antifade Mounting Medium
Confocal microscope	Carl Zeiss		LSM780; objective used LD LCI Plan-Apochromat 25X/0.8 Imm Korr DIC M27 (oil/ silicon/glycerol/water immersion) (420852-9871-000)
imaging software	Carl Zeiss		ZEN 2011
3D-Image software	ThermoFisher Scientific		Amira 6.4
ImageJ	National Institutes of Health	https://imagej.nih.gov/ij/	ImageJ/FIJI