Drosophila Bein Motoneuronen Axone durch die Erwachsenen Nagelhaut zu visualisieren

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Visualisierung der axonalen targeting mit ein fluoreszierendes Protein in Erwachsenen Beinen von Drosophila durch Fixierung, Montage, imaging und Post-Bildgebung Schritte.

Zusammenfassung

Der Großteil der Arbeit auf der neuronalen Spezifikation wurde in genetisch und physiologisch gefügig Modellen wie z.B. Cdurchgeführt. Elegans, Drosophila Larven und Fische, die alle in Mischstrom Bewegungen (wie kriechen oder Schwimmen) als ihre primäre Form der Fortbewegung zu engagieren. Jedoch eine anspruchsvollere Verständnis der einzelnen Motoneuron (MN) Spezifikation – zumindest in Bezug auf die Information der Krankheit Therapien – erfordert eine ebenso steuerbar System, das besser die komplexen Anhängsel-basierte Fortbewegung Systeme der Modelle Wirbeltiere. Erwachsenen Drosophila Bewegungsapparates verantwortlich für zu Fuß erfüllt alle diese Kriterien mit Leichtigkeit, da in diesem Modell es möglich ist, die Spezifikation einer kleinen Anzahl von leicht unterschieden Bein MNs (ca. 50 MNs pro Bein) zu studieren beide mit einem riesigen Reihe von genetischen Werkzeuge und in der physiologischen Rahmen ein Anhängsel-basierte Fortbewegung. Hier beschreiben wir ein Protokoll, um das Bein Muskel Innervation in einem Erwachsenen fliegen zu visualisieren.

Einleitung

Wie das vertebrate Glied gliedert sich die Drosophila Erwachsenen Bein in Segmente. Jede Fliege Bein enthält 14 Muskeln, von die jeder mehrere Muskelfasern^1,2umfasst. Die Zellkörper der Erwachsenen Bein MNs befinden sich in der T1 (prothoracic), T2 (mesothoracic) und T3 (metathoracic) Ganglien auf jeder Seite der ventralen Nervenstrang (VNC), strukturell analog zu den Wirbeltieren Rückenmark (Abbildung 1). In jedem Ganglien, welches Ziel in vier Segmenten des ipsilateralen Beins (Coxa, Trochanter, Femur und Tibia) (Abbildung 1)³Muskeln gibt es etwa 50 MNs. Wichtig ist, hat jedes einzelnen Erwachsenen Bein MN eine eindeutige morphologische Identität, die zwischen Tieren^3,4sehr Stereotyp ist. Diese einzigartige MNs stammen aus 11 Stammzellen genannt Neuroblasten (NBs) produzieren Bein MNs während der Larvenstadien^3,4. Am Ende alle Larvenstadien unterschieden werden die unreifen postmitotischen MNs während der Metamorphose zu erwerben, ihre spezifischen dendritischer Dorne und axonalen terminal Ziele, die ihre einzigartigen Morphologie^3,4definieren. Zuvor haben wir die Hypothese, dass ein kombinatorischer Code von Transkriptionsfaktoren (TFs) die einzigartige Morphologie jedes Drosophila Erwachsenen Bein MN^{5 gibt}getestet. Als ein Modell haben wir Linie B, einer der 11 NB Linien die sieben von der MNs produziert und hat gezeigt, dass ein kombinatorischer Code von TFs in postmitotischen Erwachsenen Bein MNs ausgedrückt ihre individuelle Morphologien diktiert. Durch Umprogrammieren des TF-Codes des MNs konnten wir MN Morphologien in einer vorhersagbaren Weise wechseln. Wir nennen diese TFs: MTF (morphologische TFs)⁵.

Eines der schwierigsten Teile der morphologischen Analysen der Erwachsenen MNs ist die Axone durch eine Dicke und Auto-fluoreszierende Kutikula mit hoher Auflösung zu visualisieren. Wir bezeichnen in der Regel Axone mit einer Membran-Tags GFP, die mit einem binären Ausdruck System, wie DVglut-Gal4MNs ausgedrückt wird /FH-mCD8::GFP oder DVglut-QF / QUAS mCD8::GFP, wo DVglut ist ein starker Motor, ausgedrückt in Motoneurone⁶. Durch die Kombination dieser Tools mit anderen klonalen Techniken wie Mosaik-Analyse mit einem tragen Marker (MARCM)⁷, Cis-MARCM⁸oder MARCMbow⁵, können wir die GFP Ausdruck Subpopulationen von MNs die phänotypische Analyse beschränken. der Axone einfacher. Wir haben ein Protokoll erzeugt, um Bein MN axonalen Morphologie für Bildbearbeitung und anschließende 3D-Rekonstruktion intakt zu halten, durch bestimmte Fragen untrennbar mit den Erwachsenen Drosophila Bein wie (1) Fixierung der internen Strukturen von Erwachsenen Bein ohne Axon Morphologie, endogene fluoreszierende Ausdruck und Beinmuskulatur, (2) Montage des Beines, die gesamte Struktur unter einem Deckgläschen und in der entsprechenden Orientierung für Bildverarbeitungs-Bildgebung und (3) um die Nagelhaut zu erhalten zu bewahren Hintergrund sowie axonalen Fluoreszenzsignal. Während dieses Protokolls für den Nachweis von fluoreszierenden Ausdruck in MN Axone detailliert wurde, kann es angewendet werden, um andere Bestandteile des Bein Neuromusculature in Arthropoden zu visualisieren.

Protokoll

1. Bein Dissektion und Fixierung

1. Nehmen Sie ein Glas Multi-well-Platte und Füllung entsprechende Anzahl von Brunnen mit 70 % Ethanol. Hinzufügen von 15 – 20 CO₂-narkotisierten fliegen (der entweder Sex und jeden Alters) für jeden gut und mit einem Pinsel, sanft Tupfen die fliegen in die Ethanol-Lösung bis fliegen vollständig untergetaucht sind.
   Hinweis: Dieser Schritt ist der Hydrophobie der Nagelhaut entfernen. Nicht für mehr als 1 min waschen Sie, weil das Auto-Fluoreszenz der Kutikula erhöht.
2. Spülen Sie die fliegen 3 Mal mit 0,3 % nichtionische Tenside Reinigungslösung in 1 x Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS). Halten Sie die fliegen in dieser Lösung für mindestens 10 Minuten.
   Hinweis: Beine sind besser fixiert, wenn Reinigungsmittel, einschließlich Eindringen von das Fixiermittel der Bein-Innenseite erhöhen dürfte.
3. Legen Sie eine Multi-well-Platte auf dem Eis zusammen mit einem Rohr von 4 % Paraformaldehyd (PFA).
   Hinweis: Die Zubereitung von frischem 4 % PFA aus einer 16 % PFA Ethanol frei Vorratslösung ist wichtig.
4. Verwenden Sie Zange um den Kopf und Bauch der fliegen zu entfernen ohne Beschädigung der thorakalen Segment oder die Beine.
   Hinweis: Entfernen den Bauch erleichtert die Fliege zu halten und zu zergliedern, die Beine.
5. Die Beine aus dem thorakalen Segment mit der Pinzette zu sezieren und legen Sie die Beine in den Vertiefungen, die mit 4 % PFA. Hierzu drücken Sie sanft, aber bestimmt an der Coxa-Thorax-Kreuzung mit der Spitze eines feinen Pinzette, bis das Bein löst.
6. Befestigen Sie die Beine in 4 % PFA über Nacht bei 4 ° C (insgesamt ca. 20 h).
7. Waschen Sie die Beine mit 0,3 % nichtionische Tenside Reinigungslösung mit 1 X PBS-Puffer, 5 X 20 Minuten.
8. Ersetzen Sie die Wasch-Puffer mit Eindeckmedium. Halten Sie das Bein in Eindeckmedium für mindestens einen Tag vor der Montage, um seine komplette Eindringen in das Bein zu ermöglichen.
   Hinweis: Wenn das Eindeckmittel sehr zähflüssig ist, verdünnen Sie Eindeckmittel zu 80 % mit 1 X PBS da die plötzliche Änderung der Viskosität die Kutikula zusammenbrechen und beschädigen die Gesamtstruktur des Beines führen kann. Je nach Gal4 -Treiber können fliegen für 1 bis 3 Wochen bei 4 ° C in Medien bis Montage Montage konserviert werden.

2. Bein Montage

1. Legen Sie ca. 20 µL 70 % Glycerin auf der linken Seite eine Mikroskop-Objektträger und Abdeckung mit einem Quadrat 22 x 22 mm² Deckgläschen (Abb. 2A, B). Pipette ca. 10 µL Eindeckmedium entlang einer Linie parallel und auf einem kleinen Abstand vom rechten Rand dieses Deckglas. Fügen Sie ein weiteres 30 µL Eindeckmedium weiter auf der rechten Seite der Folie (Abbildung 2).
   Hinweis: Bei einem Deckgläschen über den Beinen (siehe unten) wird das Eindeckmittel sanft unter dem Deckglas und um die Beine ausbreiten ohne sie zu verdrängen.
2. Mit feinen Pinzette heben Sie das Bein von der Lösung und sanft auf das Eindeckmittel in der Nähe der linken Deckglas. Machen Sie dasselbe für jedes Bein und Ausrichten von oben nach unten (Abb. 2D).
   1. Heben und die Beine in einem Tropfen des Mediums zwischen beiden Spitzen der Zange gehalten zu übertragen. Richten Sie die Beine auf zwei Arten: externe Seite nach oben oder unten.
3. Sobald alle Beine (oben zu 6 – 8 Beine montiert werden können) richtig ausgerichtet sind, stellen Sie eine zweite Deckglas über die Beine so, dass das Deckglas etwas auf die zuvor platzierten Deckglas (Abb. 2E ruht) Raum zwischen dem Deckglas und das Gewebe und ermöglichen verhindern, dass die Beine aus immer beschädigt (Abbildung 2).
   Hinweis: Alternativ verwenden Sie Aufkleber Brunnen oder kieferorthopädischen Wachs Raum zwischen dem Deckglas und der Folie zu schaffen.
4. Verwenden Sie einen Nagellack, um die Position von Deckgläsern an jeder Ecke (Abb. 2F) zu sichern.
   Hinweis: Das Gewebe ist nun bereit zum Bild.

(3) Bildgebung

1. Richten Sie eine einzelne Spur mit 488 nm-Laser und zwei Detektoren gleichzeitig die GFP Fluoreszenz und Nagelhaut Auto-Fluoreszenz zu erhalten. Legen Sie mithilfe den Range-Regler oder den Schieberegler Display in der spektralen Dialogfenster der Lichtweg der Software die Reichweite von einem Detektor (1) zwischen 498 – 535 nm und derjenigen der anderen (Detektor 2) zwischen 566-652 nm.
   Hinweis: In der Regel der Detektor 1 sollte ein GaAsP-Detektor und der Detektor 2 einen Photomultiplier Röhre. 498-535-Kanal optimal GFP Signal erkennt, sondern auch erkennt Auto-Fluoreszenz von der Kutikula. 566-652-Kanal erkennt jedoch nur die Auto-Fluoreszenz von der Kutikula (Abb. 3A).
2. Verwenden Sie ein 20 X oder 25 X Öl Immersion Ziel, 1024 x 1024 Pixel Auflösung, 12-Bit-Tiefe, und Z Abstand als 1 µm. Set Pixel wohnen Zeit wie etwa 1,58 µs und durchschnittlich 2 Frames/Bild. Verwenden Sie Ziele mit hoher numerischer Apertur.
3. Legen Sie alle anderen Einstellungen, je nach confocal Mikroskop und imaging-Software verwendet wird.
   1. Achten Sie darauf, ein heller Kutikula-Signal von 566-652-Detektor nicht von 498 – 535-Detektor zu erhalten. Zu diesem Zweck, verwenden Sie die gleichen Laserleistung von 488-Laser für beide Detektoren. Passen Sie mithilfe der Sättigung Marker zunächst die Verstärkung des Detektors 1 um ein hell genug GFP-Signal (Abb. 3 b, D) zu erhalten. Passen Sie dann die Verstärkung des Detektors 2 um sicherzustellen, dass einige Bereiche mit hohen Kutikula Signal (Kanten der Beine, Gelenke) eine gesättigte Signal in dieser Detektor (Abbildung 3, E) zu erzeugen.
   2. Wenn das Bein erweitert und zu groß, um in ein einzelnes Bild abgebildet ist, die Option Kachel oder Position von der Mikroskop-imaging-Software.
4. Die fertigen Bilder entweder das proprietäre Mikroskop imaging-Software oder mit ImageJ/Fidschi Freeware (siehe unten) zu rekonstruieren.

4. buchen Sie Imaging-Verarbeitung

1. Öffnen Sie die konfokalen Stack in ImageJ/Fidschi.
   1. Verwenden Sie das Bioformats-Plugin (Plugins | Bio-Formate | Bio-Formats Importeur) in Fidschi Bilder öffnen, die nicht im. TIF-Format von proprietären imaging Software-Pakete-⁹.
2. Aufteilen der Kanäle durch die Auswahl Bild | Farbe | Split-Kanäle.
   Hinweis: Wenn Bilder aus mehreren Positionen vorgenommen wurden und neu kombiniert werden müssen, verwenden Sie den paarweisen Plugin in Fidschi von Nähten (Plugins > Stitching > paarweise Nähte)^10,11.
3. Um die Nagelhaut-Signal aus dem GFP-Signal zu subtrahieren, öffnen Sie den Bildrechner (Prozess | Bildrechner): Wählen Sie den Stapel aus Detektor 1 Bild 1 (GLP + Nagelhaut) (Abb. 4A), auf das Bedienfenster wählen Sie subtrahieren, und den Stapel von Detektor 2 als Bild 2 (Cuticula) (Abbildung 4 b). Dadurch erhält man nur die endogene GFP Signal (GLP) (Abbildung 4).
   1. Verschmelzen wieder dieses Stapels (GFP) mit dem "Kutikula-only" Stack von Detektor 2 erhalten (Abbildung 4 b Bild | Farbe | Kanäle zusammenfügen) zu erhalten, ein RGB-Bild, bestehend aus der gewebespezifischen GFP Signal als auch die Nagelhaut-Signal, das hilft, Ermittlung der Axon Lauben innerhalb der Bein-Segmente (Abbildung 4).
   2. Stellen Sie Kontrast und Helligkeit der einzelnen Bilder (Bild | Anpassen | Brightness/Contrast) und erzeugen Sie dann ein einzelnes RGB-Bild (Bild | Typ | RGB-Farbe).
      Hinweis: Um eine maximale Projektion des Z-Stack zu generieren (Bild | Stapel | Z-Projekt...), verwenden Sie maximale Intensität Projektion für die GFP Signal und durchschnittliche Intensität für die Kutikula, die dann für die Helligkeit vor dem Zusammenführen der beiden Kanäle eingestellt werden kann.
4. Alternativ können Sie ein Makro für automatische Subtraktion und Verarbeitung von Bildern in ImageJ/Fidschi. Kopieren Sie den Text in ergänzende Datei 1 in der Makro-Editor (Plugins | Neu | Makro), speichern Sie das Makro im Ordner "Plugins" und ImageJ/Fidschi einmal neu starten, um das Makro zu verwenden können.
   1. Um das Makro zu verwenden, öffnen Sie die konfokalen Stack und die Helligkeit/Kontrast-Fenster (Bild | Anpassen | Brightness/Contrast). Führen Sie das Makro (Plugin | Makro | Führen Sie) und befolgen Sie die Anweisungen.
   2. Wenn aufgefordert, den Vorgang (Taschenrechner Bildfenster) angeben, wählen Sie Bild 1 als Stack 1 (GLP) "," Bild 2 als Stack 2 (Cuticula) "und" subtrahieren.
      Hinweis: Das Makro erzeugt eine maximale Projektionsbild des verarbeiteten Signals GFP (MAX_Result des stack1), eine durchschnittliche Projektion der Nagelhaut (AVG_stack2), das Ergebnis der Subtraktion des Stapels Kutikula von GFP-Stack (aus stack1) und die unverarbeitete Nagelhaut-Stack (stack2).
   3. Gefragt, um Kontrast einzustellen, verwenden Sie die Steuerelemente im Fenster Helligkeitsregelung/Anpassung der Helligkeit/Kontrast des Bildes maximale Projektion der GLP und der durchschnittliche Projektion der Nagelhaut, ein RGB zusammengeführte Bild der beiden Signale zeigen die GFP in erzeugen Grün und die Nagelhaut in grau. Verschmelzen Sie Ergebnis von stack1 und stack2, um ebenso eine kombinierte GFP und Nagelhaut Stapel generieren, die in der nächsten Phase verwendet werden können.
5. Um die Beine in drei Dimensionen zu visualisieren, zu verwenden spezielle 3D-Software mit den neu generierten Stacks (Abb. 4E).
   1. Öffnen Sie die RGB-Stack mit 3D-Software (siehe Tabelle der Materialien). Wählen Sie in der Pop-up-Fenster alle Kanäle im Bereich Konvertierung Modus und geben Sie die Größe des ein Voxel (Volumen eines Pixels).
      Hinweis: Alle notwendigen Informationen enthält die Image-Dateien aus irgendeinem proprietären Mikroskop-Software verwendet wird.
   2. Auf Kanal 2 Modul (GFP-Signal), mit der rechten Maustaste und wählen Sie Display | Volren. Dann mit der linken Maustaste auf das Volren-Modul. Klicken Sie im Abschnitt "Eigenschaften" (unten links auf dem Bildschirm) auf bearbeiten, und wählen Sie volrengreen.col. Auf Kanal 1 Modul (Kutikula Signal) mit der rechten Maustaste und wählen Sie Display | Volren. Dann mit der linken Maustaste auf das Volren-Modul. In den Abschnitt "Eigenschaften" mit der linken Maustaste auf erweitert und wählen Sie Ddr (eine transparente Röntgenbild-ähnliche Darstellung) dann passen Sie den Gamma-Wert um die Nagelhaut Hintergrund (Abb. 4E) anzuzeigen.
   3. Um eine 3D-Drehung zu erzeugen, mit der rechten Maustaste auf das Projekt Stackmodul. Wählen Sie dann animieren | drehen. Mit der linken Maustaste auf das Drehen-Modul.
   4. In den Eigenschaften Abschnitt, klicken Sie auf verwenden Bbox-Center. Auf dem Drehen Modul mit der rechten Maustaste und wählen Sie berechnen | Filmemacher. Klicken Sie auf dem Filmemacher Modul die linke Maustaste gedrückt. Im Abschnitt " Eigenschaften " klicken Sie links auf erweitert (oben rechts auf den Abschnitt "Eigenschaften").
   5. Füllen Sie in das Feld Dateiname den Namen der Film Rotation. Schreiben Sie im Feld Qualität 1 (maximale Qualität). 200 Rahmen belassen, ggf. eine 8,3 s-Drehung (diese Zahl kann verringert oder erhöht, um die Geschwindigkeit der Rotation zu ändern). Drücken Sie dann die Anwendung (grüne Taste, links unten den Abschnitt "Eigenschaften" (siehe Video 1)).

Ergebnisse

Wie in Abbildung 4gezeigt, ermöglicht dieses Verfahren hervorragende Darstellung der GFP-Label Axone in Erwachsenen Drosophila -Beine, zusammen mit ihre terminal Dorne. Vor allem erhält man ein klares Signal der GFP ohne jegliche Kontamination aus der Fluoreszenz emittierten Bein Nagelhaut. Das Signal von der Nagelhaut kann dann mit der GFP-Signal zu identifizieren, die Positionierung der Axone in den Beinen (Video 1,Abbildung ...

Diskussion

Die Cuticula von Erwachsenen Drosophila und anderen Arthropoden, die vielen dunklen Pigmente enthält, ist ein großes Hindernis für die Anzeige von Strukturen im Inneren ihres Körpers. Darüber hinaus ist es stark Auto fluoreszierend, durch Fixierung verschlimmert. Diese beiden Funktionen sind sehr problematisch für Beobachtungen von Fluoreszenzfarbstoffen oder Molekülen im Körper von Tieren mit ein Exoskelett.

Das Verfahren, die wir beschrieben haben und dass wir routinemäßig im Labor...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ethanol absolute	Fisher	E/6550DF/17	Absolute analytical reagent grade
nonionic surfactant detergent	Sigma-Aldrich	T8787	Triton X-100, for molecular biology
Fine forceps	Sigma-Aldrich	F6521	Jewelers forceps, Dumont No. 5
Glass multi-well plate	Electron Microscopy Sciences	71563-01	9 cavity Pyrex, 100 mm x 85 mm
PFA	Thermofisher	28908	Pierc 16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free
Glycerol	Fisher BioReagents	BP 229-1	Glycerol (Molecular Biology)
Spacers	Sun Jin Lab Co	IS006	iSpacer, four wells, around 12 μL working volume per well, 7 mm diameter, 0.18 mm deep
Square 22 mm x 22 mm coverslips	Fisher Scientific	FIS#12-541-B	No.1.5-0.16 to 0.19 mm thick
Mounting Medium	Vector Laboratories	H-1000	Vectashield Antifade Mounting Medium
Confocal microscope	Carl Zeiss		LSM780; objective used LD LCI Plan-Apochromat 25X/0.8 Imm Korr DIC M27 (oil/ silicon/glycerol/water immersion) (420852-9871-000)
imaging software	Carl Zeiss		ZEN 2011
3D-Image software	ThermoFisher Scientific		Amira 6.4
ImageJ	National Institutes of Health	https://imagej.nih.gov/ij/	ImageJ/FIJI