Visualizzare Drosophila gamba del neurone di motore assoni attraverso la cuticola adulto

Riepilogo

Qui descriviamo un protocollo per visualizzare il targeting assonale con una proteina fluorescente in gambe adulte della drosofila di fissazione, di montaggio, di imaging e passaggi di post-formazione immagine.

Abstract

La maggior parte del lavoro sulla specifica neuronale è stata effettuata nei modelli geneticamente e fisiologicamente trattabili come C. elegans, larve di Drosophila e pesce, che tutti impegnarsi in movimenti ondulatorio (come la ricerca per indicizzazione o nuotare) come loro principale mezzo di locomozione. Tuttavia, una più sofisticata comprensione della specifica individuale del neurone di motore (MN) — almeno in termini di informazione terapie malattia — richiede un sistema altrettanto docile che modella meglio gli schemi complessi basati su appendice locomozione dei vertebrati. Apparato locomotore Drosophila adulto incaricato a piedi soddisfa tutti questi criteri con facilità, dato che questo modello è possibile studiare la specifica di un piccolo numero di gamba facilmente distinto MNs (circa 50 MNs per gamba) sia utilizzando una vasta matrice di potenti strumenti di genetiche e nel contesto di un regime basato su appendice locomozione fisiologico. Qui descriviamo un protocollo per visualizzare l'innervazione muscolare gamba in una mosca adulta.

Introduzione

Come l'arto dei vertebrati, la gamba di adulto di Drosophila è organizzata in segmenti. Ogni gamba Vola contiene 14 muscoli, ognuno dei quali comprende più fibre muscolari^1,2. I corpi cellulari dei MNs gamba adulto si trovano nel T1 (protoraciche), T2 (mesotoraciche) e T3 (metatoraciche) gangli su ogni lato del midollo ventrale del nervo (VNC), una strutturale analoga al midollo spinale dei vertebrati (Figura 1). Ci sono circa 50 MNs in ogni gangli, quale destinazione muscoli in quattro segmenti della gamba ipsilateral (coxa, trocantere, femore e tibia) (Figura 1)³. Soprattutto, ogni gamba adulto singolo MN ha una propria identità morfologica che è altamente stereotipata tra animali^3,4. Tutti questi unici MNs sono derivati da cellule staminali 11, chiamate neuroblasti (NBs) producendo gamba MNs durante gli stadi larvali^3,4. Alla fine di tutti gli stadi larvali l'immaturo MNs postmitotic differenziare durante la metamorfosi di acquisire loro specifici supporti conici dendritiche e axonal terminali obiettivi che definiscono la loro morfologia unica^3,4. In precedenza abbiamo verificato l'ipotesi che un codice combinatorio di fattori di trascrizione (TFs) specifica la morfologia unica di ciascuna gamba adulto di Drosophila MN⁵. Come modello, abbiamo usato il lignaggio B, uno dei lignaggi NB 11 che produce sette sulla MNs e ha dimostrato che un codice combinatorio di TFs espressa in gamba adulto postmitotic MNs impone loro morfologie individuali. Di riprogrammazione del codice TF di MNs siamo stati in grado di passare morfologie di MN in modo prevedibile. Chiamiamo questi TFs: sistemi multilaterali di negoziazione (morfologiche TFs)⁵.

Una delle parti più impegnative delle analisi morfologiche di adulto MNs è visualizzare gli assoni attraverso una cuticola spessa e auto-fluorescente ad alta risoluzione. Etichettiamo solitamente gli assoni con un membrana-tagged GFP che si esprime in MNs con un sistema di espressione binaria, ad esempio DVglut-Gal4/UAS-mCD8::GFP o DVglut-QF / QUAS mCD8::GFP, dove DVglut è un pilota forte espresso in motoneuroni⁶. Combinando questi strumenti con altre tecniche clonale come analisi di mosaico con un marcatore reprensibile (MARCM)⁷, cis-MARCM⁸o MARCMbow⁵, possiamo limitare l'espressione di GFP alle sottopopolazioni di MNs rendendo l'analisi fenotipica degli assoni più facili. Abbiamo generato un protocollo al fine di mantenere la gamba morfologia assonale MN intatto per imaging e successiva ricostruzione 3D di questioni specifiche intrinseche alla gamba della drosofila adulta come (1) fissazione delle strutture interne della gamba adulta senza alterare la morfologia dell'assone, espressione endogena di fluorescente e piedino la muscolatura, (2) montaggio del piedino per preservare la struttura complessiva sotto un vetrino coprioggetto e nell'orientamento appropriato per imaging e (3) elaborazione delle immagini per ottenere la cuticola Priorità bassa come pure axonal segnale fluorescente. Mentre questo protocollo è stato dettagliato per la rilevazione dell'espressione fluorescente in assoni MN, può essere applicato per visualizzare altri componenti di gamba neuromusculature in artropodi.

Protocollo

1. la dissezione e la fissazione della gamba

1. Prendere una piastra di vetro multi-pozzetto e riempimento appropriato numero di pozzetti con etanolo al 70%. Aggiungere 15-20 CO₂-anestetizzati mosche (di sesso e di qualsiasi età) a ciascun bene e utilizzando un pennello, tamponare delicatamente le mosche nella soluzione di etanolo fino a quando le mosche sono completamente sommerse.
   Nota: Questo passaggio è quello di rimuovere l'idrofobicità della cuticola. Non lavare per più di 1 min, perché questo aumenta l'auto-fluorescenza della cuticola.
2. Sciacquare le mosche 3 volte con soluzione detergente tensioattivo non ionico di 0.3% in 1x tamponato fosfato salino (PBS). Tenere lontane le mosche in questa soluzione per almeno 10 min.
   Nota: Le gambe sono fissate meglio quando compreso detersivo, che rischia di aumentare la penetrazione del fissativo all'interno della gamba.
3. Posizionare un piatto multi-pozzetto sul ghiaccio con un tubo di paraformaldeide al 4% (PFA).
   Nota: La preparazione di freschi 4% PFA da una soluzione di riserva libera del etanolo per PFA con 16% è critica.
4. Utilizzare pinze per rimuovere la testa e addome delle mosche senza danneggiare il segmento toracico o le gambe.
   Nota: Rimuovendo l'addome rende più facile per tenere al volo e sezionare le gambe.
5. Sezionare le gambe dal segmento toracico con una pinza e posizionare le gambe nei pozzetti contenenti 4% PFA. Per questo, premete delicatamente ma saldamente allo svincolo coxa-torace con la punta di una pinzetta finché la gamba non si stacca.
6. Fissare le gambe 4% PFA durante la notte a 4 ° C (circa 20 h totale).
7. Lavare le gambe con soluzione detergente tensioattivo non ionico di 0.3% in PBS 1X, 5x per 20 minuti ciascuno.
8. Sostituire il tampone di lavaggio con mezzo di montaggio. Mantenere la gamba in mezzo di montaggio per almeno un giorno prima del montaggio per consentire la sua completa penetrazione nella gamba.
   Nota: Se il mezzo di montaggio è altamente viscoso, diluire la soluzione di montaggio all'80% con PBS 1X perché l'improvviso cambiamento nella viscosità può causare la cuticola per comprimere e danneggiare la struttura complessiva della gamba. A seconda del driver Gal4 , mosche possono essere conservati per 1-3 settimane a 4 ° C in media di montaggio fino al montaggio.

2. gamba montaggio

1. Posto circa 20 µ l di 70% glicerolo sul lato sinistro di un vetrino da microscopio e coprire con un vetrino coprioggetto² di quadro 22 x 22 mm (Figura 2A, B). Pipettare 10 µ l di mezzo di montaggio lungo una linea parallela a e a una piccola distanza dal bordo destro di questo vetrino coprioggetti. Aggiungere un altro 30 µ l di mezzo di montaggio ulteriormente sul lato destro della diapositiva (Figura 2).
   Nota: Quando si applica un vetrino coprioggetto sopra le gambe (Vedi sotto) il mezzo di montaggio delicatamente diffonderà sotto il vetrino coprioggetto e intorno le gambe senza li spostando.
2. Utilizzando una pinzetta sollevare la gamba dalla soluzione e delicatamente metterlo sul supporto di montaggio vicino il coprioggetto sinistro. Fare lo stesso per ogni gamba e allinearle dall'alto verso il basso (Figura 2D).
   1. Sollevare e trasferire le gambe in una goccia di supporto in possesso tra entrambe le punte della pinza. Orientare le gambe in due modi: lato esterno verso l'alto o verso il basso.
3. Una volta che tutte le gambe (fino a 6 – 8 gambe possono essere montate) sono allineate correttamente, mettere un secondo vetrino coprioggetto sopra le gambe in modo che questo vetrino coprioggetti poggia leggermente il coprivetrino precedentemente posizionata (Figura 2E) per consentire lo spazio tra il tessuto e il vetrino coprioggetto e prevenire le gambe da ottenere danneggiati (Figura 2).
   Nota: In alternativa, utilizzare adesivo pozzi o cera ortodontica per creare spazio tra il vetrino coprioggetto e lo scivolo.
4. Usare uno smalto per unghie per fissare la posizione delle lamelle in ogni angolo (Figura 2F).
   Nota: Il tessuto è ora pronto per l'immagine.

3. imaging

1. Impostare una singola traccia utilizzando il laser 488 nm e due rivelatori simultaneamente per ottenere la fluorescenza di GFP e la cuticola auto-fluorescenza. Utilizzando il controllo di gamma o il display del dispositivo di scorrimento nella finestra spettrale della finestra luce percorso del software, impostare l'intervallo di rilevamento di un rilevatore (1) tra 498 – 535 nm e quella di altra (rilevatore 2) tra 566-652 nm.
   Nota: In genere, il rivelatore 1 dovrebbe essere un rivelatore GaAsP e il rilevatore 2 un fotomoltiplicatore. Il canale di 498-535 rileva in modo ottimale il segnale GFP ma rileva anche la fluorescenza di auto dalla cuticola. Tuttavia, il canale di 566 – 652 rileva solo la fluorescenza di auto dalla cuticola (Figura 3A).
2. Utilizzare una X 20 o 25 X olio obiettivo a immersione, risoluzione 1024 x 1024 pixel, 12-bit di profondità e impostare la spaziatura Z come 1 µm. Set pixel dwell tempo come circa 1,58 µs e media 2 fotogrammi/immagine. Utilizzare obiettivi con apertura numerica elevata.
3. Impostare tutte le altre impostazioni, a seconda del microscopio confocale e il software di imaging utilizzata.
   1. Assicurati di ottenere un segnale di cuticola più luminoso del rivelatore di 566 – 652 anziché dal rilevatore 498 – 535. Per effettuare questa operazione, utilizzare la stessa potenza del laser del 488-laser per entrambi i rilevatori. Utilizzando gli indicatori di saturazione, prima regolare il guadagno del rivelatore 1 per ottenere un segnale GFP abbastanza luminoso (Figura 3B, D). Quindi regolare il guadagno del rivelatore 2 per garantire che alcune zone con segnale alta cuticola (bordi delle gambe, articolazioni) producono un segnale saturato in questo rivelatore (Figura 3, E).
   2. Se la gamba è estesa e troppo grande per essere imaged in un singolo fotogramma, utilizzare l'opzione posizione o piastrelle dal software di imaging microscopio.
4. Ricostruire le immagini finali sia utilizzando il microscopio proprietario software di imaging o usando ImageJ/FIJI freeware (Vedi sotto).

4. post elaborazione di Imaging

1. Aprire lo stack confocale in ImageJ/FIJI.
   1. Utilizzare il plugin Bioformats (plugin | Bio-Formats | Bio-formats importatore) in FIJI per aprire le immagini che non sono presenti. Formato TIF da proprietary software pacchetti⁹di imaging.
2. Dividere i canali selezionando immagine | Colore | Canali di divisione.
   Nota: Se immagini da diverse posizioni sono state fatte e devono essere ricombinati, utilizzare il pairwise impunture plugin in FIJI da (plugin > impunture > Pairwise impunture)^10,11.
3. Per sottrarre il segnale di cuticola dalla GFP, aprire la calcolatrice di immagine (processo | Calcolatore di immagine): selezionare lo stack da rivelatore 1 come immagine 1 (GFP + cuticola) (Figura 4A), sulla finestra operazione selezionare sottrarree selezionare lo stack da rilevatore 2 come immagine 2 (cuticola) (Figura 4B). Di conseguenza, solo il segnale endogeno di GFP (GFP) è ottenuto (Figura 4).
   1. Unire indietro questo stack (GFP) con lo stack 'sola cuticola' ottenuto dal rilevatore 2 (Figura 4B immagine | Colore | Canali di Unione) per ottenere un'immagine RGB che comprende il segnale GFP tessuto-specifici, nonché il segnale di cuticola, che aiuta a identificare le pergole dell'assone all'interno dei segmenti di gamba (Figura 4).
   2. Regolare il contrasto e la luminosità di ogni immagine (immagine di| Regolare | Brightness/Contrast) e quindi generare una singola immagine RGB (immagine | Tipo | Colore RGB).
      Nota: Per generare una proiezione massima dello Z-stack (immagine | Stack | Progetto Z...), utilizzare la proiezione massima intensità per il segnale GFP e intensità media per la cuticola, che può essere registrata per luminosità prima di unire i due canali.
4. In alternativa, è possibile utilizzare una macro per sottrazione automatica ed elaborazione delle immagini in ImageJ/FIJI. Copiare il testo nel File supplementare 1 nell'editor di macro (plugin | Nuovo | Macro), salvare la macro nella cartella Plugins e riavviare ImageJ/FIJI una volta per poter utilizzare la macro.
   1. Per utilizzare la macro, aprire lo stack confocale e aprire la finestra di luminosità/contrasto (immagine | Regolare | Brightness/Contrast). Quindi eseguire la macro (Plugin | Macro | Eseguire) e seguire le istruzioni.
   2. Quando viene chiesto di specificare l'operazione (finestra di calcolatrice di immagine), scegliere immagine 1 come stack 1 (GFP), immagine 2 come stack 2 (cuticola) e Sottrai.
      Nota: La macro genera un'immagine di massima proiezione del segnale elaborato di GFP (MAX_Result di stack1), una proiezione media della cuticola (AVG_stack2), il risultato della sottrazione dello stack cuticola dallo stack GFP (risultato di stack1) e il non trasformati stack di cuticola (stack2).
   3. Quando viene chiesto di regolare contrasto, utilizzare i controlli nella finestra di controllo di luminosità per regolare la luminosità/contrasto dell'immagine massima proiezione di GFP e della proiezione media della cuticola, per generare un'immagine unita di RGB di entrambi i segnali mostrando la GFP in verde e la cuticola in grigio. Risultato di stack1 e stack2, si fondono per generare similmente una pila GFP e cuticola combinata che può essere utilizzata nella fase successiva.
5. Per visualizzare le gambe in tre dimensioni, è possibile utilizzare software 3D specializzati con le pile appena generate (Figura 4E).
   1. Aprire lo stack RGB con software 3D (Vedi Tabella materiali). Nella finestra di dialogo a comparsa, selezionare tutti i canali nella sezione modalità di conversione e immettere la dimensione di un voxel (volume di un pixel).
      Nota: Tutte le informazioni necessarie sono contenute nei file di immagine da qualunque software proprietarie microscopio utilizzato.
   2. Il modulo di canale 2 (segnale di GFP), pulsante destro del mouse e selezionare Display | volren. Quindi, fare clic sul modulo volren. Nella sezione Proprietà (basso a sinistra dello schermo) fare clic su sinistra su modifica e selezionare volrengreen.col. Il modulo canale 1 (segnale di cuticola) fare clic destro e selezionare Display | volren. Quindi, fare clic sul modulo volren. Nella sezione Proprietà tasto sinistro del mouse su Avanzate e selezionare ddr (un display trasparente di radiografia-come), quindi regolare il valore di gamma per visualizzare lo sfondo di cuticola (Figura 4E).
   3. Per generare una rotazione 3D, fare clic destro sul modulo progetto dello stack. Quindi selezionare animare | ruotare. Sinistro del mouse sul modulo di rotazione.
   4. Nella finestra Proprietà sezione fare clic su utilizzare bbox center. Sul modulo di rotazione pulsante destro del mouse e selezionare calcolare | cineasta. Sul modulo cineasta fare clic sul pulsante sinistro del mouse. Nella sezione Proprietà fare clic sinistro su Avanzate (in alto a destra della sezione Proprietà).
   5. Nel campo nome file immettere il nome di rotazione del film. Nel campo della qualità scrivere 1 (qualità massima). Lasciare il telaio a 200 se non si desidera una rotazione s 8.3 (questo numero può essere diminuito o aumentato per modificare la velocità di rotazione). Quindi premere applica (pulsante verde, in basso a sinistra della sezione di proprietà (Vedi Video 1)).

Risultati

Come mostrato nella Figura 4, questa procedura permette un'eccellente immagine degli assoni GFP-etichettata in adulte gambe di Drosophila , insieme al loro terminale pergole. Soprattutto un segnale pulito di GFP è ottenuto senza alcuna contaminazione della fluorescenza emessa dalla cuticola di gamba. Il segnale dalla cuticola può quindi essere combinato con il segnale GFP per identificare il posizionamento degli assoni delle gambe (Video 1,

Discussione

La cuticola della drosofila adulta e di altri artropodi, che contiene molti pigmenti scuri, è dei principali ostacoli per la visualizzazione di strutture all'interno del loro corpo. In aggiunta, è fortemente auto fluorescente che è aggravata dalla fissazione. Queste due caratteristiche sono molto problematiche per le osservazioni di coloranti fluorescenti o molecole all'interno del corpo di animali con un esoscheletro.

La procedura che abbiamo descritto e che utilizziamo ordinariamente in l...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ethanol absolute	Fisher	E/6550DF/17	Absolute analytical reagent grade
nonionic surfactant detergent	Sigma-Aldrich	T8787	Triton X-100, for molecular biology
Fine forceps	Sigma-Aldrich	F6521	Jewelers forceps, Dumont No. 5
Glass multi-well plate	Electron Microscopy Sciences	71563-01	9 cavity Pyrex, 100 mm x 85 mm
PFA	Thermofisher	28908	Pierc 16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free
Glycerol	Fisher BioReagents	BP 229-1	Glycerol (Molecular Biology)
Spacers	Sun Jin Lab Co	IS006	iSpacer, four wells, around 12 μL working volume per well, 7 mm diameter, 0.18 mm deep
Square 22 mm x 22 mm coverslips	Fisher Scientific	FIS#12-541-B	No.1.5-0.16 to 0.19 mm thick
Mounting Medium	Vector Laboratories	H-1000	Vectashield Antifade Mounting Medium
Confocal microscope	Carl Zeiss		LSM780; objective used LD LCI Plan-Apochromat 25X/0.8 Imm Korr DIC M27 (oil/ silicon/glycerol/water immersion) (420852-9871-000)
imaging software	Carl Zeiss		ZEN 2011
3D-Image software	ThermoFisher Scientific		Amira 6.4
ImageJ	National Institutes of Health	https://imagej.nih.gov/ij/	ImageJ/FIJI