لوحة الفلورة تعدد الإرسال الآلي للدراسات المناعية-علم الأورام في عينات الأنسجة الكبدية الفورمالين--ثابت

Summary

بروتوكول مفصل للوحة علامة ستة الفلورة متعدد هو الأمثل وتنفيذها، باستخدام الملطخ الآلي لنتائج أكثر اتساقا وأقصر وقت إجراء. هذا النهج يمكن تكييفها مباشرة بأي مختبر للدراسات المناعية-الأورام.

Abstract

استمرار التطورات في علم الأورام المناعية تتطلب زيادة فهم آليات المناعة السرطان. تحليل عينات الأنسجة من الخزعات (FFPE) الفورمالين--الثابتة، جزءا لا يتجزأ من البارافين إيمونوبروفيلينج أصبح أداة أساسية لفهم تعقيدات علم المناعة الورم واكتشاف رواية المؤشرات الحيوية التنبؤية للسرطان العلاج المناعي. إيمونوبروفيلينج تحليل الأنسجة يتطلب تقييم علامات مجتمعة، بما في ذلك الفئات السكانية الفرعية الخلية الملتهبة ونقاط التفتيش، ومحصنة في ورم المكروية. ظهور أساليب الرواية المناعي متعدد يسمح لتحليل مولتيباراميتريك أكثر كفاءة لأقسام الأنسجة واحدة مما لا immunohistochemistry مونوبليكس القياسية (المدينة). واحد الفلورة متعدد المتاحة تجارياً (إذا) الأسلوب هو استناداً إلى تضخيم إشارة تيراميدي، وجنبا إلى جنب مع تحليل مجهرية متعددة الأطياف، يسمح لفصل إشارة أفضل لعلامات مختلفة في الأنسجة. هذه المنهجية متوافق مع استخدام unconjugated الأجسام الأولية التي قد تم تحسينها للمدينة الموحدة على عينات الأنسجة FFPE. هنا يصف لنا بالتفصيل بروتوكولا مؤتمتة تسمح متعدد إذا وضع العلامات لعينات الأنسجة الكبدية مع لوحة جسم متعدد علامة الستة تضم PD-L1، PD-1، CD68، CD8، وكي-67، وسيتوكيراتينس AE1/AE3 مع 4، 6-دياميدينو-2-فينيليندولي كونتيرستين خلية نووية. هو الأمثل في بروتوكول الفريق متعدد في الآلي الملطخ المدينة وقت المصبوغة هو أقصر من البروتوكول اليدوي ويمكن مباشرة تطبيقها وتكييفها من قبل المحقق أي مختبر للدراسات المناعية-علم الأورام في عينات الأنسجة FFPE البشرية. ووصف أيضا هي عدة عناصر وأدوات، بما في ذلك أسلوب إسقاط--عنصر تحكم لمراقبة الجودة الجميلة للوحة إذا كان متعدد جديدة، التي تعتبر مفيدة للتحسين والتحقق من صحة هذا الأسلوب.

Introduction

إيمونوبروفيلينج تحليل عينات الأنسجة FFPE الورم قد أصبح عنصرا أساسيا في الدراسات المناعية-الأورام، خاصة بالنسبة لاكتشاف والتحقق من صحة رواية المؤشرات الحيوية التنبؤية للسرطان العلاج المناعي في سياق التجارب السريرية^{1 ،2}. يبقى المدينة اللونية، تشروموجينس الكيميائية مثل ديامينوبينزيديني، باستخدام تقنية قياسية في تشخيص الأمراض إيمونولابيلينج من الأنسجة خزعة³. المدينة الموحدة يمكن أن تستخدم أيضا لسرطان الأنسجة إيمونوبروفيلينج، بما في ذلك كوانتيتيشن من الفئات السكانية الفرعية من الخلايا المرتبطة بالأورام الليمفاوية، وتقييم مستويات التعبير من نقاط التفتيش المناعي مثل يجند موت الخلية المبرمج 1 (PD-L1)^{4 ،5}. المدينة الموحدة محدودة، ومع ذلك، في أن يمكن أن يكون المسمى مستضد واحد فقط كل قسم الأنسجة. لأنه عادة ما تتطلب دراسات إيمونوبروفيلينج تحليل التعبير مجتمعة من عدة علامات، سيتطلب استخدام المدينة الموحدة تلطيخ لمقاطع متعددة من الأنسجة، وكل ملطخة بعلامة واحدة، و، ولذلك، سيكون محدودة إلى حد كبير لتحليل عينات الأنسجة الصغيرة مثل الأساسية إبرة الخزعات. طرق المدينة القياسية أيضا محدودة لتقييم العلامات التي يتم كويكسبريسيد عن الخلية متنوعة من السكان، كما شائع مع علامات الحاجز المناعي مثل PD-L1، التي يعبر عنها بالضامة المرتبطة بالورم والخلايا السرطانية. أبلغ هذا القيد في، على سبيل المثال، استخدام معيار مونوبليكس المدينة من أخصائيي علم الأمراض للتحليل الكمي لعلامة المدينة أعرب عنها الخلية مختلف أنواع⁶. تطوير تقنيات المدينة اللونية متعدد توظيف تشروموجينس الملونة المتنوعة على نفسه يمثل قسم الأنسجة النهوض على الأسلوب القياسي مونوبليكس المدينة،⁷ على الرغم من أنها تظل محدودة إيمونولابيلينج لعدد قليل علامات، ويقدم أيضا التحديات تقنية هامة للتقييم السليم لعلامات المعرب عنها في المقصورات سوبسيلولار نفس السكان الخلية نفسها.

المحاذير المذكورة أعلاه فيما يتعلق بتوافر الأنسجة من العينات السريرية، فضلا عن القيود المفروضة على تقنيات المدينة اللونية المتعددة، قد أدت إلى الحاجة إلى تطوير تحسين طرائق متعدد للدراسات المناعية-الأورام استناداً إلى وضع العلامات الفلورية جنبا إلى جنب مع التصوير النظم التي يمكن فعلياً فصل إشارات فلوروفوريس متعددة من نفس الشريحة. واحد مثل هذا الأسلوب يستند إلى تضخيم إشارة تيراميدي (TSA) جنبا إلى جنب مع تصوير مجهرية متعددة الأطياف للون كفاءة الفصل⁸. توظف مجموعة متاحة تجارياً على أساس حساب السياحة الفرعي فلوروفوريس الأمثل ل التصوير المتعدد الأطياف⁸ (انظر الجدول للمواد). ميزة هامة من هذا النظام هو توافقه مع نفس الأجسام المضادة الأولية غير مسمى التي تم التحقق من صحتها والأمثل لمعيار اللونية المدينة^9،،من¹⁰¹¹. وهذا ما يسمح أسرع الأمثل ليس فقط ولكن أيضا المرونة في التعديلات الأمثل ولوحة تتضمن أهدافا جديدة. وعلاوة على ذلك، يمكن أن يكون الأمثل طريقة حساب السياحة الفرعي الفلورة متعدد (mIF) المتاحة تجارياً الآلي المدينة الملطخ بالأنظمة، مما يسمح لنقل مباشر من مونوبليكس المدينة اللونية للقوة المتعددة الجنسيات.

نقدم هنا بروتوكولا لفريق القوة المؤقتة المتعددة الجنسيات للدراسات المناعية-الأورام يستند الآلي صبغة mIF حساب السياحة الفرعي ويستخدم ماسح المتعدد الأطياف للتصوير. هذا البروتوكول يمكن تكييفها وتعديلها بواسطة أي مستخدم المختبر مع الوصول إلى وصف الأجهزة والمواد الكاشفة. يشمل البروتوكول فريق من ستة أجسام الأولية إيمونوبروفيلينج من الأورام السرطانية: PD-L1، PD-1، CD68 (كعلامة بلعم عموم)، CD8 (خلايا T-السامة للخلايا)، كي-67، و AE1/AE3 (pan-سيتوكيراتين، تستخدم كعلامة الظهارية للتعرف على سرطان خلايا). دراسة حديثة توضح الاستفادة المثلى من بروتوكول mIF إدارة أمن النقل اليدوي باستخدام المدينة اللونية كمرجع قياسي للتحقق من صحة متعدد تلطيخ¹². قد وضعت طريقة تحديث المعروضة هنا باستخدام مجموعة حساب السياحة الفرعي المتاحة تجارياً، وسبعة ألوان محسنة في الملطخ الآلي، تقصير الوقت المصبوغة من 3 – 5 أيام إلى ح 14، بينما أيضا تحسين اتساق تلطيخ جذريا. بالإضافة إلى البروتوكول الرئيسية المفصلة المقدمة هنا، يتضمن قسم المواد التكميلية الأسلوب "إسقاط السيطرة"، عملية مراقبة نوعية إضافية لتقييم لوحة mIF جديدة، فضلا عن الملاحظات الفنية للتحسين، استكشاف الأخطاء وإصلاحها، والتنمية من جديد الألواح المتعددة لمساعدة المستخدم على مختبر لإعداد وتحسين طريقة حساب السياحة الفرعي mIF mIF مخصصة لوحات.

Protocol

ملاحظة: البروتوكول المقدمة هنا توضح كيفية إجراء إيمونوبروفيلينج فريق القوة المؤقتة المتعددة الجنسيات باستخدام حساب السياحة الفرعي لأجسام ستة (CD68، ki67، PD-L1، PD-1 و CD8 و AE1/AE3) في الآلي الملطخ (انظر الجدول للمواد). البروتوكول يصف أيضا كيفية إجراء إسقاط عناصر التحكم لمراقبة الجودة من لوحة mIF جديدة (انظر المواد التكميلية). في هذا البروتوكول، يتم تلوين مع ثماني شرائح فب أونستينيد من البشرية لوزة (مراقبة إيجابية) والشرائح أونستينيد ثمانية من غدية الرئة البشرية. وتستخدم الشريحة الأولى لكامل متعدد تلطيخ مع كافة علامات ستة، والشريحة الثانية لمراقبة ايستب التي تستخدم لا أجسام الأولية والشرائح الستة المتبقية لإسقاط عناصر التحكم (انظر المواد التكميلية). عنصر تحكم إضافية للأنسجة أوتوفلوريسسينسي ينصح بشدة، وينبغي أن تدرج دائماً في متعدد الدراسة (انظر المواد التكميلية). ومع ذلك، يمكن توظيف المحققين سائر أنواع الورم والضوابط وفقا لأهدافها الخاصة بالمشروع. مختبر المستخدمين دون خبرة سابقة مع أسلوب حساب السياحة الفرعي mIF وتقنيات الماسح المتعدد الأطياف يجب قراءة "دليل تنمية المدينة متعدد" (المتاحة على شبكة الإنترنت في http://info.perkinelmer.com/2016-lp-Opalassaydevelopmentguide-lp). على الرغم من أن يصف هذا الدليل بروتوكول يدوي، كما يوفر مقدمة طيبة لتلطيخ أسلوب القوة المتعددة الجنسيات. جميع أقسام الأنسجة المستخدمة في هذا البروتوكول قد تصبح مجهولة المصدر والموافقة وفقا "إعلان هلسنكي".

1. عينات الأنسجة

1. حدد عينة لوزة البشر FFPE المحتوية على تضخم اللمفاوية لاستخدامها كعنصر إيجابي وعينه غدية الرئة بشرية فب من المعروف أن PD-L1 إيجابية. استعراض الشرائح (H & E) الهيماتوكسيلين وويوزين من كتل سرطان الرئة المحدد لتأكيد وجود ورم. من المهم تجنب الأورام مع المناطق وفيرة من نخر كهذا قد يزيد تلوين الخلفية غير محددة.
   ملاحظة: لهذا التحسين، وتجنب استخدام كتل البارافين التي تم تخزينها لمدة 10 سنوات أو أكثر والأنسجة مع مظهر مجففة في كتلة البارافين (استشارة أخصائي علم الأنسجة).
2. استخدام مبضع، قطع 10 مقاطع تسلسلية متتالية من كل كتلة، 4 ميكرومتر سميكة. جبل المقاطع على شريحة زجاجية إيجابيا يحمل المستخدمة للمدينة، مقطع واحد كل شريحة.
   ملاحظة: يجب تحميل المقاطع تماما شقة دون التجاعيد، كما قد تنشئ التجاعيد التحف المصبوغة. عدد شرائح مقاطع المسلسل من 1 إلى 10.
3. إعداد شريحة ح & ه جديدة في القسم الأول. استعراض الشريحة ح & ه بمساعدة أخصائي للتأكد من وجود ورم الأنسجة أو الرئة لوزة المتبقية في الكتلة.
   ملاحظة: يمكن أن تساعد هذه الشريحة H & E، في وقت لاحق، مع تحديد المناطق ذات الأهمية لتحليل الأطياف وفينوتيبينج.
4. تخزين المقاطع أونستينيد في مربع شريحة بلاستيكية عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى ثلاثة أشهر.

2. إنشاء mIF جديدة البرنامج Staining في "الملطخ" الآلي: التسجيل المواد الكاشفة

ملاحظة: يجب إضافة الكواشف إلى قائمة الكاشف في البرنامج الملطخ الآلي قبل أن تكون متوفرة للاستخدام في البروتوكولات. انظر الجدول للمواد للحصول على معلومات عن الصيغة النموذجية والبرمجيات الملطخ الآلي.

1. انقر فوق علامة التبويب الكواشف داخل البرنامج الآلي الملطخ. انقر فوق إضافة تعيين كاشف جديد. أدخل الاسم (مثلاً، "520 حساب السياحة الفرعي الكاشف") والاسم المختصر (على سبيل المثال، "520 حساب السياحة الفرعي")، مشيراً إلى أن هناك ثمانية أحرف كحد أقصى. حدد فرعية من قائمة منسدلة وتعيين المورد. لا تقم بتغيير وصمة عار مفردة/مزدوجة من DS واحد/تسلسلي. تعيين الافتراضي تلطيخ بروتوكول و البروتوكول. تعيين بروتوكول هير الافتراضي إلى ER1 20.
2. حفظ الكاشف الجديد وكرر الخطوة 2، 1 لجميع المواد الكيميائية المدرجة في الجدول 1.

3-الملطخ الآلي: تسجيل للحاويات

1. كتابة اسم الكاشف لاستخدامها على جانب كل حاوية. مسح الباركود على الجانب. في النافذة المنبثقة، حدد الكاشف الصحيح من القائمة. حدد تاريخ انتهاء صلاحية وحفظها.
2. كرر الإجراء في الخطوة 3، 1 لجميع المواد الكيميائية المدرجة في الجدول 1.
3. تسجيل عدة أبحاث مفتوحة. مسح كل الرموز الشريطية على جانب الطقم واتبع المطالبة التي تظهر على الشاشة. اسم المجموعة "أدوات البحث متعدد 1." سجل أمينوميثاني x tris (هيدروكسيميثيل) 1 (تريس)-مخزنة المالحة كجزء من هذه المجموعة (الجدول 1).

4-الملطخ التلقائية: إنشاء القوة المؤقتة المتعددة الجنسيات "برنامج بروتوكول"

1. هو بروتوكول متعدد قاعدة مسبقة مع اسم أوبال 7 متعدد في ستاينيرس الآلي الجديد (انظر الصيغة النموذجية والبرمجيات في الجدول للمواد). حدد البروتوكول بتصفية "جميع" بدلاً من "المفضلة" على الشاشة البروتوكول. إذا كان البروتوكول الأساسي غير موجود، ثم تحديث البرنامج الملطخ الآلي مع المساعدة من الشركة المصنعة.
2. وينبغي إجراء جميع التعديلات على نسخة من الأصلي للبروتوكول. قبل إجراء التغييرات، حفظ الأصلي وإنشاء نسخة عن طريق النقر فوق علامة التبويب برتوكولات ، ثم النقر بالزر الأيمن على البروتوكول 7 أوبال متعدد وتحديد النسخة.
3. قم بتغيير الاسم إلى بروتوكول متعدد 7 1 في نافذة جديدة، وحدد علامة التبويب المقترنة مع الجهاز الصحيح (نموذج الكلمة أو benchtop). تتطابق مع البروتوكول في تكميلية الجدول S1. انقر فوق إضافة كاشف إضافة خطوة تثبيط البيروكسيديز 10 دقيقة (وليس جزءا من بروتوكول قياسي) وحدد المانع البيروكسيديز الكاشف.
4. وتؤكد أن الخطوات حظر استخدام المخزن مؤقت حظر الحزب الشيوعي الإندونيسي. التأكد من أن كل جسم الأولية تشير إلى الكاشف المناسب، أن الخطوات جسم الثانوية الاستفادة بوليمر HRP، ويستخدم ذلك الطيفية 4, 6-دياميدينو-2-فينيليندولي (DAPI) مزودة بأدوات التشغيل الآلي متعددة الأطياف. تأكيد جميع الخيارات عن طريق فحص الكاشف التي عينت لكل خطوة منها في القائمة المنسدلة على الشاشة البروتوكول.

5-الملطخ الآلي: إضافة إفلات عناصر التحكم، وبروتوكول التحكم ايستب

1. نسخ اسم بروتوكول متعدد 7 1 وتغييره إلى بروتوكول متعدد 7 إسقاط 1 CD68. تغيير الكاشف جسم CD68 إلى مفتش الماوس وحفظ البروتوكول.
2. إنشاء ستة بروتوكولات جديدة أكثر، واحدة لكل عنصر تحكم الإفلات وواحد لعنصر التحكم ايستب كاملة (تغيير جميع الأجسام المضادة إلى إيسوتيبيس المناسب) بنفس الطريقة.

6-الآلي الملطخ: الشريحة إعداد بروتوكول

1. نسخ البروتوكول بريستينينج * خبز ودو ، وإعادة تسمية هذا البروتوكول "خبز متعددة الأطياف" وح 2 دو.
2. تعديل البروتوكول لمطابقة الكواشف هو مبين في الجدول 2. خبز شرائح ح 2 عند 60 درجة مئوية. دو لمدة 30 ثانية عند 72 درجة مئوية.

7-صباغة الآلي: إعداد الكواشف

1. تحضير الأدوات كشف البحث واحدة. يجب أن تكون كاشف واحد المقترنة بشكل دائم مع هذه المجموعة، حيث ملء حاوية مفتوحة 30 مل عليها ل 1 x تريس مخزنة المالحة (تبس) مع 1 x TBS وتحديد موقع هذا في الموضع 1 (الأبعد عن المقبض) في عدة بحوث الكشف المعينة "مجموعة أدوات البحث متعدد" 1. هذا الكاشف ستكون مرتبطة بشكل دائم مع هذه المجموعة البحثية ويجب عدم تغيير الموقف لاستخدامها في المستقبل.
2. قم بتسمية اثنين 30 مل فتح الحاويات كتلة متعددة الأطياف و متعددة الأطياف الثانوية. ملء حاوية كتلة متعددة الأطياف مع 30 مل من المخزن المؤقت/جسم حظر مادة من الطقم المصبوغة متعددة الأطياف. ملء حاوية متعددة الأطياف الثانوية مع 30 مل بوليمر جسم الثانوي موس مكافحة-rabbit المضادة من الطقم المصبوغة متعددة الأطياف.
3. إعداد عشرة مل 7 حاويات مفتوحة. وحدة التخزين المطلوبة في ميكروليتيرس هو 600 + (150 × [عدد الشرائح]). سيتم تطبيق كل جسم للشرائح 12 في هذه الحالة (لوزة ستة وستة الرئة). تتم الإشارة إلى وضع العلامات ووحدات التخزين لكافة الحاويات في الجدول 3.
4. لكل جسم الأنبوبة، إضافة للمرة الأولى الجسم مادة، متبوعاً بجسم الأساسي يتركز في وحدات التخزين المشار إليها في الجدول 3. مزيج من بيبيتينج لطيف.
5. إعداد حاوية مفتوحة 7 مل DAPI، استخدام أربعة قطرات تركيز DAPI في المليلتر من الماء المقطر المزدوجة؛ ما مجموعة 16 سوف تكون ملطخة DAPI (600 + [150 × 16] = 3,000 ميليلتر). أضف 3 مل من الماء المقطر مزدوجة بالإضافة إلى 12 قطرات من DAPI الطيفية في الحاوية. إعداد DAPI جديدة لكل تشغيل.
6. إعداد 7 مل حاوية مفتوحة للمانع البيروكسيديز. سيتم التعامل مع كافة الشرائح 16 مع مثبط البيروكسيديز (600 + [150 × 16] = 3,000 ميليلتر). أضف 3 مل كتلة البيروكسيديز في الحاوية.
7. قبل إعداد العامل تركيزات فلورس، ريسوسبيند جميع فلورس المجففة بالتبريد بإضافة 75 ميليلتر من ثنائي ميثيل سلفوكسيد إلى كل أنبوبة فلور توفيرها من قبل الشركة المصنعة. مزيج من بيبيتينج. هذا هو رصيد حساب السياحة الفرعي فلور. مخزن في 4 درجات مئوية.
8. إعداد ست حاويات المعايرة، واحدة لكل فلور. وحدة التخزين المطلوبة في ميكروليتيرس هو 350 + (150 × [عدد الشرائح]). سيتم تطبيق كل فلور لشرائح 16 في هذه الحالة (لوزة ثمانية وثمانية من الرئة). تتم الإشارة إلى وضع العلامات ووحدات التخزين لكافة الحاويات في الجدول 4.
9. عندما تم تسجيل جميع الكواشف وإعداد، ضع كل حاوية في أي مكان على رف وتحميل جميع الكواشف على الملطخ الآلي. وسيؤكد التحقيق وحدة التخزين لكل كاشف.

8-الملطخ الآلي: عينة الإعداد وتلطيخ متعددة الأطياف

1. في البرنامج الآلي الملطخ، انقر فوق "إعداد الشرائح" في الجزء العلوي من الشاشة. انقر فوق إضافة الدراسة. ملء الإطار المنبثق مع دراسة معرف واسم الدراسة، والتعليقات.
   1. حدد اسم الباحث إجراء تشغيل المصبوغة من القائمة المنسدلة. اترك حجم dispense في 150 ميليلتر. حدد متعددة الأطياف دو إعداد البروتوكول. انقر فوق موافق ثم إضافة الشريحة. ضمن التعليقات، اكتب "متعدد 1 الرئة 123ABC". أكمل الحقول التالية كما هو مبين: نوع الأنسجة = اختبار النسيج؛ حجم Dispense = 150 ميليلتر؛ وضع Staining = واحد الروتينية؛ علامة = السلبية؛ تلوين = اكتب "7 متعدد البروتوكول 1"؛ إعداد = خبز متعددة الأطياف، دو ح 2؛ هير = هير 20 دقيقة مع ER1.
2. انقر فوق إضافة الشرائح وتغيير التعليقات وبروتوكول لإضافة إسقاط عنصر التحكم الشرائح والشرائح التحكم ايستب. عندما تم إضافة كافة الشرائح للدراسة، قم بإغلاق إطار إضافة الشرائح وطباعة بطاقات العنونة. تطبيق التسميات على مجال التسمية المناسبة على كل شريحة.
3. تحميل الشرائح إلى الرفوف وتطبيق البلاط الغطاء في الاتجاه الصحيح، وإدراج الرفوف في صباغة الآلي وانخفاض في علب. وسوف تفحص الجهاز التسميات الشريحة.
4. عندما تم مسحها ضوئياً وتقاس جميع الشرائح والمواد الكاشفة. زر التشغيل (►) سوف تصبح نشطة. إذا أوتوستاينير الكشف عن أي أخطاء، مثل حجم الكاشف غير كافية، سوف يظهر رمز تحذير أصفر بعلبة المتأثرة. في حالة حدوث خطأ، حق انقر على رمز تنبيه وتصحيح الخطأ.
5. بدء التلوين فورا أو جدولة بدء المتأخر. البروتوكول حوالي 14 ح في المدة. ملاحظة: ضمان سيتم إكمال البروتوكول في وقت عندما الشرائح يمكن إزالتها فورا كما إيزيس الغسيل يمكن أن تؤثر على نتائج المصبوغة.

9-كوفيرسليبينج الشرائح المتعددة الأطياف

1. إزالة الشرائح من الملطخ الآلي وتخزينها في رف غارقة في 1 × tbs.
2. تحميل العينات مع كوفيرسليبس رقم 1، 5 و 15 ميليلتر لتركيب وسائل الإعلام (انظر الجدول للمواد). قم بإزالة أي فقاعات عن طريق الضغط بلطف على ساترة مع تلميح ماصة.
3. السماح للشرائح لعلاج بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة على مقاعد البدلاء المختبر. يمكن تفحص الشرائح أونكوريد فورا بمعالجة متأنية.

10-الأطياف الماسح الضوئي

1. السلطة على الماسح المتعدد الأطياف وعلى الكمبيوتر (انظر الجدول للمواد للمعلومات النموذجية والبرمجيات). بدء تشغيل البرنامج تحكم المجهر. فتح الباب الأمامي للماسح المتعدد الأطياف بالضغط على زر حساسة للمس على الجزء الأمامي الجهاز. وتحمل كل حاملة نابض في الماسح الضوئي أربع شرائح. تحميل كافة الشرائح إلى الناقلين وسجل النظام قبل تحميل الناقلين في الجهاز.
2. حدد بروتوكول تحرير ثم انقر فوق جديد...؛ ثم، قم بإنشاء اسم بروتوكول متعدد الفريق 1 وإفلات عناصر التحكم. إنشاء اسم دراسة تطوير الفريق متعدد، انقر فوق إنشاء بروتوكول، واكتب نظرة عامة حول مسح عامل التصفية DAPI؛ ثم، حدد مسح الشريحة كاملة و "القرار بكسل" 0.50 ميكرومتر (20 س). ينبغي أن تمثل جميع المرشحات والعصابات. إذا لم يكن الأمر كذلك، انقر فوق تحرير عوامل التصفية والعصابات، وحدد كل المرشحات الخمس (DAPI، فيتك، CY3، تكساس الأحمر و CY5)، وثم انقر فوق تحرير التعرض.
3. تحميل الناقل عن طريق تحديد الناقل متعدد كامل من الرئة غدية. حدد الشريحة الصحيح باستخدام واجهة المستخدم الرسومية. التركيز الأنسجة أما يدوياً أو باستخدام ضبط تلقائي للصورة. انتقل إلى أي منطقة تلطيخ DAPI مقبولة وانقر فوق كشف تلقائي لضبط التعرض في ميلي ثانية (0 – 2,000 ms).
4. كرر الإجراء نفسه لكل خمس مجموعات التصفية في الأعمدة مسح كامل والمنطقة إس. من المؤكد أن انتقل إلى منطقة ذات صبغة مقبولة وإعادة تركيز المجهر قبل تعيين التعرض لكل مستوى التصفية والتكبير. كشف تلقائي لجميع المرشحات الخمس في 20 x المسح الشامل و 20 x (MSI) التصوير المتعدد الأطياف مناطق متعددة الأطياف. تحديد دقة بكسل من 0.50 ميكرومتر (20 س). حفظ البروتوكول وانقر مرة أخرى للعودة إلى الشاشة الرئيسية للبرنامج فكترا؛ ثم، انقر فوق مسح الشرائح.
5. فتح واجهة لكل شريحة، وتعيين المهام مسح. وضع دراسة تطوير الفريق متعددوتعيين بروتوكول متعدد الفريق 1و "إسقاط عناصر التحكم" وتعيين معرف الشريحة إلى متعدد الرئة ABC123، إسقاط ABC123 الرئة CD68 متعدد، إلخ . عندما يتم تعيين المهام، وقد وصفت كافة الشرائح انقر فوق مسح. الماسح المتعدد الأطياف الآلي سيقوم بإجراء مسح الشريحة كاملة لكافة الشرائح باستخدام جميع المرشحات الخمس.

11-الأطياف الماسح الضوئي: التصوير المتعدد الأطياف

1. مجرد اكتمال التفحص، افتح البرنامج قبتيف ("فينوتشارت") ثم انقر فوق تحميل الشرائح في أعلى يسار. سيؤدي هذا إلى فتح قبتيف، وتفحص كل الشرائح الخمس-تصفية. كل طبقة تحتوي على معلومات من فلور واحد أو أكثر، ذلك الأداة المساعدة محدودة، ولكن هيكل الأنسجة وأنماط التعبير عريضة واضحة ويمكن استخدامها لتحديد مناطق لاس.
2. انتقل إلى وفتح الشريحة الصحيح في هذه الدراسة باستخدام شجرة القائمة المنسدلة على اليسار. تسجيل الدخول (أعلى اليمين) مع الأحرف الأولى من اسم المستخدم.
3. تحديد خمس مناطق لاس باستخدام أداة الختم في الجزء العلوي من الشاشة. استشارة أخصائي إذا كان أحدها متوفراً. ضمن حدد، حدد اقتناء؛ تحت حجم في الحقول، حدد 1 x 1؛ وتحت قيود الحقل، حدد 0.5 ميكرومتر (20 س). استناداً إلى سيتوكيراتين (كورونا) تلوين (أساسا في Cy5)، حدد عدة مناطق مع الورم (كورونا تشيكية +) وسدى (كورونا-) تصويرها من الفحص الشامل. كرر هذا الإجراء لكل شريحة.
4. عندما يتم تحديد جميع MSIs، إغلاق البرنامج فينوتشارت والعودة إلى البرنامج فكترا . قم بتغيير المهمة من المسح الضوئي إس لكل شريحة، وثم انقر فوق التفحص مرة أخرى لأداء مجموعة MSI.

12-الطيفية اتقانا

ملاحظة: الخطوة اتقانا الطيفية المطلوبة لفصل القناة وتحليل الصور من الشرائح. قبل أن يتم تنفيذ اتقانا الطيفية في إبلاغ البرنامج، يجب أن يبني مكتبة الطيفية باستخدام الشرائح غدية الرئة ملطخة بكل فلور وحدها، ومع DAPI وحدها. كما يتم وصف هذا الإجراء في المدينة متعدد المذكورة أعلاه "دليل التنمية المقايسة".

1. عند الانتهاء من اقتناء MSI، استخدام البرنامج ("إبلاغ") اتقانا الطيفية لفتح الملفات في مجلد MSI . في نهاية هذه الملفات في ملحق نوع الملف.im3.
2. ضمن تنسيق صورة، حدد مولتيسبيكترال؛ ضمن نموذج تنسيق، حدد الأسفار؛ وحدد إطار مصدر مكتبة طيفية، إبلاغ.
3. لتحديد فلورس، حدد وتحميل كافة فلورس و DAPI ستة من مكتبة بني غدية الرئة مكتبة الشرائح. انقر فوق إعداد جميع (أسفل اليسار). سوف تؤدي البرامج اتقانا الطيفية اتقانا الطيفية على كل الصور المفتوحة، باستخدام التشكيلات الجانبية الطيفي المقدمة.
4. مع أخصائي، تقييم نمط المصبوغة ضد البقع اللونية واحدة لنفس الهدف في شرائح متتالية من نفس الأنسجة.

13-تقييم شدة الأسفار والتوهين إشارة

ملاحظة: أداة التهم، الذي يظهر كسهم مع مربع صغير براون، هو أهم أداة للتحسين متعدد، وينبغي أن تستخدم في كثير من الأحيان (انظر المواد التكميلية). باستخدام أداة التهم في البرنامج اتقانا الطيفية، تقييم نسبة الإشارة إلى الضوضاء، التي ينبغي أن تتجاوز 10:1 (انظر المواد التكميلية لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها وتقييم متعدد تلطيخ مع إفلات عناصر التحكم) كحد أدنى.

1. 13.1-بصورة مفتوحة في البرنامج اتقانا الطيفية، إشراك الأداة التهم ومسح الصور لتقييم شدة الأسفار لكل قناة. كثافة المستهدفة في أنسجة الرئة بين 10 و 20 من التهم تم تسويتها. أداة تطبيع التهم يرد في الشكل 1.
2. استبعاد شرائح مع التهم إشارة الحد الأقصى من تهم المنطقة إشارة أقل من 10 أو العادي بأقل من خمسة بالنسبة لأي علامة بحيث أوتوفلوريسسينسي وتلطيخ خارج الهدف لا تتنافس مع إشارة أصيلة.
3. وتعول استبعاد شرائح مع الحد الأقصى أكبر من 30 لأي قناة لتجنب نزيف الطيفية أو عدم الكفاءة الطيفية اتقانا.
4. معالجة التهم طبيعية عالية أو منخفضة عن طريق ضبط تركيز إدارة أمن النقل.

14-تحليل الصور الأطياف

1. فتح MSI واحدة أو أكثر في مجال البرمجيات اتقانا الطيفية وفلورس فقط حدد أونميكسينج التي تمثل في صورة مفتوحة واحدة على الأقل. انقر فوق إعداد جميع أونميكس جميع الصور الملونة المفتوحة حاليا لإنتاج صور غير مخلوط طيفيا.
2. حدد أداة التهم لدراسة التهم الموجهة إليه عبر كل صورة التي تحوم فوق مسؤولياتك الاهتمام.
3. حدد أيقونة العين لفتح محرر طريقة العرض. تحديد وضبط كثافة عرض كل قناة مستقلة.
4. حدد تكوين لفتح تجزئة الأنسجة، تجزئة الخلية، فينوتيبينج، ونماذج التسجيل. هذه الأدوات اللازمة للتحقق من صحة موضوعي متعدد تلطيخ ضد البقع اللونية واحدة ويمكن استخدامها لتوليد البيانات الكمية فينوبتيك (S1 الشكل).
5. استخدم علامة التبويب تصدير لحفظ التدرج الرمادي، نيون، TIFF غير مضغوط على غرار باثفيو، وملفات البيانات من وحدات التحليل فينوبتيك للمزيد من التحليل، والأرشفة، والعروض التقديمية (S1 الشكل).

النتائج

البروتوكول هو موضح هنا سوف توفر نتائج مثل تلك المبينة في الشكل 2. البدء بتقييم لتلطيخ في عنصر التحكم لوزة، بدءاً بظهارة الخلايا الحرشفية السطحية. يمكن مراجعة علم الأنسجة للعينة لوزة مع أخصائي، استخدام الشريحة ح & ه كمرجع. إذا كانت أبواب المدينة اللونية تتم...

Discussion

ثورة العلاج المناعي السرطان الجارية هو فتح الرواية وواعدة الخيارات العلاجية ل مرضى السرطان¹³. التقدم المحرز في مجال علم الأورام المناعية سيتطلب زيادة المعرفة بالتهاب وورم المكروية، ليس فقط لفهم بيولوجيا الآليات المناعية التي تشارك في التسرطن ولكن أيضا للبحث عن المؤشرات الح?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
"InForm 2.4.2" Software for Spectral Unmixing and Image Analysis	PerkinElmer	CLS151066	Called "spectral unmixing software" in text
"Phenochart 1.0.9" QPTIFF Software for Selection of MSI and Overall Slide Scan Viewing	PerkinElmer	CLS151067	Called "QPTIFF software" in text
#1.5 Coverslips	Sigma Aldrich	2975246
200 Proof Ethanol	Koptec	V1001
20x Tris-Buffered Saline	VWR	J640-4L
Antibody Diluent	DAKO	S2203
Anti-CD68 Mouse Monoclonal	DAKO	M087601-2	Clone PG-M1
Anti-CD8 Rabbit Monoclonal	Ventana	M5392	Clone SP239
Anti-CK Mouse Monoclonal	DAKO	M351501-2	Clone AE1/AE3
Anti-ki67 Mouse Monoclonal	DAKO	M724001-2	Clone MIB-1
Anti-PD-1 Rabbit Monoclonal	Cell Signaling	#86163	Clone D4W2J
Anti-PD-L1 Rabbit Monoclonal	Ventana	790-4905	Clone SP263
Bond Dewax Solution	Leica	AR9222	Called "dewax solution" in text
Bond Epitope Retrieval Solution 1	Leica	AR9961	Called "ER1" in text
Bond Epitope Retrieval Solution 2	Leica	AR9640	Called "ER2" in text
Bond Open Containers, 30 mL	Leica	OP309700	Called "30 mL open containers" in text
Bond Open Containers, 7 mL	Leica	OP79193	Called "7 mL open containers" in text
Bond Polymer Refine Detection	Leica	DS9800	Called "chromogenic detection kit" in text
Bond Research Detection Kit	Leica	DS9455	Called "research detection kit" in text
Bond Titration Kit	Leica	OPT9049	Called "titration kit" in text
Bond Universal Covertile Novocastra	Leica	S21.2001	Called "covertiles" in text
Bond Wash Solution 10X Concentrate	Leica	AR9590	Called "10x wash solution" in text
BondRX Autostainer	Leica		Called "automated stainer" in text
BondRX Software Version 5.2.1.204	Leica		Called "automated stainer software" in text
Opal 7-Color Automation IHC Kit	PerkinElmer	NEL801001KT	Called "multispectral staining kit" in text
Peroxidase Block	Leica	RE7101
ProLong Diamond Antifade Mountant	Thermo	P36965	Called "slide mountant" in text
Starfrost Slides	Fisher	15-183-51
Vectra Polaris Multispectral Microscope with "Vectra 3.0.5" Software for Multispectral Microscope Control	PerkinElmer	CLS143455	Called "microscope control software" in text