IMMUNO-Onkoloji araştırmalar Formalin sabit Karsinomu doku örnekleri Multiplex ayirt Panel otomatik

Özet

Detaylı bir iletişim kuralı için bir altı-marker multiplex ayirt panel en iyi duruma getirilmiş ve gerçekleştirilen, daha tutarlı sonuçlar ve daha kısa işlem süresi için bir otomatik stainer kullanarak. Bu yaklaşım doğrudan IMMUNO-Onkoloji araştırmalar amaçlı herhangi bir laboratuvar tarafından adapte edilebilir.

Özet

IMMUNO-Onkoloji devam eden gelişmeler kanser İmmünoloji mekanizmaları artan bir anlayış gerektirir. Doku örnekleri formalin sabit, parafin gömülü (FFPE) biyopsi immunoprofiling analizini roman akıllı biyolojik kanserli hastalarda için keşfetmek ve tümör İmmünoloji karmaşıklığını anlamak için önemli bir araç haline gelmiştir. Immunoprofiling analiz dokuların inflamatuar hücre altgrupları ve bağışıklık denetim noktaları, tümör microenvironment dahil olmak üzere birleştirilmiş işaretleyicilerin görünümünü değerlendirme gerektirir. Standart monoplex immünhistokimya (IHC) daha roman multiplex immunohistokimyasal yöntemleri gelişiyle tek doku bölümler daha verimli multiparametric analiz için izin verir. Yöntemi tyramide-sinyal güçlendirme üzerinde temel ve spektral mikroskobik analizi ile birlikte (), bir piyasada bulunan çok katmanlı ayirt doku çeşitli işaretlerinin daha iyi bir sinyal ayrılması için sağlar. Bu metodoloji FFPE doku örnekleri üzerinde standart IHC için optimize edilmiş çekimsiz birincil antikor kullanımı ile uyumludur. Burada biz ayrıntılı olarak multiplex sağlayan otomatik bir protokol Karsinomu doku örnekleri PD-L1, oluşan bir altı-marker multiplex antikor panel ile etiketleme tarif PD-1, CD68, CD8, Ki-67 ve AE1/AE3 cytokeratins ile 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole Nükleer hücre counterstain. Çok katmanlı masası iletişim kuralı bir otomatik IHC stainer bundan el ile iletişim kuralı daha kısadır ve doğrudan uygulanan ve herhangi bir laboratuvar araştırmacı IMMUNO-Onkoloji araştırmalar insan FFPE doku örneklerini tarafından uyarlanmış bir boyama süre için optimize edilmiştir. Ayrıca açıklanan çeşitli denetimler ve en iyi duruma getirme ve doğrulama tekniği için yararlı olan yeni bir multiplex Eğer panel iyi kalite kontrolü için bir damla-denetim yöntemi de dahil olmak üzere araçları vardır.

Giriş

Immunoprofiling analiz FFPE tümör doku örnekleri IMMUNO-Onkoloji çalışmaları, keşif ve Roman akıllı biyolojik kanserli hastalarda klinik^{1 bağlamında için doğrulama için özellikle önemli bir bileşeni haline gelmiştir ,2}. Diaminobenzidine gibi kimyasal chromogens kullanarak chromogenic IHC standart tekniği biyopsi doku³immunolabeling için tanılama patoloji kalır. Standart IHC Nefelometri tümör ilişkili lenfosit altgrupları ve değerlendirme (PD-L1)^{4 programlı hücre ölümü ligand 1 gibi bağışıklık denetim noktaları ifade düzeylerinin de dahil olmak üzere kanser dokusu immunoprofiling için de kullanılabilir. ,5}. Standart IHC ancak, içinde tek bir antijen doku bölüm başına etiketli sınırlıdır. İmmunoprofiling çalışmalar genellikle birkaç işaretleri kombine ifade analizini gerektirdiği için standart IHC kullanımı birden fazla doku bölümlerini boyama gerektirir, her tek bir marker ile lekeli ve bu nedenle, olur önemli ölçüde küçük doku örnekleri gibi çekirdek iğne biyopsileri analizi için sınırlı. Standart IHC yöntemleri de farklı hücre popülasyonlarının, PD-L1, tümör ilişkili makrofajlar ve kanser hücreleri tarafından ifade edildiği gibi bağışıklık denetim noktası işaretçileri olan ortak olduğu gibi tarafından coexpressed işaretleri değerlendirilmesi için sınırlıdır. Bu sınırlama standart monoplex IHC kullanımı, örneğin, farklı hücre türleri⁶tarafından ifade edilen bir IHC işaretleyici Nicel analiz patologlar tarafından bildirilmiştir. Her ne kadar onlar kalır aynı doku bölümü temsil üzerinde çeşitli renkli chromogens standart IHC monoplex yöntemi,⁷ üzerinde bir gelişme istihdam multiplex chromogenic IHC yöntemlerin geliştirilmesi sayesinde, sadece bir kaç immunolabeling tarafından sınırlı işaretleri ve ayrıca aynı hücre popülasyonlarının aynı hücre altı bölmeleri içinde ifade işaretleri doğru değerlendirme için önemli bir teknik sorun mevcut.

Doku kullanılabilirlik klinik örnekleri yanı sıra multiplex chromogenic IHC teknikleri, sınırlamaları ile ilgili olarak yukarıda belirtilen uyarılar artış dayalı IMMUNO-Onkoloji çalışmaları için gelişmiş çok katmanlı yöntemler geliştirmek gerek verilen hiç Floresan etiketleme etkin bir şekilde birden fazla fluorophores sinyalleri aynı slayttan ayırabilirsiniz sistemleri Imaging ile birlikte. Böyle bir tekniği spektral mikroskobu görüntüleme için verimli renk ayrımı⁸ile birlikte tyramide sinyal güçlendirme (TSA) temel alır. Piyasada bulunan bir TSA tabanlı kiti spektral görüntüleme⁸ için en iyi duruma getirilmiş fluorophores istihdam ( Tablo malzemelerigörmek). Bu sistem bir kritik zaten doğrulanmış ve standart chromogenic IHC^9,10,11için en iyi duruma getirilmiş aynı etiketlenmemiş birincil antikorlar ile uyumluluk avantajdır. Bu yeni hedefler birleştiren en iyi duruma getirme ve panel değişiklikleri sadece daha hızlı optimizasyonu aynı zamanda esneklik sağlar. Ayrıca, multiplex ayirt (mIF) TSA yöntemi bırakmak monoplex basit bir transfer için piyasada bulunan otomatik IHC stainer sistemler için optimize edilebilir chromogenic IHC Finans Yüksek Lisans için.

Burada temel IMMUNO-Onkoloji çalışmalar için bir MIF panel MIF TSA boyama otomatik ve görüntüleme için spektral bir tarayıcı kullanan bir iletişim kuralı mevcut. Bu iletişim kuralı uyarlanmış ve açıklanan araçları ve Kimyasalları erişimi olan herhangi bir laboratuvar Kullanıcı tarafından değiştirilebilir. Protokol karsinomlar immunoprofiling için altı birincil antikorların bir panel içerir: PD-L1, PD-1, CD68 (olarak bir pan-makrofaj marker), CD8 (sitotoksik T hücreleri), Ki-67 ve AE1/AE3 (pan-cytokeratin epitel bir işaretleyici tanımlanması için kullanılan, Karsinomu Hücre). Yeni yapılan bir çalışmada¹²boyama multiplex doğrulamak için standart bir başvuru olarak chromogenic IHC kullanarak el ile bir TSA MIF protokol optimizasyon açıklar. Güncellenme Zamanı yöntemi burada sunulan büyük ölçüde kısaltılması da boyama tutarlılığını geliştirirken boyama zaman 3-5 gün 14 h, otomatik bir yapıcısı içinde en iyi duruma getirilmiş bir piyasada, yedi renkli TSA kiti kullanılarak geliştirilmiştir. Burada sunulan ayrıntılı ana protokolüne ek olarak bir Ek malzeme kısım "damla-control" yöntemi, yeni bir MIF panel yanı sıra optimizasyonu için teknik notlar değerlendirmek için bir ek kalite kontrol süreci içerir, sorun giderme ve laboratuvar Kullanıcı ayarlamak ve MIF TSA Yöntem özelleştirilmiş MIF panelleri için en iyi duruma getirmek için yardımcı olmak için yeni çok katmanlı paneller geliştirilmesi.

Protokol

Not: Burada sunulan protokolü için altı antikorlar TSA kullanarak immunoprofiling bir MIF panelinin gerçekleştirmek açıklar (CD68, ki67, PD-L1, PD-1, CD8 ve AE1/AE3) bir otomatik stainer üzerinde ( Tablo malzemelerigörmek). Protokol ayrıca yeni bir MIF panel bir kalite kontrolü için açılan denetimleri gerçekleştirmek açıklar ( Tamamlayıcı Malzemelerigörmek). Bu protokol için boyama sekiz günahı FFPE slaytlardan insan bademcik (pozitif kontrol) ve insan akciğer adenokarsinom üzerinden sekiz günahı slaytlar ile gerçekleştirilir. İlk slayttan tam multiplex tüm altı işaretleri, ikinci slayt içinde hiçbir birincil antikorlar kullanılmaktadır izotip kontrol için ve geri kalan altı slayt ( Tamamlayıcı Malzemelerigörmek) açılan denetimler için boyama için kullanılır. Doku autofluorescence için ek bir denetim önerilir ve her zaman bir multiplex dahil edilmelidir ( Tamamlayıcı Malzemelerigörmek) çalışma. Ancak, araştırmacılar diğer tümör türleri ve proje hedeflerine göre denetimleri kullanabilirsiniz. MIF TSA yöntemi ve spektral tarayıcı teknikleri ile önceki deneyimi olmayan kullanıcılar Laboratuvar Multiplex IHC geliştirme Rehberi okumalısınız (elde edilebilir online olarak http://info.perkinelmer.com/2016-lp-Opalassaydevelopmentguide-lp). Olsa da bu kılavuz, el ile bir protokol açıklar, ayrıca yöntemi boyama MIF için iyi bir tanıtım sağlar. Bu protokol için istihdam tüm doku bölümleri anonim ve Helsinki Deklarasyonu göre onaylanmış.

1. doku örnekleri

1. Olumlu bir denetimi ve PD-L1 olarak bilinen bir FFPE insan akciğer adenokarsinom örnek kullanılmak üzere lenfoid hiperplazi içeren bir FFPE insan bademcik örnek seçin olumlu. Hematoksilen ve eozin (H & E) slaytlar bir tümör varlığını doğrulamak için seçili akciğer kanseri blokların gözden geçirin. Bu belirsiz arka plan boyama artabilir tümör nekroz bol alanlar ile önlemek önemlidir.
   Not: Bu iyileştirme için 10 yıl veya daha fazla saklı parafin blok kullanmaktan kaçının ve doku parafin blok (Histoloji teknisyeni ile konsültasyon) kurutulmuş bir görünüme sahip.
2. Bir microtome kullanarak, her blok 10 ardışık seri bölümleri, 4 µm kalınlığında kesilmiş. Bölümleri IHC, slayt başına bir bölümü için kullanılan bir pozitif yüklü cam kaymak bağlama.
   Not: Kırışıklıkları boyama eserler üretmek gibi bölümler mükemmel düz kırışıklık, monte gerekir. 10 1 seri bölümler slaytlara numara.
3. İlk bölümünde yeni bir H & E slayt hazırlamak. Blok içinde kalan Bademcik dokusu veya akciğer tümörü varlığını doğrulamak için bir patolog yardımı ile H & E slayt gözden geçirin.
   Not: Bu H & E slayt, daha sonra spektral analiz ve fenotipleme ilgi bölgelerinde yelpazesi ile yardımcı olabilir.
4. Günahı bölümler 4 ° C'de bir plastik slayt kutusunda üç aya kadar saklayın.

2. yeni MIF Staining Program otomatik Stainer Tarih yaratılış: reaktifleri kaydı

Not: Önce onlar kullanılmak üzere protokol are reaktifler otomatik stainer yazılımında reaktif listesine eklenmesi gerekir. Bilgi için Malzemeler tablo otomatik stainer modeli ve yazılım sürümü görmek.

1. Otomatik stainer yazılımından reaktifler sekmesine tıklayın. Yeni bir reaktif belirtmek için Ekle ' yi tıklatın. Adı (örneğin, "520 TSA reaktif") ve kısaltılmış adı (örneğin, "520 TSA"), en fazla sekiz karakter kayda girin. Yardımcı aþaðý açýlan menüsünden seçin ve üreticiye ayarla. Tek/Çift Kişilik leke Tek/ardıl DSdeğiştirmeyin. Protokolü Protokolf boyama varsayılan ayarla. Varsayılan HIER Protokolü ER1 20' ye ayarla.
2. Yeni reaktif ve Tablo 1' de listelenen adımı yineleyin 2.1 tüm reaktifler için kaydedin.

3. otomatik Stainer: Kayıt kapları

1. Her kapsayıcı tarafında kullanılacak reaktif adını yazın. Yan barkod tarama. Açılan pencerede doğru reaktif seçin. Bir süre sonu seçin ve kaydedin.
2. 3.1. adımda tüm reaktifler Tablo 1' de listelenen yordamı yineleyin.
3. Açık araştırma Kit kayıt. Her iki barkodlar kiti tarafında inceden inceye gözden geçirmek ve takip ekrandaki. Belgili tanımlık teçhizat "Multiplex araştırma seti 1." isim 1 x tris (hydroxymethyl) aminomethane (Tris) kayıt-serum bu setleri (Tablo 1) bir parçası olarak arabelleğe alınmış.

4. otomatik Stainer: Bir MIF Protokolü Program oluşturulması

1. Temel çoklu iletişim kuralı yeni otomatik stainers (bkz. Tablo reçetesimodeli ve yazılım sürümünde) üzerinde Opal 7 Multiplex adda önceden yüklenmiştir. Protokol için "tüm" "tercih yerine" Protokolü ekranda süzerek bulun. Temel protokol yoksa, otomatik stainer yazılım üreticisinden yardım ile güncelleştirin.
2. Tüm değişiklikleri özgün iletişim kuralını kopyalarını üzerinde yapılmalıdır. Değişiklik yapmadan önce özgün kaydedin ve protokoller sekmesini tıklatarak, sonra Opal 7 Çoklu iletişim kuralı sağ tıklatıp Kopyalaseçerek bir kopya oluşturun.
3. Adı değiştirmek için 7 Multiplex protokolü 1 yeni pencerede ve doğru aygıtı (zemin modeli veya benchtop) ile ilişkili sekmesini seçin. Ek tablo S1protokolünde aynı. Bir 10 min peroksidaz inhibisyon adım (Standart protokol parçası olmayan) eklemek ve peroksidaz inhibitörü reaktif seçmek için Reaktif Ekle'yi tıklatın.
4. Engelleme adımları bir PKI engelleme tampon kullanmak onaylayın. Her birincil antikor anlamına uygun reaktif için ikincil antikor adımları bir HRP polimer kullanmak, ve spektral Otomasyon kit ile sağlanan bu spektral ' 4, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) kullanılan emin olun. Tüm seçenekleri damla-aşağı yemek listesi ilgili her adımda Protokolü ekrandaki için belirlenmiş reaktif denetleyerek doğrulayın.

5. otomatik Stainer: Ayrıca açılan denetimleri ve izotip kontrol Protokolü

1. Adı 7 Multiplex protokolü 1 kopyalayın ve 1 CD68 damla 7 Çoklu iletişim kuralıdeğiştirin. Fare IgG CD68 antikor reaktif değiştirmek ve protokol kaydedin.
2. Altı daha yeni iletişim kuralları, her damla denetim için diğeri için (tüm antikorlar için uygun isotypes değiştirme) tam izotip kontrol aynı şekilde oluşturun.

6. otomatik Stainer: Slayt hazırlama Protokolü

1. Prestaining iletişim kuralı kopyalamak * fırında ve Dewax ve spektral fırında ve Dewax 2 hbu iletişim kuralı yeniden adlandırın.
2. Tablo 2' de gösterilen reaktifler eşleştirmek için protokol ayarlayın. 60 ° C'de 2 h slaytlarını fırında 30'dewax 72 ° C'de s

7. otomatik Stainer: Reaktifleri hazırlanması

1. Bir araştırma algılama çantası hazırla. Dolgu 30 mL açık şişe 1 x Tris arabelleğe alınmış serum (TBS) 1 x TBS ile işaretlenmiş ve bu pozisyonda 1 (en uzak kolu) belirlenmiş araştırma algılama kit ile Multiplex araştırma kiti bulmak bir reaktif kalıcı olarak bu kiti ile ilişkilendirilmiş olması gerekir 1. Bu reaktif kalıcı olarak bu araştırma kiti ile ilişkili olacak ve ileride kullanmak için pozisyon değiştirmemelisiniz.
2. İki 30 mL açık kapsayıcı Spektral blok ve Spektral ikinciletiketleyin. Spektral blok konteyner engelleme arabellek/antikor spektral boyama seti için seyreltici 30 mL ile doldurun. Spektral ikincil konteyner spektral boyama seti anti-mouse/anti-rabbit ikincil antikor Polimer 30 mL ile doldurun.
3. On 7 mL açık konteynerler hazırlayın. 600 microliters içinde gerekli birimdir + (150 x [slayt sayısını]). Her antikor (altı bademcik ve altı akciğer) Bu durumda 12 slayt için uygulanır. Etiketleme ve birimleri tüm kapsayıcıları için Tablo 3' te belirtilir.
4. Her antikor tüp için önce antikor ekleyin seyreltici, cilt olarak konsantre birincil antikor ardından Tablo 3' te belirtilen. Nazik pipetting tarafından karıştırın.
5. 7 mL açık şişe DAPI, DAPI konsantresi çift distile su mililitre başına dört damla kullanarak hazırlamak; Toplam 16 DAPI ile lekeli (600 + [150 x 16] = 3000 µL). Çift distile su 3 mL artı 12 damla spektral DAPI konteyner içine ekleyin. Taze DAPI her çalışma için hazırlamak.
6. 7 mL açık şişe peroksidaz inhibitörü için hazırlayın. Tüm 16 slaytları peroksidaz inhibitörü ile tedavi edilebilir (600 + [150 x 16] = 3000 µL). Peroksidaz blok 3 mL kap içine ekleyin.
7. Fluors çalışma konsantrasyonları hazırlamadan önce bütün lyophilized fluors dimetil sülfoksit 75 µL üreticisi tarafından sağlanan her fluor tüp ekleyerek resuspend. Pipetting tarafından mix. Bu TSA fluor hisse senedi var. 4 ° C'de mağaza
8. Altı titrasyon kaplar, her fluor için hazırlayın. 350 microliters içinde gerekli birimdir + (150 x [slayt sayısını]). Her fluor buna göre (sekiz bademcik ve sekiz akciğer) 16 slaytlara uygulanır. Etiketleme ve birimleri tüm kapsayıcıları için Tablo 4' te belirtilir.
9. Tüm reaktifler kayıtlı ve hazırlanan, bir raf üzerinde herhangi bir yere her kapsayıcı yerleştirin ve tüm reaktifler otomatik stainer üzerine yük. Sonda her reaktif hacmi onaylayacaktır.

8. otomatik Stainer: Örnek kurulum ve spektral boyama

1. Otomatik stainer yazılım, ekranın üstündeki slayt yapısı'nı tıklatın. Ekle çalışma'yı tıklatın. Çalışma kimliği, çalışma adı ve Yorumlar ile açılır pencere doldurmak.
   1. Aþaðý açýlan listeden boyama çalışma yürütülmesi araştırmacı adını seçin. Besleme birimi 150 µLbırakın. Seçin spektral Dewax hazırlık Protokolüiçin. Slayt Ekle'yive Tamam ' ı tıklatın. Yorumaltında "1 akciğer 123ABC Multiplex." yazın Gösterildiği gibi aşağıdaki alanları doldurun: Doku tipi Test doku; = Besleme birimi 150 µL; = Staining modu tek =, rutin; Marker negatif; = Boyama = yazın "7 protokolü 1 Multiplex"; Hazırlık spektral fırında, = 2 h; Dewax HIER HIER ER1 ile 20 dk =.
2. Ekle slaydı tıklatın ve Yorumlar ve açılan denetim slaytlar ve izotip kontrol slayt eklemek için iletişim kuralı değiştirin. Tüm slaytları çalışma odasına eklendiğinde, Ekle slayt penceresini kapatın ve etiketleri yazdırmak. Her slaytta uygun etiket alan etiketleri uygulamak.
3. Slaytlar raflar yüklemek kapak fayans doğru yönde uygulamak, rafları otomatik stainer yerleştirin ve tepsileri alt. Belgili tanımlık aygıt-ecek inceden inceye slayt etiket.
4. Ne zaman tüm slaytlar ve Kimyasalları taranan ölçülen ve. (►) çalıştırma düğmesi etkin hale gelir. Autostainer yetersiz reaktif hacmi gibi herhangi bir hata algılarsa, bir sarı uyarı simgesi tarafından etkilenen tepsi görünecektir. Bir hata oluşursa, uyarı simgesini sağ tıklayın ve hatasını düzeltmek.
5. Hemen boyama başlatmak veya gecikmeli start zamanlayın. Süre içinde yaklaşık 14 h protokolüdür. Not: Protokol exess yıkama boyama sonuçları etkileyebilir gibi ne zaman slaytlar hemen kaldırılabilir bir anda tamamlayacak emin olun.

9. Coverslipping spektral slaytların

1. Slaytları otomatik stainer kaldırmak ve onları 1'batık bir raf depolamak TBS. x
2. No 1.5 coverslips ve 15 µL ( Tablo malzemelerigörmek) montaj medya örnekleriyle bağlayın. Herhangi bir baloncuklar yavaşça coverslip pipet ucu ile basarak kaldırın.
3. Gecede laboratuvar tezgah üzerinde oda sıcaklığında tedavi slayt izin. İyileşmemiş slaytlar ile dikkatli işleme hemen taranabilir.

10. spektral inceden inceye gözden geçirmek

1. Güç spektral inceden inceye gözden geçirmek ve onun bilgisayar üzerinde ( Malzemeler tablo modeli ve yazılım bilgi için bakın). Mikroskop kontrol yazılımını başlatın. Cihazın ön yüzünde dokunmatik düğmesine basarak spektral inceden inceye gözden geçirmek kapıyı açacağım. Tarayıcı yaylı her taşıyıcıya dört slaytlar içerir. Tüm slaytları taşıyıcıları yük ve taşıyıcıları cihaza yüklemeden önce sipariş kayıt.
2. Düzenleme protokol seçin ve yeni...'ıtıklatın; ardından, iletişim kuralı adı Multiplex paneli 1 ve damla denetimlerioluşturun. Multiplex paneli geliştirmeçalışma oluşturun, Oluşturma iletişim kuralı' nı ve Genel tarama filtresi DAPIyazın; ardından, Tüm slayt tarama ve Pixel kararlılık 0,50 µm (20 X)seçin. Tüm filtreleri ve Grup temsil edilmeli. Eğer değilse, filtreleri Düzenle ve gruplar'ıtıklatın, tüm beş filtreleri (DAPI, FITC, CY3, Texas kırmızı ve CY5) seçin ve Etkilenmeler Düzenle'yitıklatın.
3. Taşıyıcı taşıyıcı ile akciğer adenokarsinom tam multiplex seçerek yükleyin. Doğru slaydı grafik kullanıcı arabirimini kullanarak seçin. Doku el ile veya otomatik odaklama kullanarak odak. Kabul edilebilir DAPI boyama ile gezinin ve pozlama milisaniye cinsinden ayarlamak için Auto-maruz tıklatın (0-2000 ms).
4. Tüm beş filtre kümesi tüm inceden inceye gözden geçirmek ve MSI bölge sütunlar için aynı işlemi tekrarlayın. Kabul edilebilir boyama ile bir alana gidin ve pozlama her filtre ve büyütme düzeyi için ayarlamadan önce mikroskop yönlendirmesi emin olun. Auto-maruz 20 x genel tarama ve 20 x spektral görüntüleme (MSI) spektral bölgelerin tüm beş filtreleri için. 0.50 µm (20 x) piksel çözünürlüğü seçin. Kullanılacak protokol kaydetmek ve Vectra yazılım ana ekrana dönmek için geri düğmesini tıklatın; sonra Tarama slaytlar' ı tıklatın.
5. Her slayt için arabirimi açık ve görev inceden inceye gözden geçirmekiçin. Çalışma Multiplex paneli geliştirmeiçin Multiplex paneli 1 ve damla denetimleriiçin protokol ayarlanmasý ve Slayt numarası Multiplex akciğer ABC123, Multiplex CD68 damla akciğer ABC123, vb koymak . Tüm slaytları etiketli ve görevleri ayarlamak zaman Tara' yı tıklatın. Otomatik spektral inceden inceye gözden geçirmek tüm beş filtreleri kullanarak tüm slaytların tam slayt tarama gerçekleştirir.

11. spektral tarayıcı: Spektral görüntüleme

1. Tarama tamamlandıktan sonra QPTIFF yazılım ("Phenochart") açmak ve sol üst Yük slayt ' ı tıklatın. Bu-ecek açık bir QPTIFF, beş-filtre bütün-slayt tarama olduğu. Her katmanı bilgileri birden fazla fluor, belgili tanımlık yarar sınırlıdır, ama geniş ifade desenleri ve doku yapısı belirgin olduğu ve bölgeler için MSI seçmek için kullanılan içerir.
2. Gidin ve sol tarafta açılan ağacını kullanarak çalışma odasında doğru slayt açın. (Üst sağ) Kullanıcı adının baş harfleri ile oturum.
3. Beş bölge için MSI ekranın üst kısmında Damga aracını kullanarak seçin. Varsa bir patolog başvurun. İçin seçinaltında satın almaseçin; boyut alanlarıaltında 1 x 1seçin; ve alan kısıtlamaaltında 0.5 µm (20 x)seçin. (Esas Cy5) boyama cytokeratin (CK) bağlı olarak, birden fazla bölge tümör (CK +) ve stroma (CK genel tarama yansıması için-) seçin. Bu yordamı her bir slayt için yineleyin.
4. Tüm MSI'lerini seçildikten sonra kapatmak Phenochart bilgisayar yazılımı ve Vectra yazılımı iade. Görev inceden inceye gözden geçirmek MSI için her bir slayt için değiştirin ve sonra tekrar MSI toplama gerçekleştirmek için tarama ' yı tıklatın.

12. spektral Unmixing

Not: Spektral unmixing adım Kanal ayırma ve görüntü analizi slaytların için gereklidir. Spektral unmixing INFORM yazılımında yapılmadan önce spektral Kütüphane akciğer adenokarsinom slaytlar ile her fluor DAPI ile yalnız ve yalnız lekeli kullanarak yerleşik gerekir. Bu yordamı ayrıca anılan Multiplex IHC tahlil geliştirme Kılavuzu'nda açıklanmıştır.

1. MSI satın alma işleminiz bittiğinde, MSI klasördeki dosyaları açmak için spektral unmixing ("INFORM") yazılımını kullanın. Bu dosyaları .im3 dosya türü uzantısı ile sona.
2. Resim biçimialtında Multispectralseçin; örnek biçimialtında floresansseçin; ve spektral kitaplık kaynağıaltında INFORMseçin.
3. Fluors seçmek için seçin ve tüm altı fluors ve DAPI akciğer adenokarsinom Kütüphane slaytlar ile inşa kütüphane yüklemek. Hazırlamak tüm (sol alt)'i tıklatın. Spektral unmixing yazılım spektral sağlanan spektral profilleri kullanarak, tüm açık görüntülerde unmixing gerçekleştirir.
4. Bir patolog ile aynı doku sıralı slaytları aynı hedef chromogenic tek lekeleri karşı boyama desen değerlendirmek.

13. floresan yoğunluğu ve sinyal zayıflama değerlendirilmesi

Not: Bir ok ile küçük kahverengi bir kutu olarak görünür, sayıları aracı multiplex optimizasyonu için en önemli bir araçtır ve sık sık kullanılması gerektiğini ( Tamamlayıcı Malzemelerigörmek). Spektral unmixing yazılımında sayar aracıyla, en az 10:1 ( Tamamlayıcı Malzemeleri bkz: sorun giderme ve damla denetimleriyle boyama multiplex değerlendirilmesi için) aşmalıdır sinyal-gürültü oranı değerlendirmek.

1. 13.1. ile bir görüntü spektral unmixing yazılımında açık, sayıları aracı meşgul ve fotoğrafları her kanal floresan yoğunluğu değerlendirmek için anket. Akciğer dokusunda hedef yoğunluk arasında 10 ve 20 normalleştirilmiş sayıları var. Normalleştirilmiş sayar aracı Şekil 1' de gösterilen.
2. Autofluorescence ve hedef kapalı boyama otantik sinyal ile rekabet değil böylece maksimum sinyal sayıları daha az 10 veya normal sinyal alan sayıları az beş için herhangi bir marker ile slaytlar hariç.
3. Dışlama slaytlar ile en fazla 30 spektral kanama veya verimsiz spektral unmixing önlemek herhangi bir kanal için daha büyük sayar.
4. Yüksek veya düşük normalleştirilmiş sayar TSA konsantrasyon ayarlayarak adresi.

14. spektral görüntü analizi

1. Bir veya daha fazla MSI spektral unmixing yazılım açın ve yalnızca fluors bu unmixing için en az bir açık görüntü gösterilir. Tüm şu anda açık renkli görüntüler hayalice karışmamış görüntüler vermeye ayıramayacağız için Hazırlamak tüm ' i tıklatın.
2. Sayıları her görüntü faiz area(s) getirerek ankete sayar aracını seçin.
3. Görünüm Düzenleyicisi'ni açmak için göz simgesini seçin. Seçin ve her bağımsız kanal görüntü yoğunluğunu ayarlayın.
4. Doku segmentasyon, hücre segmentasyon, fenotipleme ve skor modülleri açmak için Yapılandır ' ı seçin. Bu araçları karşı chromogenic tek lekeleri boyama multiplex objektif doğrulama için gereklidir ve nicel phenoptic verileri (Şekil S1) oluşturmak için kullanılabilir.
5. Gri tonlama, floresan kaydetmek için Dışa Aktar sekmesini, pathview tarzı sıkıştırılmamış TIFF ve phenoptic analiz modüllerden veri dosyaları daha fazla analiz, arşivleme ve sunumlar (Şekil S1) için kullanın.

Sonuçlar

Burada açıklanan protokol bu Şekil 2' de gösterildiği gibi sonuçlar sağlar. Yüzey skuamöz hücreli epitel ile başlayan bademcik denetimdeki boyama bir değerlendirme ile başlayın. Bademcik örnek Histoloji H & E slayt bir referans olarak kullanarak bir patolog ile incelenebilir. Chromogenic IHC bölümler aynı doku blokta aynı imleçli gerçekleştirilmesi durumunda, daha sonra bunlar yoğunluğu ve her işaretçisi MIF slayt üzerindeki dağıl...

Tartışmalar

Devam eden kanser immünoterapi devrim açılış roman ve umut verici olan kanser hastaları¹³için tedavi seçenekleri. IMMUNO-onkoloji alanında gelişmeler inflamatuar tümör microenvironment, sadece immünolojik mekanizmaların karsinojenezis içinde yer alan biyoloji anlamak için aynı zamanda akıllı biyolojik için yeni bulmak için artan bilgi gerektirir immünoterapi dayalı tedaviler^1,2. Kanser İmmünoloji karmaşık biyoloj...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
"InForm 2.4.2" Software for Spectral Unmixing and Image Analysis	PerkinElmer	CLS151066	Called "spectral unmixing software" in text
"Phenochart 1.0.9" QPTIFF Software for Selection of MSI and Overall Slide Scan Viewing	PerkinElmer	CLS151067	Called "QPTIFF software" in text
#1.5 Coverslips	Sigma Aldrich	2975246
200 Proof Ethanol	Koptec	V1001
20x Tris-Buffered Saline	VWR	J640-4L
Antibody Diluent	DAKO	S2203
Anti-CD68 Mouse Monoclonal	DAKO	M087601-2	Clone PG-M1
Anti-CD8 Rabbit Monoclonal	Ventana	M5392	Clone SP239
Anti-CK Mouse Monoclonal	DAKO	M351501-2	Clone AE1/AE3
Anti-ki67 Mouse Monoclonal	DAKO	M724001-2	Clone MIB-1
Anti-PD-1 Rabbit Monoclonal	Cell Signaling	#86163	Clone D4W2J
Anti-PD-L1 Rabbit Monoclonal	Ventana	790-4905	Clone SP263
Bond Dewax Solution	Leica	AR9222	Called "dewax solution" in text
Bond Epitope Retrieval Solution 1	Leica	AR9961	Called "ER1" in text
Bond Epitope Retrieval Solution 2	Leica	AR9640	Called "ER2" in text
Bond Open Containers, 30 mL	Leica	OP309700	Called "30 mL open containers" in text
Bond Open Containers, 7 mL	Leica	OP79193	Called "7 mL open containers" in text
Bond Polymer Refine Detection	Leica	DS9800	Called "chromogenic detection kit" in text
Bond Research Detection Kit	Leica	DS9455	Called "research detection kit" in text
Bond Titration Kit	Leica	OPT9049	Called "titration kit" in text
Bond Universal Covertile Novocastra	Leica	S21.2001	Called "covertiles" in text
Bond Wash Solution 10X Concentrate	Leica	AR9590	Called "10x wash solution" in text
BondRX Autostainer	Leica		Called "automated stainer" in text
BondRX Software Version 5.2.1.204	Leica		Called "automated stainer software" in text
Opal 7-Color Automation IHC Kit	PerkinElmer	NEL801001KT	Called "multispectral staining kit" in text
Peroxidase Block	Leica	RE7101
ProLong Diamond Antifade Mountant	Thermo	P36965	Called "slide mountant" in text
Starfrost Slides	Fisher	15-183-51
Vectra Polaris Multispectral Microscope with "Vectra 3.0.5" Software for Multispectral Microscope Control	PerkinElmer	CLS143455	Called "microscope control software" in text