Panel de inmunofluorescencia Multiplex automatizado para estudios de inmuno-Oncología en los especímenes del tejido formalina-fijo Carcinoma

Resumen

Un protocolo detallado para un panel de inmunofluorescencia multiplex marcador seis es optimizado y realizado, utiliza un teñidor automático para resultados más consistentes y un menor tiempo de procedimiento. Este enfoque puede adaptarse directamente por cualquier laboratorio para estudios de inmuno-Oncología.

Resumen

Continua evolución de inmuno-Oncología requiere una mayor comprensión de los mecanismos de la inmunología del cáncer. El análisis immunoprofiling de muestras de tejido de biopsias de formalina-fijos, parafina-encajado (FFPE) se ha convertido en una herramienta clave para entender la complejidad de la inmunología tumoral y descubrimiento de nuevos biomarcadores predictivos para la inmunoterapia del cáncer. Immunoprofiling análisis de los tejidos requiere la evaluación de marcadores combinados, incluyendo las subpoblaciones de células inflamatorias y los puestos de control inmunes en el microambiente del tumor. El advenimiento de métodos inmunohistoquímicos multiplex novela permite un más eficiente Análisis multiparamétrico de secciones del tejido fino solo que hace estándar monoplex immunohistochemistry (IHC). Una inmunofluorescencia múltiplex disponible comercialmente (si) método se basa en la amplificación de la señal tyramide y, combinado con el análisis microscópico multiespectral, permite una mejor separación de señal de diversos marcadores en el tejido. Esta metodología es compatible con el uso de anticuerpos primarios no conjugados que se han optimizado para IHC estándar en las muestras de tejido FFPE. Adjunto describimos detalladamente un protocolo automatizado que permite multiplex si el etiquetado de las muestras de tejido de carcinoma con un panel de anticuerpos multiplex marcador seis compuesto por PD-L1, 1 PD, CD68, CD8, Ki-67 y citoqueratinas AE1/AE3 con 4′, 6-diamidino-2-phenylindole como una contratinción nuclear de la célula. El protocolo multiplex panel está optimizado en un teñidor automático de IHC para un tiempo de tinción es más corto que el del protocolo manual y directamente aplicado y adaptado por cualquier investigador de laboratorio para estudios de inmuno-Oncología en muestras humanas de tejido FFPE. También se describe son varios controles y herramientas, incluyendo un método de control de gota fina control de calidad de un nuevo panel multiplex de IF, que son útiles para la optimización y validación de la técnica.

Introducción

Immunoprofiling análisis de muestras de tejido FFPE tumor se ha convertido en un componente esencial de los estudios de inmuno-Oncología, particularmente para el descubrimiento y validación de nuevos biomarcadores predictivos para la inmunoterapia del cáncer en el contexto de ensayos clínicos^{1 ,2}. IHC cromogénica, utilizando químicos cromógenos como diaminobenzidina, sigue siendo la técnica estándar en patología diagnóstica de la inmunomarcación de biopsia del tejido³. IHC estándar puede usarse también para immunoprofiling de tejido de cáncer, incluyendo la cuantificación de subpoblaciones de linfocitos tumorales asociadas y la evaluación de los niveles de expresión de checkpoints inmunes como ligando de muerte celular programada 1 (PD-L1)^{4 ,5}. IHC estándar es limitada, sin embargo, en sólo un antígeno puede ser etiquetado según la sección de tejido. Porque immunoprofiling estudios requieren típicamente el análisis de la expresión combinada de varios marcadores, el uso de IHC estándar requiere la tinción de múltiples secciones de tejido, cada uno manchado con un marcador único y por lo tanto, sería sustancialmente limitado para el análisis de muestras de tejido pequeñas tales como las biopsias de aguja de núcleo. Estándar métodos IHC también son limitados para la evaluación de marcadores que son coexpressed por poblaciones de diversas células, como sucede con los marcadores de control inmune como PD-L1, que es expresada por macrófagos asociados a tumor y las células cancerosas. Esta limitación se ha divulgado en, por ejemplo, el uso del estándar monoplex IHC por los patólogos para el análisis cuantitativo de un marcador IHC expresado por células diversos tipos⁶. El desarrollo de técnicas de IHQ cromogénicos múltiplexes empleando diversos cromógenos coloreados en el mismo tejido sección representa un adelanto sobre el método estándar de monoplex IHC,⁷ aunque siguen siendo limitados por la inmunomarcación de unos pocos marcadores y también presenta un importante desafío técnico para la adecuada evaluación de marcadores expresados en el mismo compartimientos subcelulares de las mismas poblaciones de células.

Las salvedades mencionadas en cuanto a la disponibilidad de tejido de las muestras clínicas, así como las limitaciones de las técnicas de IHQ cromogénicos multiplexores, han dado lugar a la necesidad de desarrollar mejores métodos multiplexores para estudios de inmuno-Oncología etiquetado fluorescente combinado con sistemas que efectivamente pueden separar las señales de múltiples fluoróforos de la misma diapositiva de imágenes. Una tal técnica se basa en la amplificación de la señal de la tyramide (TSA) combinada con la proyección de imagen multiespectral de la microscopia de color eficiente separación⁸. Un kit disponible comercialmente basados en TSA emplea fluoróforos optimizado para imágenes multiespectrales⁸ (véase Tabla de materiales). Una ventaja fundamental de este sistema es su compatibilidad con los mismos anticuerpos primarios sin etiqueta que ya validadas y optimizadas para el estándar cromogénico IHC^9,10,11. Esto permite no sólo la optimización más rápida sino también la flexibilidad en las optimización y el panel de modificaciones incorporando nuevos objetivos. Además, el método TSA multiplex inmunofluorescencia (mIF) puede ser optimizado para comercios IHC stainer sistemas automatizados, lo que permite una transferencia sencilla de monoplex IHC cromogénico a FOMIN.

Aquí presentamos un protocolo para un panel de FOMIN para estudios de inmuno-Oncología basada en automatizado FOMIN TSA tinción y utiliza un escáner multiespectral para la proyección de imagen. Este protocolo puede ser adaptado y modificado por cualquier usuario con acceso a la instrumentación descrita y reactivos de laboratorio. El protocolo incluye un panel de seis anticuerpos primarios para la immunoprofiling de los carcinomas: PD-L1, PD-1, CD68 (como un marcador de pan-macrófago), CD8 (células T-citotóxicas), Ki-67 y AE1/AE3 (cacerola-cytokeratin, utilizado como marcador epitelial para la identificación de células del carcinoma). Un estudio reciente describe la optimización de un protocolo de FOMIN TSA manual utilizando IHC cromogénico como referencia estándar para validar el múltiplex tinción¹². El método actualizado presentado aquí ha sido desarrollado por con el equipo de TSA comercialmente disponible, siete colores optimizado en un teñidor automático, drásticamente acortando el tiempo de tinción de 3 – 5 días a 14 h, mejorando también la consistencia de la tinción. Además del protocolo principal detallado presentado aquí, una sección de Materiales complementarios incluye el método de "control de la gota", un proceso de control de calidad adicional para evaluar un nuevo panel de FOMIN, así como notas técnicas para la optimización, solución de problemas y desarrollo de nuevos paneles múltiplexes para ayudar al usuario del laboratorio para configurar y optimizar el método TSA de mIF FOMIN personalizados paneles.

Protocolo

Nota: El protocolo que presentamos describe cómo se realiza la immunoprofiling de un grupo de mIF con TSA para seis anticuerpos (CD68, ki67, PD-L1, PD-1, CD8 y AE1/AE3) en un stainer automatizado (véase Tabla de materiales). El protocolo también describe cómo realizar los controles de la caída de un control de calidad de un nuevo panel de FOMIN (ver Materiales complementarios). En este protocolo de tinción se realiza con ocho diapositivas FFPE sin mancha de la amígdala humana (control positivo) y ocho diapositivas sin manchas de adenocarcinoma pulmonar humano. La primera diapositiva se utiliza para el múltiplex completo tinción con todos los marcadores de seis, la segunda diapositiva para el control de isotipo en la que no hay anticuerpos primarios se utilizan y las restantes seis diapositivas para los controles de la gota (ver Materiales complementarios). Un control adicional de la autofluorescencia de los tejidos es altamente recomendable y siempre deben incluirse en un multicine de estudio (ver Materiales complementarios). Sin embargo, los investigadores pueden emplear otros tipos de tumores y controles según sus propios objetivos. Los usuarios de laboratorio sin experiencia previa con el FOMIN TSA método y técnicas de escáner multiespectral deben leer la guía de desarrollo de IHC Multiplex (disponible en línea en http://info.perkinelmer.com/2016-lp-Opalassaydevelopmentguide-lp). Aunque esta guía describe un protocolo de manual, también proporciona una buena introducción para el FOMIN tinción. Todas las secciones de tejido empleadas en el presente Protocolo se anonimizados y aprobadas según la declaración de Helsinki.

1. las muestras de tejido

1. Seleccionar una muestra de la amígdala humana de FFPE con hiperplasia linfoide a ser utilizado como control positivo y una muestra de adenocarcinoma de pulmón humano FFPE sabido que PD-L1 positivo. Revisión de las diapositivas de hematoxilina y eosina (H & E) de los bloques de cáncer de pulmón seleccionados para confirmar la presencia de un tumor. Es importante evitar tumores con abundantes zonas de necrosis como esto puede aumentar la tinción de fondo inespecífica.
   Nota: Para esta optimización, evitar el uso de bloques de parafina que se han almacenado durante 10 años o más y el tejido con un aspecto seco en el bloque de parafina (consulte con un técnico de histología).
2. Con un micrótomo, corte 10 secciones seriales consecutivas de cada bloque, 4 μm de espesor. Monte las secciones en un portaobjetos de vidrio cargada positivamente usado para IHC, una sección por diapositiva.
   Nota: Secciones deben montarse perfectamente plana sin arrugas, como las arrugas pueden generar artefactos de tinción. Número de las diapositivas de las secciones seriadas de 1 a 10.
3. Preparar una nueva diapositiva de H & E en la primera sección. Revisar la diapositiva con la ayuda de un patólogo para confirmar la presencia de tumor de pulmón o tejido de amígdala, restantes en el bloque de H & E.
   Nota: Esta diapositiva de H & E puede ayudar, más tarde, con la selección de las regiones de interés para el análisis multiespectral y fenotipado.
4. Guardar secciones sin manchas en una caja portaobjetos de plástico a 4 ° C hasta por tres meses.

2. creación de un nuevo FOMIN programa de tinción en un Stainer automatizado: registro de los reactivos

Nota: Reactivos deben agregarse a la lista de reactivos en el software de stainer automatizado antes de que estén disponibles para su uso en protocolos. Ver la Tabla de materiales para obtener información sobre el stainer automatizado modelo y versión de software.

1. Haga clic en la ficha de reactivos dentro del software de stainer automatizado. Haga clic en Agregar para designar un nuevo reactivo. Introduzca el nombre (por ejemplo, "520 TSA reactivo") y el nombre abreviado (por ejemplo, "TSA 520"), tomando nota de que hay un máximo de ocho caracteres. Auxiliares en el menú desplegable y escoja ajuste directamente. No cambie la Mancha sola/doble de DS solo/secuencial. Establecer el valor predeterminado protocolo f Protocolode tinción. Configurar el protocolo HIER por defecto a 20 ER1.
2. Guardar el reactivo nuevo y repita el paso 2.1 para todos los reactivos enumerados en la tabla 1.

3. automatizado Stainer: Registro de los envases

1. Escriba el nombre del reactivo para ser utilizado en el lado de cada contenedor. Escanear el código de barras en el lado. En la ventana emergente, seleccione el reactivo correcto de la lista. Seleccionar una fecha de caducidad y guardar.
2. Repita el procedimiento en el paso 3.1 para todos los reactivos enumerado en la tabla 1.
3. Registrar el equipo de investigación abiertas. Escanear ambos códigos de barras en el lado del kit y seguir las instrucciones en pantalla. Nombre del juego "Multiplex investigación Kit 1". Registrar el 1 x tris (hidroximetil) aminometano (Tris)-tamponada con solución salina como parte de este juego (tabla 1).

4. automatizado Stainer: Creación de un FOMIN programa de protocolo

1. El protocolo multiplex base está precargado con el nombre de Ópalo 7 Multiplex en teñidores automáticos nuevos (ver el modelo y versión de software en la Tabla de materiales). Localizar el protocolo de filtrado para "todos" en lugar de "preferido" en la pantalla de protocolo. Si el protocolo de base no está presente, entonces actualizar el software de stainer automatizado con ayuda del fabricante.
2. Todas las modificaciones deben realizarse en las copias del protocolo original. Antes de realizar cambios, guarde el original y crear una copia haciendo clic en la ficha protocolos , luego clic derecho el protocolo Opal 7 Multiplex y seleccionar Copy.
3. Cambie el nombre al Protocolo Multiplex 7 1 en la nueva ventana y seleccione la ficha asociada con el dispositivo correcto (modelo de piso o mesa). Coincide con el protocolo suplementario tablaS1. Haga clic en Añadir Reactivo para agregar un paso de 10 min de inhibición de la peroxidasa (no forma parte del protocolo estándar) y seleccione el inhibidor de la peroxidasa como el reactivo.
4. Confirmar que los pasos de bloqueo utilizan un tampón de bloqueo de PKI. Asegúrese de que cada anticuerpo primario se refiere al reactivo apropiado, que pasos de anticuerpo secundario utilizan un polímero HRP, y eso 4′ espectral, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) suministrado con el kit de automatización multiespectral se utiliza. Confirmar todas las opciones marcando el reactivo que ha sido designado para cada paso correspondiente en el menú desplegable en la pantalla de protocolo.

5. automatizado Stainer: Además de los controles de la gota y Protocolo de Control de isotipo

1. Copiar el nombre Protocolo Multiplex 7 1 y cambie a 7 Protocolo Multiplex 1 CD68 gota. Cambie el reactivo anticuerpo CD68 para IgG de ratón y guarde el protocolo.
2. Crear seis más nuevos protocolos, uno para cada control de gota y otro para el control de isotipo completa (cambiando todos los anticuerpos a los isotipos apropiado) de la misma manera.

6. Stainer automatizado: Protocolo de preparación de diapositiva

1. Copia del Protocolo de prestaining * hornear y Dewax y renombrar este protocolo multiespectral y Dewax 2 h.
2. Ajuste el protocolo para que coincida con los reactivos que se muestra en la tabla 2. Diapositivas de cocer al horno durante 2 h a 60 ° C. Dewax durante 30 s a 72 ° C.

7. automatizado Stainer: Preparación de los reactivos

1. Preparar un kit de detección de la investigación. Un reactivo debe asociarse permanentemente con este kit, para llenar el recipiente abierto 30 mL marcado para 1 x Tris-solución salina con tampón (TBS) con 1 x TBS y busque esta en la posición 1 (más alejado de la manija) en el kit de detección de investigación señalado Multiplex Kit de investigación 1. este reactivo se asocia permanentemente a este equipo de investigación y no debe cambiar la posición para uso futuro.
2. Etiqueta de dos envases de 30 mL abierto Bloque multiespectral y Multiespectrales secundaria. Llene el recipiente de Bloque multiespectral con 30 mL de tampón de bloqueo/anticuerpo diluyente desde el kit de tinción multiespectral. Llene el contenedor Secundario multiespectral con 30 mL de polímero anti-ratón anti/anti-conejo anti anticuerpo secundario desde el kit de tinción multiespectral.
3. Preparar diez contenedores abiertos de 7 mL. El volumen requerido en microlitros es de 600 + (150 x [número de diapositivas]). Cada anticuerpo se aplicará a 12 diapositivas en este caso (amígdala seis y seis de pulmón). El etiquetado y los volúmenes para todos los envases se indican en la tabla 3.
4. Para cada tubo de anticuerpos, primero añadir el anticuerpo diluyente, seguido por el anticuerpo primario concentrado en los volúmenes indicados en la tabla 3. Mezclar mediante pipeteo suave.
5. Preparar un recipiente abierto de 7 mL para DAPI, cuatro gotas del concentrado DAPI por mililitro de agua doble destilada; un total de 16 será teñido con DAPI (600 + [150 x 16] = 3.000 μl). Añadir 3 mL de agua destilada doble plus 12 gotas de DAPI espectral en el envase. Preparar fresco DAPI para cada serie.
6. Preparar un recipiente abierto de 7 mL de inhibidor de la peroxidasa. Todas las 16 diapositivas serán tratadas con el inhibidor de la peroxidasa (600 + [150 x 16] = 3.000 μl). Añadir 3 mL de bloqueo de la peroxidasa en el envase.
7. Antes de preparar el trabajo concentraciones de fluors, resuspender los fluors liofilizados añadir 75 μl de dimetilsulfóxido a cada tubo fluor proporcionado por el fabricante. Mezclar por pipeteo. Se trata de la acción del fluor TSA. Almacenar a 4 ° C.
8. Prepare seis contenedores de titulación, uno para cada fluor. El volumen requerido en microlitros es de 350 + (150 x [número de diapositivas]). Cada fluor se aplicará a las 16 diapositivas en este caso (amígdala ocho y ocho de pulmón). El etiquetado y los volúmenes para todos los envases se indican en la tabla 4.
9. Cuando todos los reactivos han sido registrados y preparado, colocar cada envase en cualquier posición en una parrilla y carga todos los reactivos en el stainer automatizado. El sondeo confirma el volumen de cada reactivo.

8. automatizado Stainer: Muestra la configuración y coloración multiespectral

1. En el software de stainer automatizado, haga clic en configuración de diapositiva en la parte superior de la pantalla. Haga clic en agregar estudio. Rellenar la ventana emergente con el ID de estudio nombre del estudio y comentarios.
   1. Seleccione el nombre del investigador de llevar a cabo el funcionamiento de la tinción de la lista desplegable. Dejar el volumen dispensado en 150 μL. Seleccione multiespectral Dewax protocolo de preparación. Haga clic en Aceptar y agregar diapositivas. En comentarios, escriba "Múltiplex 1 pulmón 123ABC." Complete los siguientes campos como se indica: Tipo de tejido = tejido de prueba; Volumen dispensado = 150 μL; Modo de tinción = simple, rutinaria; Marcador = negativo; La coloración = tipo "7 multiplexar protocolo 1"; Preparación = Bake multiespectral, Dewax 2 h; HIER = HIER 20 min con ER1.
2. Haga clic en Agregar Diapositiva y cambiar los comentarios y protocolo añadir diapositivas control de gota y control deslizante de isotipo. Cuando todas las diapositivas se han añadido al estudio, cierre la ventana agregar diapositivas e imprimir etiquetas. Coloque las etiquetas en el área de la etiqueta apropiada en cada diapositiva.
3. Cargue los portaobjetos en racks, aplicar azulejos de cubierta en la orientación correcta, inserte los estantes en el stainer automatizado y bajar las bandejas. El dispositivo escaneará las etiquetas diapositiva.
4. Cuando todas las diapositivas y los reactivos han sido analizados y medidos. Activará el interruptor de marcha (►). Si el autostainer detecta los errores, tales como volumen insuficiente de reactivo, aparece un símbolo de advertencia amarillo por la bandeja de afectados. Si se produce un error, haga clic con el botón derecho el símbolo de precaución y remediar el error.
5. Iniciar la tinción inmediatamente o programar un inicio con retardo. El protocolo es aproximadamente 14 h de duración. Nota: Asegúrese de que el protocolo se completa en un momento cuando las diapositivas pueden eliminarse inmediatamente como Teloslozhenie lavado podría afectar resultados de tinción.

9. cubreobjetos de diapositivas multiespectrales

1. Quite las diapositivas de stainer automatizado y almacenarlos en un estante sumergido en 1 x cucharadas
2. Montar las muestras con cubreobjetos no. 1.5 y 15 μl de los medios de montaje (véase Tabla de materiales). Eliminar las posibles burbujas presionando suavemente el cubreobjetos con una punta de pipeta.
3. Deje que los portaobjetos curar durante la noche a temperatura ambiente en el Banco de laboratorio. Diapositivas pueden digitalizarse inmediatamente con el tratamiento cuidadoso.

10. multiespectral Scanner

1. Encienda el escáner multiespectral y su equipo (véase Tabla de materiales información modelo y software). Inicie el software de control de microscopio. Abra la puerta frontal del escáner multiespectral con la tecla sensible al tacto en la parte frontal del dispositivo. Cada portadora por resorte en el escáner contiene cuatro diapositivas. Cargar todas las diapositivas en portadores y grabar la orden antes de los portadores de carga en el dispositivo.
2. Seleccione Protocolo de edición y haga clic en nuevo...; crear el nombre de protocolo Multiplex del Panel 1 y soltar los controles. Crear el nombre de estudio Desarrollo del Panel de Multiplex, haga clic en Protocolo de creary escriba Resumen análisis filtro DAPI; a continuación, seleccione Todo Slide Scan y Pixel resolución 0.50 μm (20 X). Deben estar representadas todos los filtros y bandas. Si no, haga clic en Editar filtros y bandas, seleccione todos los cinco filtros (DAPI, FITC, CY3, Texas Red y CY5) y a continuación, haga clic en Editar exposiciones.
3. El portador de carga seleccionando el portador con el múltiplex completo de adenocarcinoma de pulmón. Seleccione la diapositiva correcta mediante la interfaz gráfica de usuario. Enfocar el tejido manualmente o mediante el uso de enfoque automático. Desplazarse a cualquier zona con aceptable de la coloración de DAPI y haga clic en Auto-exponer para ajustar la exposición en milisegundos (0 – 2.000 ms).
4. Repita el mismo procedimiento para los cinco juegos de filtro en columnas el escaneo todo y región de MSI. Asegúrese de navegar a un área con coloración aceptable y enfocar el microscopio antes de la exposición para cada nivel de filtro y amplificación. Auto-exponer para todos cinco filtros en un 20 x exploración general y 20 x multiespectrales regiones multiespectrales de proyección de imagen (ICM). Seleccione una resolución de pixel de 0.50 μm (20 x). Guardar el protocolo y haga clic en atrás para volver a la pantalla principal del software Vectra; a continuación, haga clic en Escanear diapositivas.
5. Abre la interfaz para cada diapositiva y tarea a analizar. Establece estudio en Desarrollo del Panel de Multiplex, Protocolo Multiplex del Panel 1y soltar los controles y ID tobogán Múltiplex pulmonar ABC123, Multiplex CD68 gota pulmón ABC123, etcetera . Cuando las diapositivas han sido etiquetadas y se establecen tareas, haga clic en escanear. El escáner multiespectral automatizado realizará exploraciones de diapositiva completa de todas las diapositivas con todos los filtros de cinco.

11. multiespectral escáner: Las imágenes multiespectrales

1. Una vez terminados los análisis, abra el software QPTIFF ("Phenochart") y haga clic en Diapositiva de carga en la parte superior izquierda. Se abrirá un QPTIFF, que es un filtro de cinco diapositiva todo análisis. Cada capa contiene información de más de un fluor, por lo que la utilidad es limitada, pero la estructura del tejido y los patrones de expresión amplia son evidentes y pueden utilizarse para seleccionar regiones de MSI.
2. Desplácese a y abra la diapositiva correcta en el estudio usando el árbol desplegable de la izquierda. Sesión (arriba a la derecha) con las iniciales del usuario.
3. Seleccione cinco regiones para MSI mediante la herramienta de sello en la parte superior de la pantalla. Consulte a un especialista si está disponible. En seleccionar, seleccione adquisición; en tamaño de campos, seleccione 1 x 1; y bajo restricción de campo, seleccione 0,5 μm (20 x). Basado en el cytokeratin (CK) tinción (principalmente en Cy5), seleccionar varias regiones con tumor (CK +) y estroma (CK-) para ser reflejada de la exploración general. Repita este procedimiento para cada diapositiva.
4. Una vez seleccionada todas MSI, cerrar el software de Phenochart y volver al software Vectra . Cambiar la tarea de analizar a MSI para cada diapositiva y, a continuación, haga clic en Scan nuevamente para realizar la colección de MSI.

12. espectral idear

Nota: El paso de unmixing espectral se requiere para la separación de canal y análisis de imágenes de las diapositivas. Antes de unmixing espectral se realiza en el software de informar, debe construirse la biblioteca espectral usando diapositivas de adenocarcinoma de pulmón manchadas con cada fluor solo y con DAPI solo. Este procedimiento también se describe en el ya mencionado Multiplex IHC ensayo guía de desarrollo.

1. Cuando se completa la adquisición de MSI, utilice unmixing espectral ("informar") software para abrir archivos en la carpeta MSI . Estos archivos terminan con la extensión de tipo de archivo de .im3.
2. En formato de imagen, seleccione multiespectral; en formato de muestra, seleccione fluorescencia; y en fuente de la biblioteca espectral, seleccione InForm.
3. Para seleccionar fluors, seleccione y cargue todos los seis fluors y DAPI de la biblioteca construida con las diapositivas de biblioteca de adenocarcinoma de pulmón. Haga clic en Preparar todo (inferior izquierda). Software unmixing espectral realiza unmixing espectral en todas las imágenes abiertas, utilizando los perfiles espectrales proporcionados.
4. Con un patólogo, evaluar el patrón de tinción contra manchas solo cromogénicos del objetivo mismo en diapositivas secuenciales del mismo tejido.

13. evaluación de la intensidad de la fluorescencia y la atenuación de la señal

Nota: La herramienta de cuentas, que aparece como una flecha con una pequeña caja marrón, es la herramienta más importante para la optimización de multiplex y debe ser utilizada con frecuencia (ver Materiales complementarios). Con la herramienta de cuentas en el software de unmixing espectral, evaluar el cociente signal-to-noise, que como mínimo debe superar los 10:1 (ver Material suplementario para solucionar problemas y para la evaluación del multiplex la coloración con los controles de la gota).

1. 13.1. con una imagen abierta en el software de unmixing espectral, enganche la herramienta cuentas y encuesta de imágenes para evaluar la intensidad de fluorescencia de cada canal. La intensidad de blanco en tejido pulmonar está entre 10 y 20 cuentas normalizadas. La herramienta de normalizado de la cuenta se muestra en la figura 1.
2. Excluir diapositivas con cuentas de señal máxima de cuentas de área de señal de menos de 10 o normal de menos de cinco por cualquier marcador para que la autofluorescencia y la coloración fuera del objetivo no compiten con la señal auténtica.
3. Diapositivas de excluir con máximo cuenta mayor de 30 para cualquier canal evitar sangrado espectral o unmixing espectral ineficiente.
4. Dirección altas o bajas de cuentas normalizadas mediante el ajuste de la concentración de la TSA.

14. Análisis de la imagen multiespectral

1. Abrir MSI uno o más en el software unmixing espectral y fluors sólo seleccionados de unmixing en al menos una imagen abierta. Haga clic en Preparar todo para separar todas las imágenes para producir imágenes espectral sin mezclar color actualmente abierto.
2. Seleccione la herramienta de cuenta a cuenta a través de cada imagen por revoloteando sobre las áreas de interés.
3. Seleccione el icono de ojo para abrir el editor de la vista. Seleccionar y ajustar la intensidad de la pantalla de cada canal independiente.
4. Seleccione configurar para abrir la segmentación del tejido, segmentación de la célula, phenotyping y módulos de puntuación. Estas herramientas son necesarias para la validación objetiva de multiplex tinción contra manchas solo cromogénicos y pueden utilizarse para generar datos cuantitativos phenoptic (Figura S1).
5. Utilice la ficha exportar para guardar en escala de grises, fluorescente pathview-estilo sin compresión TIFF y archivos de datos de los módulos de análisis de phenoptic para más análisis, archivo y presentaciones (Figura S1).

Resultados

El protocolo descrito aquí proporcionará resultados como los mostrados en la figura 2. Comenzar con una evaluación de la tinción en el control de la amígdala, comenzando con el epitelio escamoso superficial. La histología de la muestra de la amígdala puede ser revisada con un patólogo, haciendo referencia a la diapositiva de H & E. Si secciones IHC cromogénicos se realizan con los mismos marcadores en el mismo bloque de tejido, entonces estos pueden ...

Discusión

La revolución de la inmunoterapia de cáncer curso es apertura nuevas y prometedoras opciones terapéuticas para pacientes de cáncer¹³. Avances en el campo de la inmuno-Oncología requiere mayor conocimiento del microambiente del tumor inflamatorio, no sólo para entender la biología de los mecanismos inmunológicos involucrados en la carcinogénesis pero también para encontrar biomarcadores predictivos para el nuevo tratamientos basados en inmunoterapia^1,

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
"InForm 2.4.2" Software for Spectral Unmixing and Image Analysis	PerkinElmer	CLS151066	Called "spectral unmixing software" in text
"Phenochart 1.0.9" QPTIFF Software for Selection of MSI and Overall Slide Scan Viewing	PerkinElmer	CLS151067	Called "QPTIFF software" in text
#1.5 Coverslips	Sigma Aldrich	2975246
200 Proof Ethanol	Koptec	V1001
20x Tris-Buffered Saline	VWR	J640-4L
Antibody Diluent	DAKO	S2203
Anti-CD68 Mouse Monoclonal	DAKO	M087601-2	Clone PG-M1
Anti-CD8 Rabbit Monoclonal	Ventana	M5392	Clone SP239
Anti-CK Mouse Monoclonal	DAKO	M351501-2	Clone AE1/AE3
Anti-ki67 Mouse Monoclonal	DAKO	M724001-2	Clone MIB-1
Anti-PD-1 Rabbit Monoclonal	Cell Signaling	#86163	Clone D4W2J
Anti-PD-L1 Rabbit Monoclonal	Ventana	790-4905	Clone SP263
Bond Dewax Solution	Leica	AR9222	Called "dewax solution" in text
Bond Epitope Retrieval Solution 1	Leica	AR9961	Called "ER1" in text
Bond Epitope Retrieval Solution 2	Leica	AR9640	Called "ER2" in text
Bond Open Containers, 30 mL	Leica	OP309700	Called "30 mL open containers" in text
Bond Open Containers, 7 mL	Leica	OP79193	Called "7 mL open containers" in text
Bond Polymer Refine Detection	Leica	DS9800	Called "chromogenic detection kit" in text
Bond Research Detection Kit	Leica	DS9455	Called "research detection kit" in text
Bond Titration Kit	Leica	OPT9049	Called "titration kit" in text
Bond Universal Covertile Novocastra	Leica	S21.2001	Called "covertiles" in text
Bond Wash Solution 10X Concentrate	Leica	AR9590	Called "10x wash solution" in text
BondRX Autostainer	Leica		Called "automated stainer" in text
BondRX Software Version 5.2.1.204	Leica		Called "automated stainer software" in text
Opal 7-Color Automation IHC Kit	PerkinElmer	NEL801001KT	Called "multispectral staining kit" in text
Peroxidase Block	Leica	RE7101
ProLong Diamond Antifade Mountant	Thermo	P36965	Called "slide mountant" in text
Starfrost Slides	Fisher	15-183-51
Vectra Polaris Multispectral Microscope with "Vectra 3.0.5" Software for Multispectral Microscope Control	PerkinElmer	CLS143455	Called "microscope control software" in text