福尔马林固定癌组织标本免疫肿瘤学自动复合免疫荧光小组研究

摘要

对6个标记多重免疫荧光面板的详细协议进行了优化和执行, 使用自动着色器实现更一致的结果和更短的手术时间。这种方法可以直接由任何实验室用于免疫肿瘤学研究。

摘要

免疫肿瘤学的持续发展需要对癌症免疫学机制有更多的了解。从福尔马林固定、石蜡包埋 (ffpe) 活检中对组织样本进行免疫分析, 已成为了解肿瘤免疫学复杂性和发现癌症免疫治疗新的预测生物标志物的关键工具。组织免疫分析需要评估肿瘤微环境中的组合标志物, 包括炎性细胞亚群和免疫检查点。新型多重免疫组织化学方法的出现使得单组织切片的多参数分析比标准单次免疫组织化学 (ihc) 更有效。一种商业上可用的多重免疫荧光 (if) 方法基于钟形信号放大, 并结合多谱显微分析, 可以更好地分离组织中的各种标记物的信号。这种方法与使用未共轭的原生抗体是兼容的, 这些抗体在 ffpe 组织样本上已经为标准 ihc 进行了优化。在此, 我们详细介绍了一种自动化协议, 该协议允许用 pd-1、pd-1、cd68、cd8、ki-67 和 aeeenae3 细胞角蛋白的6个标记抗体面板对肿瘤组织样本进行多重 if 标记, 其中含有 4 '、6-二胺-2-苯二胺作为核细胞的反染色多面板协议在自动化 ihc 染色机中进行了优化, 染色时间比手动协议短, 任何实验室调查员都可以直接应用和调整多路面板协议, 以便对人体 ffpe 组织样本进行免疫肿瘤学研究。还介绍了几种控制和工具, 包括一种用于新的多重 if 面板的精细质量控制的下拉控制方法, 这些方法对于优化和验证该技术非常有用。

引言

ffpe 肿瘤组织样本的免疫分析已成为免疫肿瘤学研究的重要组成部分, 特别是在临床试验背景下发现和验证癌症免疫治疗的新预测生物标志物^{1 ,2}。使用二胺苯并定等化学色素的致变色剂, 仍然是诊断活检组织3免疫标记的标准技术.标准 ihc 还可用于肿瘤组织免疫分析, 包括定量肿瘤相关淋巴细胞的亚群, 以及评估免疫检查点的表达水平, 如程序性细胞死亡配体 1 (pd-l1)^{4 ,5}。标准 ihc 是有限的, 但是, 因为每个组织部分只能标记一种抗原。由于免疫分析研究通常需要分析几个标记的组合表达, 使用标准 ihc 将需要对多个组织切片进行染色, 每个部分都用一个标记染色, 因此,极大地限制了小组织样品的分析, 如芯针活检。标准 ihc 方法对于评估由不同细胞群体共同表达的标记也有限, 这与免疫检查标志物 (如 pd-l1) 很常见, 后者由肿瘤相关的巨噬细胞和癌细胞表达。例如, 病理学家使用标准单效 ihc 对不同类型^的细胞6所表达的 ihc 标记进行定量分析时就报告了这一限制。在同一组织切片上采用不同颜色的 ihc 技术的发展代表了比标准 ihc 单次方法的进步,⁷尽管它们仍然受到少数人免疫标记的限制标记, 也是一个重要的技术挑战, 以正确评估标记表达在相同的亚细胞隔间相同的细胞群。

上述关于临床样本组织可用性的警告, 以及多重显色 ic 技术的局限性, 导致有必要开发改进的多重方法, 用于免疫肿瘤学研究。荧光标记与成像系统相结合, 可以有效地将多个荧光体的信号与同一幻灯片分离。其中一项技术是基于 tylab 信号放大 (tsa) 与多光谱显微镜成像相结合^,以实现高效的分色8。一种市售的基于 tsa 的试剂盒采用了针对多光谱成像⁸进行优化的荧光 (见材料表)。该系统的一个关键优势是它与相同的未标记的原生抗体的兼容性, 这些抗体已经为标准显色 ihc^9、10、11进行了验证和优化。这不仅可以实现更快的优化, 还可以灵活地进行包含新目标的优化和面板修改。此外, 多重免疫荧光 (mif) tsa 方法可以针对市售的自动化 ihc 污渍系统进行优化, 从而实现从单剂显色原 ihc 到 mif 的直接转移。

在这里, 我们提出了一个用于免疫肿瘤学研究的 mif 面板的协议, 该程序基于自动 mif tsa 染色, 并使用多光谱扫描仪进行成像。任何能够访问所述仪器和试剂的实验室用户都可以对该协议进行调整和修改。该协议包括一个由六种主要抗体组成的小组, 用于肿瘤的免疫分析: pd-l1、pd-1、cd68 (作为一种泛巨噬细胞标记)、cd8 (t-细胞毒性细胞)、ki-67 和 ae半 e3 (泛细胞角蛋白, 用作识别的上皮标记物癌细胞)。最近的一项研究描述了利用显色 ihc 作为标准参考来验证多重染色12的手动 tsa mif 协议的优化。此处介绍的更新方法是通过使用商用七色 tsa 套件在自动着色器中进行优化而开发的, 将染色时间从3-5天大幅缩短到 14小时, 同时还提高了染色的一致性。除了这里介绍的详细的主要协议外,补充材料部分还包括 "下拉控制" 方法、评估新 mif 面板的附加质量控制过程以及优化的技术说明,故障排除, 并开发新的多路面板, 以帮助实验室用户建立和优化 mif tsa 方法的定制 mif 面板。

研究方案

请注意:本文介绍的协议描述了如何使用 tsa 对自动着色器上的六种抗体 (cd68、ki67、pd-l1、pd-1、cd8 和 aetueae3) 进行 mif 面板的免疫分析 (见材料表)。该协议还描述了如何执行放置控制以实现新 mif 面板的质量控制 (请参阅补充材料)。在这个方案中, 染色是与8个未染色 ffpe 幻灯片从人体扁桃体 (阳性控制) 和八个未染色幻灯片从人的肺腺癌进行。第一张幻灯片用于所有六个标记的完全多重染色, 第二张幻灯片用于不使用主要抗体的同型控制, 其余6张幻灯片用于掉落控制 (请参阅补充材料)。强烈建议对组织自体荧光进行额外控制, 并应始终将其纳入多重研究 (请参阅补充材料)。不过, 研究人员可以根据自己的项目目标, 使用其他肿瘤类型和控制。以前没有 mif tsa 方法和多光谱扫描仪技术经验的实验室用户应阅读《多重 ihc 开发指南》 (可在线查阅, http://info.perkinelmer.com/2016-lp-Opalassaydevelopmentguide-lp)。虽然本指南描述了手动协议, 但也很好地介绍了 mif 染色方法。该议定书中使用的所有组织部分都是匿名的, 并根据《赫尔辛基宣言》获得批准。

1. 组织样本

1. 选择含有淋巴增生的 ffpe 人扁桃体样本作为阳性对照, 并选择已知为 pd-l1 阳性的 ffpe 人肺腺癌样本。回顾选定肺癌块的血红素和 eosin (h & e) 幻灯片, 以确认肿瘤的存在。重要的是要避免肿瘤与丰富的坏死区域, 因为这可能会增加非特异性背景染色。
   请注意:对于此优化, 请避免使用已储存10年或10年以上的石蜡块, 以及在石蜡块中使用外观干燥的组织 (请咨询组织学技术人员)。
2. 使用微孔, 从每个块中切割10个连续的串行切片, 厚度为4微米。将部分安装在用于 ihc 的带正电荷的玻璃滑块上, 每张幻灯片的截面为一段。
   请注意:切片必须安装完美平坦, 没有皱纹, 因为皱纹可能会产生染色伪影。将串行节的幻灯片编号从1到10。
3. 在第一部分上准备一个新的 h & e 幻灯片。在病理学家的帮助下, 回顾 h & e 滑块, 以确认扁桃体组织或肺肿瘤的存在留在块中。
   请注意:这个 h & e 幻灯片可以帮助, 稍后, 为多谱分析和表型感兴趣的区域的选择。
4. 在4°c 的塑料滑盒中存放未染色的部分, 时间长达三个月。

2. 在自动染色程序上创建新的 mif 染色程序: 注册试剂

请注意:必须先将试剂添加到自动着色器软件中的试剂列表中, 然后才能在协议中使用。有关自动着色器型号和软件版本的信息, 请参阅材料表。

1. 单击自动着色器软件中的"试剂" 选项卡。单击"添加"指定新的试剂。输入名称 (例如, "520 tsa 试剂") 和缩写名称 (例如, "520 tsa"), 并注意到最多有8个字符。从下拉菜单中选择 "辅助" , 然后设置供应商。不要更改单-顺序 ds中的单-双污渍.将默认染色协议设置为"协议 f"。将默认的 hier 协议设置为er120。
2. 保存新的试剂, 并对表 1中列出的所有试剂重复步骤2.1。

3. 自动安装器: 集装箱的注册

1. 在每个容器的一侧写入要使用的试剂的名称。扫描侧面的条形码。在弹出窗口中, 从列表中选择正确的试剂。选择到期日期并保存。
2. 对表 1中列出的所有试剂重复步骤3.1 中的过程。
3. 注册公开研究工具包。扫描套件一侧的两个条形码, 并按照屏幕上的提示进行操作。将套件命名为 "多重研究工具包 1"。将1x 的三 (羟基甲基) 氨基甲烷 (tris) 缓冲盐水作为该试剂盒的一部分进行登记 (表 1)。

4. 自动安装程序: 创建 mif 协议程序

1. 基本多路协议在新的自动着色器上预装了名称为 opal 7 多重 (请参阅"材料表" 中的型号和软件版本)。通过筛选协议屏幕上的 "全部" 而不是 "首选" 来找到协议。如果基本协议不存在, 则在制造商的协助下更新自动着色器软件。
2. 所有修改都应在原始协议的副本上进行。在进行更改之前, 请保存原始文件并通过单击 "协议" 选项卡创建副本, 然后右键单击opal 7 多重协议并选择"复制"。
3. 将新窗口中的名称更改为7个多重协议 1,并选择与正确设备 (地板型号或台式)关联的选项卡。匹配补充表 s1中的协议。单击 "添加试剂"添加10分钟过氧化物酶抑制步骤 (不是标准协议的一部分), 然后选择过氧化物酶抑制剂作为试剂。
4. 确认阻塞步骤使用 pki 阻止缓冲区。确保每个主要抗体都是指适当的试剂, 二级抗体步骤利用 hrp 聚合物, 并利用多光谱自动化试剂盒提供的光谱 4 '、6-二胺-2-苯二苯并无酮 (dapi)。通过检查已为协议屏幕上的下拉菜单中的每个相应步骤指定的试剂来确认所有选项。

5. 自动安装器: 掉落控制和异型控制协议的添加

1. 复制名称7 多重协议 1,并将其更改为7 多重协议 1 cd68 drop.将试剂cd68 抗体改为小鼠 igg 并保存该协议。
2. 以同样的方式创建另外六个新的协议, 每个掉落控制一个, 另一个用于完全的同型控制 (将所有抗体更改为适当的异构)。

6. 自动安装器: 幻灯片制备协议

1. 复制预染色协议* 烘焙和去蜡, 并重命名该协议的多光谱烘焙和去蜡 2 h.
2. 调整协议以匹配表2中所示的试剂。在60°c 下烤滑片2小时。在72°c 下脱水30秒。

7. 自动安装器: 试剂的制备

1. 准备一个研究检测试剂盒。一个试剂必须与此试剂盒永久关联, 因此, 将标记为 1x tbs 的 30 ml 开放容器与 1x tbs 一起填充, 并将其放置在指定的研究检测试剂盒中的位置 1 (距离手柄最远) 1. 本试剂将永久与本研究试剂相关联, 不得更改位置以供将来使用。
2. 标记两个 30 ml 开放容器多光谱块和多光谱二次.用多光谱染色试剂盒中的30毫升阻断的缓冲抗体稀释剂填充多光谱块容器。从多光谱染色试剂盒中加入30毫升的抗鼠嘴抗兔二级抗体聚合物。
3. 准备 10个7毫升打开的容器。微升所需的体积为 600 + (150 x [幻灯片数])。在这种情况下, 每个抗体将应用于12张幻灯片 (6 片扁桃体和6肺)。表 3中列出了所有容器的标签和卷。
4. 对于每个抗体管, 首先加入抗体稀释剂, 然后在表 3所示体积中加入浓缩的初级抗体。通过温和的移液混合。
5. 为 dapi 准备一个7毫升的开放容器, 每毫升双蒸馏水使用四滴 dapi 精矿;共有16个将被 dapi 染色 (600 + [150 x 16] = 3, 000μl)。在容器中加入3毫升的双蒸馏水, 外加12滴光谱 dapi。为每次运行准备新的 dapi。
6. 准备一个7毫升开放容器的过氧化物酶抑制剂。所有16张幻灯片将使用过氧化物酶抑制剂 (600 + [150 x 16] = 3, 000μl) 进行处理。在容器中加入3毫升的过氧化物酶块。
7. 在制备工作浓度的氟含量之前, 在制造商提供的每个氟管中加入75μl 的二甲基亚硫酸盐, 重新悬浮所有冻干的氟。通过移液混合。这是 tsa 的氟尔股票。存放在4°c。
8. 准备六个滴定容器, 每个流动器一个。微升所需的体积为 350 + (150 x [幻灯片数])。在这种情况下, 每个流露将应用于16张幻灯片 (8 片扁桃体和8肺)。表 4中列出了所有容器的标签和卷。
9. 在所有试剂都已注册和准备完毕后, 将每个容器放置在机架上的任何位置, 并将所有试剂加载到自动着色器上。探头将确认每个试剂的体积。

8. 自动染色: 样品设置和多光谱染色

1. 在自动着色器软件中, 单击屏幕顶部的 "幻灯片设置"。单击 "添加学习"。使用研究 id、研究名称和注释填充弹出窗口。
   1. 从下拉列表中选择进行染色运行的研究人员的姓名。将点胶体积保持在150μl。选择多光谱去蜡进行准备协议。单击"确定"和"添加幻灯片"。在注释下, 键入 "多重1龙 123 abc"。完成以下字段, 如图所示: 组织类型= 测试组织;分配量= 150μl;染色模式= 单, 常规;标记= 负;染色= 类型 "7 复用协议 1";制备= 多光谱烘焙, dewax 2小时;hier = 用 er1 20分钟。
2. 单击 "添加幻灯片"并更改注释和协议以添加拖放控制幻灯片和同型控制幻灯片。将所有幻灯片添加到研究中后, 关闭"添加幻灯片" 窗口并打印标签。将标签应用于每张幻灯片上相应的标签区域。
3. 将幻灯片加载到机架中, 以正确的方向应用盖板, 将机架插入自动着色器, 然后降低纸盒。设备将扫描幻灯片标签。
4. 当所有幻灯片和试剂都经过扫描和测量时。运行按钮 () 将变为活动状态。如果自动控制器检测到任何错误 (如试剂体积不足), 则受影响的纸盒将显示黄色警告符号。如果发生错误, 右键单击警告符号并更正错误。
5. 立即开始染色或计划延迟开始。该协议的持续时间约为14小时。请注意:确保协议将在可以立即取出幻灯片的时候完成, 因为洗脱可能会影响染色结果。

9. 多光谱幻灯片的覆盖

1. 从自动污渍机中取出幻灯片, 并将其存放在淹没在 1x tbs 中的机架中。
2. 用1.5 盖板和15μl 的安装介质安装样品 (参见材料表)。用移液器尖端轻轻按压盖板, 以去除任何气泡。
3. 允许幻灯片在室温下在实验室工作台上过夜固化。通过小心处理, 可以立即扫描未固化的幻灯片。

10. 多光谱扫描仪

1. 打开多光谱扫描仪及其计算机的电源 (有关模型和软件信息, 请参阅材料表)。启动显微镜控制软件。按下设备正面的触摸感应按钮, 打开多光谱扫描仪的前门。扫描仪中的每个弹簧加载托架都有四张幻灯片。将所有幻灯片加载到托架中, 并在将托架加载到设备之前记录订单。
2. 选择"编辑协议" , 然后单击 "新建...";"然后, 创建协议名称"多重面板 1" 和 "删除控件"。创建研究名称"多复用面板开发", 单击 "创建协议", 然后键入"概述扫描筛选器 dapi";然后, 选择 "整个幻灯片扫描" 和"像素分辨率0.50 微米 (20x)"。所有筛选器和波段都应表示。如果没有, 请单击"编辑筛选器和条带", 选择所有五个筛选器 (dapi、fitc、cy3、texas red 和 cy5), 然后单击"编辑暴露"。
3. 通过选择肺腺癌完全倍数的载体来加载载体。使用图形用户界面选择正确的幻灯片。手动或使用自动对焦对焦组织。导航到任何具有可接受的 dapi 染色区域, 然后单击 "自动曝光" 以毫秒 (0–2000 ms) 为单位设置曝光。
4. 对 "整个扫描" 和 "msi 区域" 列中的所有五个筛选器集重复相同的过程。在为每个滤光片和放大倍率设置曝光之前, 请务必导航到具有可接受染色的区域, 并重新聚焦显微镜。在20x 整体扫描和20x 多光谱成像 (msi) 多光谱区域中自动曝光所有五个滤波器。选择 0.50μm (20x) 的像素分辨率。保存协议, 然后单击"上一步" 返回到 vectra 软件的主屏幕;然后, 单击 "扫描幻灯片"。
5. 打开每张幻灯片的界面, 并将"任务 " 设置为 "扫描"。将研究设置为多重面板开发,设置多路面板1和跌落控制的协议, 并将幻灯片 id设置为多重肺 abc123、多重 cd68 滴肺 abcc123等.标记了所有幻灯片并设置了任务后, 单击 "扫描"。自动多光谱扫描仪将使用所有五个滤光片对所有幻灯片进行全幻灯片扫描。

11. 多光谱扫描仪: 多光谱成像

1. 扫描完成后, 打开qptiff软件 ("享图图"), 然后单击左上角的 "加载幻灯片" 。这将打开一个 qptff, 这是一个五过滤器全幻灯片扫描。每一层都包含来自多个氟度的信息, 因此效用有限, 但组织结构和广泛的表达模式是显而易见的, 可用于选择 msi 的区域。
2. 使用左侧的下拉树导航到并打开研究中的正确幻灯片。使用用户首字母登录 (右上角)。
3. 使用屏幕顶部的"戳" 工具为 msi 选择五个区域。如果有病理学家, 请咨询。在"选择为" 下, 选择 "获取";"在"字段中的大小" 下, 选择1x1;并在"字段限制" 下, 选择0.5μm (20x)。根据细胞角蛋白 (ck) 染色 (主要是 cy5), 选择肿瘤 (ck +) 和间质 (ck-l-) 的几个区域, 从整体扫描中进行成像。对每张幻灯片重复此过程。
4. 选择所有 msi 后, 关闭phenochart软件并返回到 vectra软件。将每张幻灯片的任务从"扫描" 更改为msi , 然后再次单击 "扫描" 以执行 msi 集合。

12. 光谱解混

请注意:在滑块的通道分离和图像分析中, 需要进行光谱非混合步骤。在在 form 软件中执行光谱非混合之前, 必须使用用每个流感单独染色的肺腺癌幻灯片和单独使用 dapi 来构建光谱库。上述多重 ihc 检测开发指南中也介绍了这一过程。

1. 当 msi 采集完成后, 使用频谱解混 ("inform") 软件打开msi文件夹中的文件。这些文件以. im3 文件类型扩展名结尾。
2. 在"图像格式"下, 选择"多光谱"; 在 "图像格式" 下, 选择 "多光谱"在"示例格式"下, 选择"荧光";, 在"光谱库源"下, 选择 "输入"。
3. 要选择流量, 请从使用肺腺癌库幻灯片构建的库中选择并加载所有六个流通量和 dapi。单击 "全部准备" (左下角)。光谱解混软件将使用所提供的光谱剖面, 对所有打开的图像执行光谱解混。
4. 与病理学家一起, 在同一组织的连续幻灯片中, 评估同一目标的染色体单色污渍的染色模式。

13. 荧光强度和信号衰减的评估

请注意:计数工具, 显示为箭头与一个小棕色箱子, 是最重要的工具为多重优化并且应该频繁地使用 (参见补充材料)。使用光谱解混软件中的计数工具, 评估信噪比, 至少应超过 10: 1 (请参阅用于故障排除和使用落差控制评估多重染色的补充材料)。

1. 13.1. 在光谱解混软件中打开图像后, 使用计数工具和测量图像来评估每个通道的荧光强度。肺组织的目标强度在10到20个归一化计数之间。规范化计数工具如图 1所示。
2. 排除最大信号计数小于10或正常信号面积计数小于5个的幻灯片, 以便自动荧光和非目标染色不会与真实信号竞争。
3. 排除任何通道最大计数大于30的幻灯片, 以避免光谱出血或低效光谱不混合。
4. 通过调整 tsa 浓度来解决高或低归一化计数问题。

14. 多光谱图像分析

1. 在光谱解混软件中打开一个或多个 msi, 并只选择至少在一个打开的图像中表示的用于非混合的流。单击 "全部准备" 以取消混合当前打开的所有彩色图像, 从而生成光谱式的非混合图像。
2. 选择计数工具, 通过悬停在感兴趣的区域上来测量每个图像的计数。
3. 选择眼睛图标以打开视图编辑器。选择并调整每个独立通道的显示强度。
4. 选择"配置"以打开组织分割、细胞分割、表型和评分模块。这些工具是对致变色单色污渍进行多重染色的客观验证所必需的, 可用于生成定量的视量数据 (图 s1)。
5. 使用 "导出" 选项卡可以保存灰度、荧光、路径式的未压缩 tiff 和来自视光分析模块的数据文件, 以便进一步分析、存档和演示 (图 s1)。

结果

此处描述的协议将提供如图 2所示的结果。从评估扁桃体控制中的染色开始, 从表面鳞状细胞上皮开始。扁桃体样本的组织学可与病理学家一起进行检查, 并以 h & e 幻灯片为参考。如果在同一组织块上使用相同的标记进行显色 ihc 切片, 则这些标记可用于确认 mif 幻灯片上每个标记的密度和分布。如图 2a 所示, 扁桃体?...

讨论

正在进行的癌症免疫治疗革命为癌症患者开辟了新的、有希望的治疗选择。免疫肿瘤学领域的进展将需要增加对炎症性肿瘤微环境的了解, 这不仅是为了了解致癌过程中免疫机制的生物学, 也是为了寻找新的预测生物标志物。免疫治疗 1^,2。由于癌症免疫学的复杂性, 通常需要对肿瘤组织样本进行审讯, 以形成越来越多的免疫标记物, 这些...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
"InForm 2.4.2" Software for Spectral Unmixing and Image Analysis	PerkinElmer	CLS151066	Called "spectral unmixing software" in text
"Phenochart 1.0.9" QPTIFF Software for Selection of MSI and Overall Slide Scan Viewing	PerkinElmer	CLS151067	Called "QPTIFF software" in text
#1.5 Coverslips	Sigma Aldrich	2975246
200 Proof Ethanol	Koptec	V1001
20x Tris-Buffered Saline	VWR	J640-4L
Antibody Diluent	DAKO	S2203
Anti-CD68 Mouse Monoclonal	DAKO	M087601-2	Clone PG-M1
Anti-CD8 Rabbit Monoclonal	Ventana	M5392	Clone SP239
Anti-CK Mouse Monoclonal	DAKO	M351501-2	Clone AE1/AE3
Anti-ki67 Mouse Monoclonal	DAKO	M724001-2	Clone MIB-1
Anti-PD-1 Rabbit Monoclonal	Cell Signaling	#86163	Clone D4W2J
Anti-PD-L1 Rabbit Monoclonal	Ventana	790-4905	Clone SP263
Bond Dewax Solution	Leica	AR9222	Called "dewax solution" in text
Bond Epitope Retrieval Solution 1	Leica	AR9961	Called "ER1" in text
Bond Epitope Retrieval Solution 2	Leica	AR9640	Called "ER2" in text
Bond Open Containers, 30 mL	Leica	OP309700	Called "30 mL open containers" in text
Bond Open Containers, 7 mL	Leica	OP79193	Called "7 mL open containers" in text
Bond Polymer Refine Detection	Leica	DS9800	Called "chromogenic detection kit" in text
Bond Research Detection Kit	Leica	DS9455	Called "research detection kit" in text
Bond Titration Kit	Leica	OPT9049	Called "titration kit" in text
Bond Universal Covertile Novocastra	Leica	S21.2001	Called "covertiles" in text
Bond Wash Solution 10X Concentrate	Leica	AR9590	Called "10x wash solution" in text
BondRX Autostainer	Leica		Called "automated stainer" in text
BondRX Software Version 5.2.1.204	Leica		Called "automated stainer software" in text
Opal 7-Color Automation IHC Kit	PerkinElmer	NEL801001KT	Called "multispectral staining kit" in text
Peroxidase Block	Leica	RE7101
ProLong Diamond Antifade Mountant	Thermo	P36965	Called "slide mountant" in text
Starfrost Slides	Fisher	15-183-51
Vectra Polaris Multispectral Microscope with "Vectra 3.0.5" Software for Multispectral Microscope Control	PerkinElmer	CLS143455	Called "microscope control software" in text