Painel de imunofluorescência Multiplex automatizada para estudos imuno-oncologia em amostras de Carcinoma fixada em formol

Resumo

Um protocolo detalhado para um painel de seis-marcador multiplex imunofluorescência é otimizado e executado, usando um corante automatizado para resultados mais consistentes e um menor tempo de procedimento. Esta abordagem pode ser adaptada directamente por qualquer laboratório de estudos imuno-oncologia.

Resumo

Evolução contínua em imuno-Oncologia exige uma maior compreensão dos mecanismos da imunologia do câncer. A análise de immunoprofiling de amostras de tecido de biópsias de formalin-fixas, parafina (FFPE) tornou-se uma ferramenta-chave para entender a complexidade da imunologia do tumor e descobrir novos biomarcadores preditivos para imunoterapia. Immunoprofiling análise de tecidos requer a avaliação de marcadores combinadas, incluindo subpopulações de células inflamatórias e imunes, pontos de verificação, o microambiente do tumor. O advento de métodos de imuno-histoquímica multiplex romance permite uma análise mais eficiente Multiparamétrico de seções do tecido único do que o padrão monoplex imuno-histoquímica (IHC). Uma imunofluorescência multiplex comercialmente disponível (se) método é baseado na amplificação do sinal de tyramide e, combinado com a análise microscópica multiespectral, permite uma melhor separação de sinal de diversos marcadores no tecido. Esta metodologia é compatível com o uso de anticorpos primários unconjugated otimizadas para IHC padrão em amostras de tecido FFPE. Neste documento descrevemos detalhadamente um protocolo automatizado que permite multiplex se rotulagem de amostras de tecido de carcinoma, com um painel de seis-marcador anticorpo multiplex compreendendo PD-L1, PD-1, CD68, CD8, Ki-67 e citoqueratinas AE1/AE3 com 4, 6-diamidino-2-phenylindole como um corante de contraste nuclear da célula. O protocolo de painel multiplex é otimizado em um corante IHC automatizado para um tempo de coloração que é mais curta que a do protocolo manual e pode ser diretamente aplicado e adaptado por qualquer investigador do laboratório de estudos imuno-oncologia em amostras de tecido humanos FFPE. Também descritos são vários controles e ferramentas, incluindo um método de gota-controle para controle de qualidade fino de um novo painel se multiplex, que são úteis para a otimização e validação da técnica.

Introdução

Immunoprofiling análise de amostras de tecido de tumor FFPE tornou-se um componente essencial de estudos imuno-oncologia, particularmente pela descoberta e validação de novos biomarcadores preditivos para imunoterapia no contexto dos ensaios clínicos^{1 ,2}. IHC cromogênico, usando chromogens químicas tais como diaminobenzidina, continua a ser a técnica padrão no diagnóstica patologia para o immunolabeling de biópsia de tecido³. IHC padrão também pode ser usado para immunoprofiling de tecido de câncer, incluindo a quantificação de subpopulações de linfócitos tumor-associado e a avaliação dos níveis de expressão de pontos de verificação imunes como ligante de morte celular programada 1 (PD-L1)^{4 ,5}. IHC padrão é limitada, no entanto, em que apenas um antígeno pode ser rotulado por seção de tecido. Immunoprofiling estudos normalmente requer a análise da expressão combinada de vários marcadores, o uso do IHC padrão exigiria a coloração das várias secções de tecido, cada uma manchada com um marcador único e, portanto, seria substancialmente limitado para a análise de amostras de tecido pequenas tais como biopsias de agulha. Métodos padrão de IHC também são limitados para a avaliação de marcadores que são coexpressed por populações de diversas células, como é comum com marcadores de ponto de verificação imune como PD-L1, que é expressa pelo tumor-associado de macrófagos e células cancerosas. Essa limitação tem sido relatada em, por exemplo, o uso do padrão monoplex IHC por patologistas para análise quantitativa de um marcador IHC expressado pela célula diversos tipos⁶. O desenvolvimento de técnicas IHC cromogênico multiplex empregando diversas chromogens coloridas sobre o mesmo tecido seção representa um avanço sobre o método padrão de IHC monoplex,⁷ embora permaneçam limitados pelo immunolabeling de poucos marcadores e também apresentar um desafio técnico importante para a avaliação adequada dos marcadores expressado nos compartimentos subcellular mesmos das mesmas populações de células.

Os detalhes acima mencionados sobre a disponibilidade de tecido de amostras clínicas, bem como as limitações das técnicas IHC cromogênica multiplex, deram origem à necessidade de desenvolver métodos aperfeiçoados de multiplex imuno-Oncologia estudos baseados em etiquetando fluorescente combinado com sistemas que podem efetivamente separar os sinais de vários fluorophores mesmo slide de imagens. Uma tal técnica é baseada na amplificação do sinal de tyramide (TSA) combinada com imagens multiespectrais de microscopia para cor eficiente separação⁸. Um kit comercialmente disponível com base em TSA emprega fluorophores otimizado para geração de imagens multiespectrais⁸ (ver Tabela de materiais). Uma vantagem importante deste sistema é a sua compatibilidade com os anticorpos primários sem rótulo mesmos que já tenham sido validados e otimizado para padrão cromogênico IHC^9,10,11. Isto permite não só a otimização mais rápida, mas também a flexibilidade nas modificações de otimização e painel incorporando novos destinos. Além disso, o método TSA multiplex imunofluorescência (mIF) pode ser otimizado para comercialmente disponíveis sistemas automatizados de corante IHC, permitindo para uma simples transferência de monoplex cromogênico IHC a mIF.

Aqui nós apresentamos um protocolo para um painel do Fumin para estudos imuno-Oncologia baseado em automatizada do Fumin TSA coloração e usa um scanner multi-espectral para a imagem latente. Este protocolo pode ser adaptado e modificado por qualquer usuário do laboratório com acesso à instrumentação descrita e reagentes. O protocolo inclui um painel de seis anticorpos primários para o immunoprofiling de carcinomas: PD-L1, PD-1, CD68 (como um marcador de pan-macrófago), CD8 (células T citotóxicas), Ki-67 e AE1/AE3 (pancitoqueratina, usado como um marcador epitelial para a identificação de células de carcinoma). Um estudo recente descreve a otimização de um protocolo de mIF TSA manual usando IHC cromogênico como um padrão de referência para validar os cinemas coloração¹². O método atualizado aqui apresentado foi desenvolvido usando um kit TSA comercialmente disponível, sete cores otimizado em um corante automatizado, drasticamente, encurtando o tempo coloração de 3 – 5 dias para 14 h, melhorando também a consistência da coloração. Além do protocolo principal detalhado apresentado aqui, uma seção de Materiais complementares inclui o método de "gota-control", um processo de controle de qualidade adicional para avaliar um novo painel de mIF, bem como notas técnicas de otimização, solução de problemas e desenvolvimento de novos painéis multiplex para ajudar o usuário de laboratório para configurar e otimizar o método TSA do Fumin para painéis personalizados do Fumin.

Protocolo

Nota: O protocolo aqui apresentado descreve como executar o immunoprofiling de um painel de mIF usando TSA para seis anticorpos (CD68, ki67, PD-L1, PD-1, CD8 e AE1/AE3) em um corante automatizado (ver Tabela de materiais). O protocolo também descreve como executar os controles de gota para um controle de qualidade de um novo painel de mIF (ver Materiais suplementares). Neste protocolo, a coloração é realizada com oito slides FFPE imaculados da amígdala humana (controle positivo) e oito slides imaculados de adenocarcinoma do pulmão humano. O primeiro slide é usado para multiplex completo mancha com todos os seis marcadores, o segundo slide para o isotipo controle no qual não há anticorpos primários são utilizados e os restantes seis slides para os controles de gota (ver Materiais suplementares). Um controle adicional para tecido autofluorescência é altamente recomendado e devem sempre ser incluído em um multiplex estudar (ver Materiais suplementares). No entanto, os investigadores podem empregar outros tipos de tumor e controles de acordo com seus próprios objetivos do projeto. Laboratório os usuários sem experiência prévia com o método TSA do Fumin e técnicas multispectral scanner devem ler o guia de desenvolvimento de IHC Multiplex (disponível online em http://info.perkinelmer.com/2016-lp-Opalassaydevelopmentguide-lp). Embora este guia descreve um protocolo manual, ele também fornece uma boa introdução para o Fumin método de coloração. Todas as secções de tecido empregadas no presente protocolo foram anonimizadas e aprovadas de acordo com a declaração de Helsinque.

1. amostras

1. Seleccionar uma amostra de amígdala humana FFPE contendo hiperplasia linfoide para ser usado como um controle positivo e uma amostra de adenocarcinoma de pulmão humano FFPE conhecido por ser o PD-L1 positivo. Revise os slides hematoxilina e eosina (H & E) dos blocos de câncer de pulmão selecionado para confirmar a presença de um tumor. É importante evitar tumores com abundantes áreas de necrose, como isso pode aumentar a coloração de fundo específico.
   Nota: Para essa otimização, evitar o uso de blocos de parafina que foram armazenados por 10 anos ou mais e o tecido com uma aparência seca no bloco de parafina (consulte com um técnico de histologia).
2. Usando um micrótomo, corte 10 seções de série consecutivas de cada bloco, 4 µm de espessura. Monte as secções em placa de vidro carregada positivamente usada para IHC, uma seção por slide.
   Nota: Seções devem ser montadas perfeitamente plana, sem rugas, como as rugas podem gerar artefatos de coloração. Número de slides das seções seriais de 1 a 10.
3. Prepare um novo slide H & E, na primeira seção. Rever o slide H & E, com a ajuda de uma patologista para confirmar a presença de tumor de tecido ou pulmão de tonsila restantes no bloco.
   Nota: Este slide H & E pode ajudar, mais tarde, com a seleção das regiões de interesse para análise multiespectral e fenotipagem.
4. Loja imaculadas seções em uma caixa de plástico slide a 4 ° C por até três meses.

2. criação de uma nova CIM programa de coloração em um Stainer automatizada: registo dos reagentes

Nota: Os reagentes devem ser adicionados à lista de reagente no software automatizado corante antes eles estão disponíveis para uso em protocolos. Consulte a Tabela de materiais , para obter informações sobre o corante automatizado modelo e versão do software.

1. Clique na guia reagentes dentro do software automatizado de corante. Clique em Adicionar para designar um novo reagente. Digite o nome (por exemplo, "520 TSA reagente") e o nome abreviado (por exemplo, "520 TSA"), observando que há um máximo de oito caracteres. Selecionar auxiliares de menu drop-down e definir o fornecedor. Não altere Duplos/mancha de Single/Sequential DS. Defina o padrão de coloração de protocolo para Protocolo F. Defina o protocolo HIER padrão para ER1 20.
2. Salve o novo reagente e repita a etapa 2.1 para todos os reagentes listados na tabela 1.

3. automatizado Stainer: Registo dos recipientes

1. Escreva o nome do reagente a ser usado ao lado de cada recipiente. Digitalize o código de barras do lado. Na janela pop-up, selecione o reagente correto na lista. Selecione uma data de expiração e salvar.
2. Repita o procedimento na etapa 3.1 para todos os reagentes listado na tabela 1.
3. Registre o Kit de investigação aberta. Ambos os códigos de barras no lado do kit de varredura e siga as instruções na tela. Nomeie o kit "Multiplex pesquisa Kit 1." Registrar o 1 x tris (hidroximetil) aminometano (Tris)-tampão salino como parte deste kit (tabela 1).

4. automatizado Stainer: Criação de um programa de protocolo do Fumin

1. O protocolo de base multiplex é pré-carregado com o nome Opala 7 Multiplex na nova mácula automatizado (Veja o modelo e versão do software na Tabela de materiais). Localize o protocolo pela filtragem para "tudo" em vez de "preferido" na tela de protocolo. Se o protocolo de base não estiver presente, em seguida, atualize o software automatizado corante com assistência do fabricante.
2. Todas as modificações devem ser conduzidas em cópias do protocolo original. Antes de fazer alterações, guardar o original e criar uma cópia clicando na guia protocolos , botão direito do mouse o protocolo Opala 7 Multiplex e selecionando copiar.
3. Altere o nome para protocolo Multiplex 7 1 na nova janela e selecione a guia associada com o dispositivo correto (modelo de piso ou bancada). Coincidir com o protocolo em Suplementar tabela S1. Clique em Adicionar o reagente para adicionar uma etapa de inibição de peroxidase de 10 min (não faz parte do protocolo padrão) e selecione o inibidor de peroxidase como o reagente.
4. Confirme que as etapas de bloqueio utilizam um tampão de bloqueio de PKI. Certifique-se de que cada anticorpo primário refere-se o reagente adequado, que passos de anticorpo secundário utilizam um polímero HRP, e aquele espectral ′ 4, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) fornecido com o kit de automação multiespectral é utilizada. Confirme todas as opções, verificando o reagente que foi designado para cada etapa respectiva no menu drop-down na tela de protocolo.

5. automatizado Stainer: Adição de controles de gota e protocolo do isotipo controle

1. Copiar o nome protocolo Multiplex 7 1 e mude para 7 protocolo Multiplex 1 CD68 DROP. Mudar o reagente CD68 anticorpo IgG de Rato e salvar o protocolo.
2. Crie mais seis novos protocolos, um para cada controle de queda e um para o controle completo do isotipo (alterando todos os anticorpos para os apropriado isotipos) da mesma maneira.

6. Stainer automatizado: Protocolo de preparação de Slide

1. Copie o protocolo prestaining * Asse e Dewax e renomear este protocolo Asse multiespectrais e Dewax 2 h.
2. Ajuste o protocolo para coincidir com os reagentes mostrados na tabela 2. Slides de Asse por 2 h a 60 ° C. Dewax por 30 s a 72 ° C.

7. automatizado Stainer: Preparação dos reagentes

1. Prepare um kit de deteção de pesquisa. Um reagente deve ser permanentemente associado com este kit, para preencher o recipiente aberto 30 mL marcado para 1 x salino Tris (TBS), com 1 x TBS e localizar esta na posição 1 (mais afastado o identificador) do kit de deteção de pesquisa designado Multiplex Kit de pesquisa 1. este reagente será permanentemente associado com este kit de investigação e não deve mudar de posição para uso futuro.
2. Rotule dois recipientes abertos 30ml Bloco multiespectrais e Multiespectral secundário. Encha o recipiente de Bloco multiespectrais com 30 mL de buffer de bloqueio/anticorpo diluente do kit de coloração multiespectral. Encha o recipiente Multiespectral secundário com 30 mL de polímero de mouse e rabbit anticorpo secundário do kit de coloração multiespectral.
3. Prepare dez recipientes abertos de 7 mL. O volume necessário em microlitros é 600 + (150 x [número de slides]). Cada anticorpo será aplicado aos 12 slides neste caso (tonsila seis e seis do pulmão). A rotulagem e volumes para todos os recipientes são indicados na tabela 3.
4. Para cada tubo de anticorpo, primeiro adicione o anticorpo diluente, em seguida, o anticorpo primário concentrado nos volumes indicados na tabela 3. Misture pipetando suave.
5. Prepare um recipiente aberto de 7 mL para DAPI, usando quatro gotas de concentrado DAPI por mililitro de água bidestilada; um total de 16 vai ser manchado com DAPI (600 + [150 x 16] = 3.000 µ l). Adicione 3 mL de água bidestilada, mais 12 gotas de DAPI espectral no recipiente. Prepare o DAPI fresco para cada corrida.
6. Prepare um recipiente aberto de 7 mL para inibidor de peroxidase. Todos os 16 slides serão tratados com inibidor de peroxidase (600 + [150 x 16] = 3.000 µ l). Adicione 3 mL de bloco de peroxidase no recipiente.
7. Antes de preparar o trabalho de concentrações dos fluors, resuspenda todos os fluors liofilizados adicionando 75 µ l de Dimetilsulfóxido para cada tubo de fluor fornecido pelo fabricante. Misture por pipetagem. Este é o estoque de fluor TSA. Loja a 4 ° C.
8. Prepare-se seis recipientes de titulação, um para cada fluor. O volume necessário em microlitros é 350 + (150 x [número de slides]). Cada fluor será aplicado aos 16 slides neste caso (tonsila oito e oito do pulmão). A rotulagem e volumes para todos os recipientes são indicados na tabela 4.
9. Quando todos os reagentes foram registrados e preparados, coloque cada recipiente em qualquer lugar em uma cremalheira e carregar todos os reagentes para o corante automatizado. A sonda vai confirmar o volume de cada reagente.

8. automatizado Stainer: Amostra Setup e coloração multiespectrais

1. No software automatizado stainer, clique em configuração de Slide no topo da tela. Clique em Add estudo. Preencha a janela pop-up com o estudo ID, nome de estudo e comentários.
   1. Selecione o nome do pesquisador realizar a coloração fugir de lista drop-down. Embora o volume de distribuição em 150 µ l. Selecione multiespectrais Dewax para protocolo de preparação. Clique Okey e Adicionar slide. Em comentários, digite "Multiplex 1 pulmão 123ABC." Preencha os seguintes campos, conforme indicado: Tecido tipo = tecido de teste; Volume de distribuição = 150 µ l; Modo de coloração = Single, rotina; Marcador = negativo; Mancha = digite "7 Multiplex protocolo 1"; Preparação = Asse multiespectral, Dewax 2 h; HIER = HIER 20 min com ER1.
2. Clique em Adicionar slide e alterar os comentários e protocolo para adicionar os slides de controle de queda e slide de isotipo controle. Quando todos os slides foram adicionados ao estudo, feche a janela Adicionar slide e imprimir etiquetas. Aplique os rótulos para a área de rótulo adequado em cada slide.
3. Carregar os slides em racks, aplicam-se as telhas de cobertura na orientação correta, inserir as prateleiras do corante automatizado e abaixar as bandejas. O dispositivo irá digitalizar os rótulos de slide.
4. Quando todos os slides e reagentes foram verificados e medidos. O botão de arranque (►) se tornará ativo. Se a autostainer detecta erros, tais como volume de reagente insuficiente, aparecerá um símbolo de aviso amarelo por bandeja do afetado. Se ocorrer um erro, clique o símbolo de cuidado e corrigir o erro.
5. Iniciar imediatamente a coloração ou agendar um início atrasado. O protocolo é aproximadamente 14 h de duração. Nota: Certifique-se de que protocolo serão concluída em um tempo quando os slides podem ser removidos imediatamente como exess lavagem poderia impactar os resultados de coloração.

9. composto dos Slides multiespectrais

1. Remover as lâminas do corante automatizado e armazená-los em um rack submergido em 1 x TBS.
2. Monte as amostras com lamelas de n º 1,5 e 15 µ l dos meios de comunicação de montagem (ver Tabela de materiais). Remova quaisquer bolhas pressionando suavemente no sentido do lamela com uma ponta da pipeta.
3. Permitir que os slides curar durante a noite em temperatura ambiente na bancada do laboratório. Slides não polimerizadas podem ser verificados imediatamente com manuseamento cuidadoso.

10. multispectral Scanner

1. Ligue o scanner multiespectral e seu computador (consulte a Tabela de materiais para informação de modelo e software). Inicie o software de controle de microscópio. Abra a porta da frente do multispectral scanner pressionando o botão sensível ao toque na frente do dispositivo. Cada transportadora com mola no scanner possua quatro slides. Carregar todos os slides em transportadoras e gravar a ordem antes de carregar as transportadoras no dispositivo.
2. Selecione o Protocolo editar e clique em novo...; em seguida, crie o nome do protocolo 1 Multiplex do painel e controles Drop. Criar o nome de estudo Desenvolvimento Multiplex do painel, clique em Criar protocoloe digite Visão geral de varredura filtro DAPI; em seguida, selecione Todo Slide Scan e Pixel resolução 0,50 µm (20 X). Todos os filtros e bandas devem ser representadas. Se não, clique em Editar filtros e bandas, selecione todos os cinco filtros (DAPI, FITC, CY3, Texas Red e CY5) e clique em Editar as exposições.
3. Carrega a transportadora selecionando a transportadora com multiplex completo de adenocarcinoma do pulmão. Selecione o slide correto usando a interface gráfica do usuário. Concentre-se no tecido manualmente ou usando o autofocus. Navegue em qualquer área com coloração de DAPI aceitável e clique em Autoexpor para definir a exposição em milissegundos (0 – 2.000 ms).
4. Repita o mesmo procedimento para todos os cinco conjuntos de filtro nas colunas a digitalizar toda e região de MSI. Certifique-se navegar até uma área com coloração aceitável e recentrar o microscópio antes de ajustar a exposição para cada nível de filtro e ampliação. Autoexposição para todos os cinco filtros em uma varredura geral de 20x e 20 x regiões multispectral da (MSI) de imagens multiespectrais. Selecione uma resolução de pixel de 0,50 µm (x 20). Salvar o protocolo e clique em voltar para retornar à tela inicial do software Vectra; em seguida, clique em Digitalizar Slides.
5. Abra a interface para cada slide e definir a tarefa para fazer a varredura. Conjunto de estudo para Desenvolvimento de painel Multiplex, definir o protocolo para Multiplex 1 painel e controles Drope definir ID de Slide para Multiplex pulmão ABC123, Multiplex CD68 Drop pulmão ABC123, etc . Quando todos os slides foram chamados e tarefas são definidas, clique em Scan. Multispectral scanner automatizado irá realizar varreduras cheio-slide de todos os slides usando todos os filtros de cinco.

11. multispectral Scanner: Imagens multiespectrais

1. Uma vez que os exames terminarem, abra o software QPTIFF ("Phenochart") e clique em Load deslize no canto superior esquerdo. Isto irá abrir um QPTIFF, que é um scan de todo-slide 5-filtro. Cada camada contém informações de mais de um fluor, então a utilidade é limitada, mas a estrutura do tecido e testes padrões da expressão ampla são aparentes e podem ser usados para selecionar regiões para MSI.
2. Navegue para e abra o slide correto no estudo usando a árvore de soltar-para baixo à esquerda. Logar (superior direito), com as iniciais do usuário.
3. Selecione cinco regiões para MSI usando a ferramenta de carimbo na parte superior da tela. Consulte uma patologista, se disponível. Em selecionar para, selecione aquisição; em tamanho em campos, selecione 1 x 1; e sob restrição de campo, selecione 0,5 µm (x 20). Com base na citoqueratinas (CK) coloração (principalmente em Cy5), selecione várias regiões com tumor (CK +) e estroma (CK-) para ser fotografada a partir da digitalização global. Repita este procedimento para cada slide.
4. Uma vez que todos os MSIs são selecionados, feche o software Phenochart e retornar para o software do Vectra . Alterar a tarefa de varredura para MSI para cada slide e, em seguida, clique em digitalizar novamente para realizar a coleta de MSI.

12. espectral de desagregação

Nota: A etapa de misturar espectral é necessária para separação de canais e análise de imagens dos slides. Antes de desagregação espectral é executada no software inForm, a biblioteca espectral deve ser construída usando slides de adenocarcinoma do pulmão manchados com cada fluor em paz e com DAPI sozinhos. Este procedimento também é descrito no referido Multiplex IHC ensaio desenvolvimento guia.

1. Quando a aquisição de MSI estiver concluída, use o software de ("informar") misturar espectral para abrir arquivos na pasta MSI . Acabam com esses arquivos na extensão de tipo de arquivo de .im3.
2. Em formato de imagem, selecione Multispectral; em formato de amostra, selecione fluorescência; e em fonte biblioteca espectral, selecione InForm.
3. Para selecionar o fluors, selecionar e carregar todos os seis fluors e DAPI da biblioteca construída com os slides de biblioteca de adenocarcinoma de pulmão. Clique em Preparar todos (inferior esquerdo). Software de misturar espectral executará desagregação espectral em todas as imagens abertas, usando os perfis espectrais fornecidos.
4. Uma patologista, para avaliar o padrão de coloração contra manchas único cromogênico do mesmo destino em slides sequenciais do mesmo tecido.

13. avaliação da intensidade de fluorescência e atenuação de sinal

Nota: A ferramenta de contagem, que aparece como uma seta com uma pequena caixa marrom, é a ferramenta mais importante para a otimização de multiplex e deve ser usada com frequência (ver Materiais suplementares). Usando a ferramenta de contagem no software misturar espectral, avalie a relação sinal-ruído, que, no mínimo, deverá exceder 10:1 (ver Materiais complementares para solução de problemas e para a avaliação de um cinema de coloração com os controles de gota).

1. 13.1. com uma imagem aberta no software misturar espectral, envolver-se a ferramenta de contagem e levantamento de imagens para avaliar a intensidade de fluorescência de cada canal. A intensidade de alvo no tecido pulmonar é entre 10 e 20 contagens normalizadas. A ferramenta de contagens normalizado é mostrada na Figura 1.
2. Exclua slides com contagens de sinal máximo de contagens de área menor que 10 ou normal sinal de menos de cinco anos para qualquer marcador para que autofluorescência e coloração fora do alvo não competem com o sinal de fé.
3. Excluir slides com máximo conta maior que 30 para qualquer canal evitar sangramento espectral ou desagregação espectral ineficiente.
4. Endereço de altas ou baixas contagens normalizadas, ajustando a concentração de TSA.

14. análise de imagem multiespectrais

1. Abrir um ou mais MSI no software de misturar espectral e apenas selecionados fluors para desagregação que são representados pelo menos uma imagem aberta. Clique em Preparar todos para atrás de todas as imagens de cor aberto atualmente para produzir imagens espectralmente misturadas.
2. Selecione a ferramenta de contagem para o levantamento de contagens em cada imagem pairando sobre a área (s) de interesse.
3. Selecione o ícone de olho para abrir o editor de exibição. Selecione e ajuste a intensidade de exposição de cada canal independente.
4. Selecione Configurar para abrir a segmentação de tecido, segmentação de célula, fenotipagem e módulos de pontuação. Essas ferramentas são necessárias para a validação objectiva do multiplex coloração contra manchas única cromogênica e podem ser usadas para gerar dados quantitativos phenoptic (Figura S1).
5. Use o guia de exportação para salvar em tons de cinza, fluorescente, pathview-estilo descompactado TIFF arquivos e dados dos módulos de análise de phenoptic para nova análise, arquivamento e apresentações (Figura S1).

Resultados

O protocolo descrito aqui fornecerá resultados como as mostradas na Figura 2. Começar com uma avaliação da coloração no controle da amígdala, começando com o epitélio de superfície de células escamosas. A histologia da amostra da amígdala pode ser revista com uma patologista, usando o slide H & E, como uma referência. Se cromogênico seções IHC são realizadas com os mesmos marcadores do mesmo bloco de tecido, em seguida, estes podem ser usados...

Discussão

A revolução de imunoterapia do câncer em curso é o romance de abertura e prometendo opções terapêuticas para pacientes de câncer¹³. Avanços no campo da imuno-Oncologia exigirá maior conhecimento do microambiente do tumor inflamatório, não só para compreender a biologia dos mecanismos imunológicos envolvidos na carcinogênese, mas também para encontrar biomarcadores preditivos de novo tratamentos baseados em imunoterapia^1,2. ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
"InForm 2.4.2" Software for Spectral Unmixing and Image Analysis	PerkinElmer	CLS151066	Called "spectral unmixing software" in text
"Phenochart 1.0.9" QPTIFF Software for Selection of MSI and Overall Slide Scan Viewing	PerkinElmer	CLS151067	Called "QPTIFF software" in text
#1.5 Coverslips	Sigma Aldrich	2975246
200 Proof Ethanol	Koptec	V1001
20x Tris-Buffered Saline	VWR	J640-4L
Antibody Diluent	DAKO	S2203
Anti-CD68 Mouse Monoclonal	DAKO	M087601-2	Clone PG-M1
Anti-CD8 Rabbit Monoclonal	Ventana	M5392	Clone SP239
Anti-CK Mouse Monoclonal	DAKO	M351501-2	Clone AE1/AE3
Anti-ki67 Mouse Monoclonal	DAKO	M724001-2	Clone MIB-1
Anti-PD-1 Rabbit Monoclonal	Cell Signaling	#86163	Clone D4W2J
Anti-PD-L1 Rabbit Monoclonal	Ventana	790-4905	Clone SP263
Bond Dewax Solution	Leica	AR9222	Called "dewax solution" in text
Bond Epitope Retrieval Solution 1	Leica	AR9961	Called "ER1" in text
Bond Epitope Retrieval Solution 2	Leica	AR9640	Called "ER2" in text
Bond Open Containers, 30 mL	Leica	OP309700	Called "30 mL open containers" in text
Bond Open Containers, 7 mL	Leica	OP79193	Called "7 mL open containers" in text
Bond Polymer Refine Detection	Leica	DS9800	Called "chromogenic detection kit" in text
Bond Research Detection Kit	Leica	DS9455	Called "research detection kit" in text
Bond Titration Kit	Leica	OPT9049	Called "titration kit" in text
Bond Universal Covertile Novocastra	Leica	S21.2001	Called "covertiles" in text
Bond Wash Solution 10X Concentrate	Leica	AR9590	Called "10x wash solution" in text
BondRX Autostainer	Leica		Called "automated stainer" in text
BondRX Software Version 5.2.1.204	Leica		Called "automated stainer software" in text
Opal 7-Color Automation IHC Kit	PerkinElmer	NEL801001KT	Called "multispectral staining kit" in text
Peroxidase Block	Leica	RE7101
ProLong Diamond Antifade Mountant	Thermo	P36965	Called "slide mountant" in text
Starfrost Slides	Fisher	15-183-51
Vectra Polaris Multispectral Microscope with "Vectra 3.0.5" Software for Multispectral Microscope Control	PerkinElmer	CLS143455	Called "microscope control software" in text