تثبيط البروتين إيندوسيبلي وعكسها المهيمنة سالب (DN)

Shikha Tarang; Umesh Pyakurel; Songila M.S.R. Doi; Michael D. Weston; Sonia M. Rocha-Sanchez

doi:10.3791/58419

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

Summary

نقدم هنا بروتوكولا لتطوير نظام إيندوسيبلي السلبية السائدة، التي أي بروتين يمكن يكون إفراجاً مشروطاً معطل عكسية overexpressing نسخة متحولة السلبية المهيمنة.

Abstract

تثبيط البروتين (DN) سالب المهيمن هو وسيلة قوية التعامل مع وظيفة البروتين ويوفر مزايا عديدة أكثر من غيرها من النهج القائم على الجينوم. على سبيل المثال، على الرغم من أن تشيميريك و لوكسب Cre استراتيجيات الاستهداف وقد استخدمت على نطاق واسع، القيود المتأصلة من هذه الاستراتيجيات (أي نشاط المروج راشح، فسيفساء Cre التعبير، إلخ) قيدت إلى حد كبير على التطبيق. وعلاوة على ذلك، حذف كامل للعديد من الجينات الذاتية شأن الفتاكة، مما يجعل من المستحيل على دراسة وظيفة الجينات في الحياة بعد الولادة. ولمعالجة هذه التحديات، تغييرات كبيرة في وضع بروتوكول هندسة الوراثية مبكرة ومقترنا حوزتي الليزوزومية نسخة (المعدلة وراثيا) قصيرة من الجينات Rb1 بروكاثيبسين ب (CB)، لإنشاء نموذج ماوس DN من Rb1 (كبرب). بسبب وجود حوزتي الليزوزومية، يتم توجيه البروتين الانصهار CB-RB1 كامل وبه مجمع المتفاعلة للتدهور بوساطة بروتوزوم. وعلاوة على ذلك، يتيح وجود عنصر محفز (رتا) التتراسيكلين في البناء المعدلة وراثيا لائحة إيندوسيبلي وعكسها للبروتين RB1. وجود مروج روزا-المساعدة النقدية في كل مكان في طراز الماوس كبرب يجعلها أداة مفيدة القيام بالاستئصال الجيني Rb1 عابرة وعكسها وتزويد الباحثين موارد لفهم نشاطها في تقريبا أي نوع من الخلايا حيث يتم التعبير عن RB1.

Introduction

معظم النهج الرامية إلى أبلاتيونس الجينات والبروتين تعتمد على العمليات الدائمة، التي تؤدي عموما إلى القضاء التام على أو اقتطاع الجينات، وتسلسل الحمض النووي الريبي أو البروتين من الاهتمام (POI). والهدف العام لهذا الأسلوب مهندس بروتين المؤتلف بإلغاء وظيفة البروتين الذاتية، والبرية من نوع. قمنا بإعادة النظر وتجديده استراتيجية بديلة¹^،²، والذي يسمح للاجتثاث المؤقتة البوي عن طريق تثبيط DN. هذا الأسلوب يعمل لكل من مولتيميريك والببتيدات أحادي ولكن هو الأنسب للبروتينات التي تعمل في جمعية مولتيميريك.

الأسلوب الذي يتكون من الصمامات حوزتي الليزوزومية CB لوحدة فرعية من مولتيميريك البوي (CB الانصهار المعقدة). الانصهار CB الناتجة معقدة يمكن أن تتفاعل مع وبروتيوليتيكالي هضم البروتين الذاتية أو تحويل المجمع بأكمله البوي CB إلى يحلول أن يكون المتدهورة³. وعلاوة على ذلك، مزيج من الانصهار CB المعقدة مع الطابع إيندوسيبلي لنظام التنشيط النسخي تسيطر عليها التتراسيكلين (تيتو) يسمح لتعبير إيندوسيبلي والتي تسيطر عليها من التحوير في أزياء عكسها². على الرغم من أن مفيد في العديد من الحالات، يمكن أن يؤدي الحذف الكامل للجينات أو البروتينات المجراة في الفتك⁴^،^،من⁵⁶. وبالمثل، الحذف الخاصة بالانسجة، والشرطي لبعض الجينات أو البروتينات باستخدام نظام لوكس Cre/قد لا تكون واضحة، كما أنه، في نهاية المطاف، سيؤدي إلى خسارة دائمة للعناصر الجينية الحاسمة⁷. ولذلك، اعتماداً على الجينات أو البوي، أيا من هذه النهج سيكون من فعالية في تقدم نموذجا مفيداً للدراسات اللاحقة، لا سيما الجينات أو البروتينات الدراسات الفنية في الفئران بعد الولادة والكبار أواخر.

للالتفاف على المشاكل المرتبطة بهذه النهج وتقديم إثبات لمبدأ فعالية الطريقة المقترحة، اخترنا لاختبار الأسلوب الذي قدمه هنا توليد نسخة DN شرطي من البروتين الشبكية 1 (RB1). وكانت العديد من الخيارات المقترحة⁸^،^،من⁹¹⁰ إلى إلغاء وظيفة RB1 الذاتية؛ لكن كل منهم تواجه بعض القيود نفسها المذكورة أعلاه: حذف الخط الدائم RB1 شأن الفتاكة، والحذف الشرطي RB1 تمشيا مع دورها القامع الورم، دائم يؤدي إلى مجموعة متنوعة من الأورام¹¹. على الرغم من أن إصدار DN من RB1 لا يبدو أن يحدث بطبيعة الحال، أفضل بديل للاستراتيجيات المتاحة حاليا ينبغي أن تسمح المنظمة التي تسيطر عليها وقتيا من RB1 الذاتية وتوفير إليه بديلة في نهاية المطاف إعادة لها الدالة. ووصفت أساسا لتركيبة من هذا القبيل منذ أكثر من عقدين من الزمان¹. ومع ذلك، بسبب القيود التكنولوجية، أنها تفتقر إلى إليه لمراقبة التحوير التنشيط واستجابة، وخصوصية النسيج. وهذه الدراسة هي الأول من الجمع بين أناقة الدوكسي (دوكس)-يعتمد النظام النسخي مع مقولة أساسية المعدلة وراثيا هندسيا من بروتينات سي بي و Rb1 البروتياز الليزوزومية. نموذج كبرب الناتجة على الماوس يسمح RB1 دوكس بوساطة مؤقتاً ينظم البند². وميزة استخدام هذا نهج القائم على البروتين لدراسة وظيفة الجينات أن يتم اعتماده للجينات أي اهتمام، مع الحد الأدنى من المعلومات عن نشاطه.

الاستراتيجية المقترحة للتحوير DN يوفر مزايا عديدة أكثر من النهج التقليدي. أولاً، يؤدي تثبيط البروتين DN إلى إلا الاستئصال الجزئي في نشاط البروتين، وبالتالي الحفاظ على تعبير ذاتية متبقية. هذه نتيجة مرغوب فيه للغاية في الحالات التي يؤدي فيها القضاء تام على نشاط البروتين إلى الفتك الجنينية، تحد إلى حد كبير أي تحقيق لدراسة وظيفة الجينات في ماوس حية. ثانيا، وجود نظام تيتو تمكين التنشيط التحوير إلا بوجود المضادات الحيوية، مما يسمح لعنصر الكفاءة و عكسها على نشاط التحوير. وهكذا، بالتوقف الصادات، يمكن إلغاء تنشيط النظام المحورة وراثيا، وتعبير RB1 عادي مرة أخرى في المكان. ثالثا، يمكن أن تختلف خصوصية التعبير التحوير اعتماداً على المروج للاختيار. في حين أننا اخترنا المروج روزا-المساعدة النقدية في كل مكان للإثبات للمبدأ، وضع التحوير تحت مروج الأنسجة على حدة من المرجح أن تقييد التعبير التحوير غير المرغوب فيها وتسهيل الدراسات المتعلقة بتطبيق هذا التحوير العلاجية منهجية.

Protocol

جيل من الماوس كبرب المعدلة وراثيا ورعاية الحيوان والتجارب المرتبطة بالدراسة كانت يقوم بمبادئها التوجيهية ووافقت عليه "جامعة كريتون، الرعاية المؤسسية على الحيوان" واستخدام اللجنة (إياكوك).

1-المعدلة وراثيا CB-حركة₆-بناء Rb1

ملاحظة: تم استنساخ كبرب إلى ناقل pTet_Splice في عملية متعددة الخطوات (الشكل 1A و 1B).

إجراء الاستنساخ المرحلة الأولى في pCS2 + ناقلات CB-Myc6.
1. لإنشاء بنية التحوير كبرب، تضخيم جزء طوله 1583 bp كدنا Rb1 (528 الأحماض الأمينية المقابلة لمنطقة الأحماض الأمينية 369 – 896) من البروتين RB1 التمهيدي التالية باستخدام مجموعة: استخدام اكوري +1243 م عو، جججاتكا تااتكاجكاجتجاتكاككتك، واستخدام إكسباي + اكورف +2826 م عص، كككتكتاجاتاتكتاتتجاكتكتككتججاجاتجتتاكتكك.
2. استنساخ جزء التعليمات التي تم إنشاؤها (1546 bp) بين المواقع قيد EcoR1 و إكسباي من pCS2 + ناقلات CB Myc6 كما هو موضح سابقا¹^،¹².
  ملاحظة: بناء CB Myc6 1012-بي بي-لونغ (الأحماض الأمينية 337) تنصهر فيها بلغة Rb1 أسفرت عن وتين أحماض الأمينية حوالي 865 (كاتشين حوالي 108)، وأصغر قليلاً من البروتين RB1 الذاتية (كاتشين ~ 110) (الشكل 1 )، مع علامة₆ حركة سي بي ن تيرمينوس و Rb1 في ج-المحطة.
أداء سوبكلونينج المرحلة الثانية إلى ناقل بتيت-الوصلة.
1. لتضخيم الجزء فيوجن CB-RB-Myc6 وكسب التيت-المروج، تضخيم الكاسيت، تتألف من بناء القدرات-myc6-Rb1 باستخدام أجهزة الإشعال تحتوي على اكورف (إكسباي + اكورف + RB 2826R) ومواقع سالي : لسالي + وبناء القدرات، استخدام ككاجتكجاكاجأتجتجتجتككتجاتككتك.
2. سوبكلون يفتت ولدت (2567 bp) إلى ناقل pTet-الوصلة، بين مواقع التقييد سالي و اكورف ، في مثل هذه طريقة التحوير تيتو-DN-CB-myc6-Rb1 كاملة، بما في ذلك إنترون SV40 وبوليا إشارة، يمكن أن تكون معزولة عن طريق هضم واحد مع نوتي (الشكل 1ب).
  ملاحظة: استخدمت الجزء نوتي لتوليد الممولين المحورة وراثيا.

2-وفي المختبر التجارب من التحوير تيتو-DN-CB-myc6-Rb1

دوكس-التنظيم: خط الخلية NIH3T3
ملاحظة: ما لم ينص على خلاف ذلك، وقد عدلت كافة وحدات التخزين للوحة 6-جيدا.
1. تنمو خلايا NIH3T3 عقب المواصفات الخاصة بالمورد، باستخدام وسائط الثقافة الموصى بها الخلية التي تحتوي على 10% مصل بقرى الجنين عند 37 درجة مئوية مع 10% CO₂.
2. كوترانسفيكت الخلايا مع الوصلة بطة وناقلات بكمف-Tet3G (من الخطوة 1) 24 h. اتبع الخطوات المذكورة أدناه كوترانسفيكشن.
  1. مزيج من 2 – 4 ميليلتر من تعداء على أساس المادة الدهنية الكاشف/البئر و 1 مل تعديل النسر المتوسطة (دميم غير كاملة (بدون المصل) دولبيكو) لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. لوحة 12 أو 24 جيدا، استخدام 250 أو 500 ميليلتر من ثقافة وسائل الإعلام، على التوالي، وضبط مستوى الصوت كاشف تعداء تبعاً لذلك.
  2. إضافة 2-3 ميكروغرام من بلازميد الحمض النووي/بئر إلى تعداء الكاشف-دميم، واحتضان لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  3. إضافة مزيج يحتوي على الحمض النووي والكاشف تعداء في دميم لكل بئر. بعد 3 – 4 ح الحضانة، إضافة 1 مل وسائط كاملة (حيث أن وحدة التخزين النهائي 2 مل/جيد). تبقى مختبرين دوكس المخزون (1 ملغ/مل) وإضافة 2 ميليلتر في كل من الآبار (+ دوكس). احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية مع شركة 5%₂.
    ملاحظة: عينات مراقبة ينبغي أن تتكون من خلايا كوترانسفيكتيد لا تعامل مع دوكس (-دوكس)، فضلا عن الخلايا NIH3T3 ترانسفيكتيد فقط مع ناقل بكمف-Tet3G ترانساكتيفاتور، وتعامل مع دوكس لمدة 24 ساعة. بكمف-Tet3G، تركيزات من 0.1 – 1 ميكروغرام/مل دوكس ينبغي أن يكون كافياً لحمل التعبير التحوير.
اختبار إمكانية الرجوع للبناء باستخدام خط الخلية HEK293.
1. لاختبار إمكانية الرجوع للتحوير تيتو-DN-CB-myc6-Rb1 ، خلايا الثقافة HEK293 في الحد الأدنى الأساسية المتوسطة (اللور النسر) بعد المواصفات الخاصة بالمورد وكوترانسفيكت مع ناقلات الوصلة بطة وبكمف-Tet3G على 24 ساعة، كما هو موضح أعلاه (الخطوة 2.1.2).
2. للمنظمة التحوير، قم بإزالة الوسائط التي تحتوي على دوكس بعد 24 ساعة ويغسل خلايا 2 x x-3 مع الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) واحتضانها لهم في وسائل الإعلام الحرة دوكس 24 ساعة إضافية.
  ملاحظة: عند إزالة دوكس، ينبغي استئناف المنظمة التحوير والتعبير العادية من البروتين خلال تلك الفترة 24 ساعة.
تقييم الأداء الوظيفي لبناء تيتو-DN-CB-myc6-Rb1 في تعزيز انتشار الخلايا غير المجدولة، إجراء التحليلات الفنية استخدام خط خلية هيي-OC1، كما هو موضح أدناه.
1. الثقافة هيي-OC1 الخلايا في 10% دميم تحت متساهلة الظروف (33 درجة مئوية، مع 10% CO₂). للدراسات المتعلقة بالانتشار الخليوي، عد الخلايا باستخدام عداد خلايا، والخلايا هيي-OC1 لوحة 10,000 على لوحة 96-جيدا في حجم 200 ميليلتر. احتضان الخلايا بين عشية وضحاها.
2. اليوم التالي، كوترانسفيكشن عابرة من ناقلات الوصلة بطة وبكمف-Tet3G باستخدام كاشف تعداء على أساس المادة الدهنية أداء (انظر الخطوات 2.1.2). في بئر منفصلة، نفذ من جهة أخرى--ZsGreen1 تعداء at2-ميكروغرام استخدام الكاشف تعداء على أساس المادة الدهنية (الخطوات 2.1.2) لحساب معدل تعداء. استخدام غير transfected الخلايا كعناصر تحكم.
3. الكشف عن وجود ومضان أخضر تحت مجهر فلورية (الإثارة = 485 نانومتر، والانبعاثات = 530 نانومتر) transfected خلايا ح 24 بعد تعداء. تسجيل حضور أو غياب الفلورية الخضراء وحساب معدل تعداء كالعدد الإجمالي للتجارة والنقل-إيجابية الخلايا (transfected الخلايا) عبر الخلايا المسماة مع DAPI (مجموع الخلايا).
  ملاحظة: أننا تقدر بمعدل تعداء ~ 70%.
4. للحث على التعبير التحوير، 1 ميكروغرام/مل دوكس إضافة إلى مجموعة فرعية من transfected الخلايا أثناء استخدام مجموعة فرعية أخرى كعنصر تحكم (-دوكس). استخدام غير المعالجة هيي-OC1 الخلايا كعناصر تحكم إضافية.
5. لتقييم انتشار الخلايا، استخدام أدوات انتشار خلايا وفقا للبروتوكول الخاص بالشركة المصنعة.
  1. وباختصار، ح 48 بعد تعداء، إزالة مستنبت الخلية وإضافة 100 ميليلتر 1 × حل الصبغة الملزمة لكل بئر الصفيحة. احتضانها ح 1 في 37 درجة مئوية.
  2. وبعد ذلك قياس كثافة الأسفار لكل عينة باستخدام قارئ ميكروسكوبية الأسفار (الإثارة = 485 نانومتر، والانبعاثات = 530 نانومتر).
6. لتقييم انتشار الخلايا باستخدام إيمونوسيتوتشيميستري ولوحة الخلايا هيي-OC1 على تغطية زجاج في صفيحة 12-جيدا واحتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
  1. اليوم التالي، كوترانسفيكت مع الوصلة بطة و Tet3G بكمف وإجراء معاملة دوكس (+ دوكس). استخدام خلايا أونترانسفيكتيد كعناصر تحكم. عملية الخلايا هيي-OC1 لوسم كي-67.
  2. إصلاح الخلايا مع بارافورمالدهيد 4% (PFA) في برنامج تلفزيوني، درجة الحموضة 7.4، لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. تغسل الخلايا 3 x مع برنامج تلفزيوني المثلج واحتضان الخلايا الموجودة في المنظفات غير الأيونية 0.25% في برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقائق.
  3. تغسل الخلايا 3 x مرة أخرى، في برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق، وحظر استخدام مصل الدم 10% في دائرة هوميديفيد لح 1 في درجة حرارة الغرفة.
  4. احتضان الخلايا في 500 ميليلتر من جسم الأولية (تخفيف 1: 200) كي-67 ح 3 في درجة حرارة الغرفة أو بين ليلة وضحاها في 4 درجات مئوية.
  5. تغسل الخلايا 3 x لمدة 5 دقائق مع برنامج تلفزيوني. وبعد ذلك، احتضان الخلايا بجسم الثانوية ح 1 في درجة حرارة الغرفة في الظلام.
  6. إزالة الحل جسم الثانوية وتغسل الخلايا 3 x مع برنامج تلفزيوني لمدة كل 5 دقائق في الظلام.
  7. لتسمية فالويدين، احتضان خلايا هيي-OC1 في فالويدين 1: 200 لمدة 30 دقيقة. لتسمية في نويات الخلايا، احتضان الخلايا مع 5 ميكروغرام/مل DAPI لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    ملاحظة: ضمان أن المتقارن صبغ فالويدين يختلف عن المتقارن جسم الثانوية.

3-جيل/ROSA-CAG-rtTA كبرب⁺⁺(كبرب) الفئران المحورة وراثيا وفي فيفو اختبار النهج DN-كبرب

عند تأكيد دوكس التنظيم الفعال للتحوير تيتو-DN-CB-myc6-Rb1 ، تطهير الجزء نوتي وميكروينجيكت لهم في الماوس زيجوتيس، الذي نقل في وقت لاحق إلى الإناث الحوامل الزائفة.
ملاحظة: وأجريت هذه الإجراءات في جامعة نبراسكا (UNMC) مركز "الماوس الجينوم الهندسية الأساسية المرفق" الطبي.
وبعد التسليم، النمط الوراثي الجراء تمهيدي باستخدام مجموعة محددة إلى منطقة الانصهار CB-Rb1 : و كبرب، استخدم كتجتجكاتجاتكاجااتجتجكتج 3 5 '، ول آر كبرب، استخدم 3 5' جتاكتكتجكتاتاتجتجككاتاكاكك '.
ملاحظة: حجم المنتج بكر لاحظ على [اغروس] هلام هو 401 bp (60-بي بي سي بي المنطقة + 341-بي بي Rb1 المنطقة (الجدول 1). تم تحديد عشرة خطوط مؤسس المستقلة، استناداً إلى وجود التحوير تيتو-DN-CB-myc6-Rb1 . في خمس من هذه الخطوط، ورثت ذرية التحوير، التي أكدت انتقال الخط التحوير. واستخدمت أحد خطوط المعدلة وراثيا في نهاية المطاف على إنشاء والحفاظ على الخط وتوليد الحيوانات تيتو-DN-CB-myc6-Rb1 التجريبية لإجراء المزيد من الدراسات.
تتكاثر الفئران تيتو-DN-CB-myc6-Rb1 الكبار إلى السطر محفز التتراسيكلين روزا-كاج-رتا (الأسهم #006965) (بدلاً من ذلك، تولد لخط نقل واكتساب التكنولوجيا محفز) لتوليد تجريبية DN-كبرب الفئران. النمط الوراثي ذرية هذا عبر استخدام مجموعة التمهيدي التالية: لوزن رتا R، استخدم جاجكججاجااتجاتاتج؛ رتا R المسخ، استخدم جكجاجاجتتجتككتكاكك؛ وبالنسبة رتا المشتركة، استخدام آآجتكجكتكتجاجتجتات. أحجام المنتج PCR هي 340 bp (متحولة)، 340 bp و 650 بي بي (هيتيروزيجوتي)، و 650 شركة بريتيش بتروليوم (البرية-نوع).
إنشاء منحنى استجابة لجرعة من البروتين RB1 بعد العلاج دوكس لتحديد الوقت وطول دوكس المعاملة اللازمة للحصول على تعبير التحوير.
ملاحظة: في هذه التجربة، استخدمت لطخة غربية وبكر قرة لتقييم تفعيل التحوير الخاصة بالانسجة والتعبير RB1.
القيام بالأسفار في الموقع التهجين (الأسماك) للتأكد من إدراج الجينوم التحوير.
ملاحظة: تم ذلك في المركز "تطبيق علم الجينوم" في مستشفى "الأطفال المرضى" (تورنتو، كندا). أليسا أو النشاف الغربية (باستخدام الأجسام المضادة الخاصة بالبروتين) يمكن استخدامها لتقييم تفعيل التحوير وخصوصية الأنسجة، والتغييرات في مستويات البوي الذاتية. لإنشاء DN-CB-myc6-Rb1 ، استخدمنا جسم RB1 المضادة.

النتائج

وبصفة عامة، تصميم طفرة DN يتطلب قدرا كبيرا من المعلومات عن هيكل ووظيفة نقطة مهمة. وفي المقابل، DN الاستراتيجية المعروضة هنا مفيدة بشكل خاص عندما تكون المعلومات الهيكلية والوظيفية لنقطة مهمة محدودة. إذا كانت نقطة مهمة بروتين مولتيميريك، انصهار فرعية واحدة إلى حوزتي الليزو...

Discussion

للتحايل على القيود المرتبطة بالاستراتيجيات التقليدية المعدلة وراثيا، سعينا إلى إنشاء نموذج ماوس التي البوي ذاتية يمكن تكون إفراجاً مشروطاً معطل قبل overexpressing نموذج DN المسخ منه بطريقة الزمانية المكانية. إلغاء الوظيفة من النقاط المهمة الذاتية، كان العديد من الخيارات المقترحة¹⁵

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgements

PCS2 + سي بي-Myc6 ناقل كان هدية من هورويتز مارشال (جامعة واشنطن، سياتل، واشنطن، الولايات المتحدة الأمريكية). وقدمت الخلايا هيي-OC1 يرجى فيدريكو كالينيك (ديفيد جيفن كلية الطب، جامعة كاليفورنيا، لوس أنجلس، كاليفورنيا، الولايات المتحدة الأمريكية). قدم الدعم التقني نبراسكا الماوس الجينوم الهندسية الأساسية (C.B. غورومورثي، دون أضرار، ذلك رولين) وكريتون جامعة متكاملة الطبية التصوير مرفق (هالوورث ريتشارد، جون بليمير). هندسة الجينوم الماوس في نبراسكا أيده "جائزة التنمية المؤسسية" (فكرة) من المعاهد الوطنية للصحة/نيجمس، منح رقم P20 GM103471. وأيد مدرسة جامعة كريتون الطب ومنح GM103427 و GM110768 من المعاهد الوطنية للصحة/نيجمس "مرفق التصوير الطبية المتكاملة". المرفق شيد بدعم من المنح المقدمة من المركز الوطني "بحوث الموارد" (RR016469) ونيجمس (GM103427). وأبقى على خطوط الماوس التي تم إنشاؤها في هذه الدراسة في جامعة كريتون "مرفق الموارد الحيوانية"، البنية التحتية التي تحسنت بفضل منحة من المعاهد الوطنية للصحة/نكرر G20RR024001. هذا العمل تلقت في الماضي الدعم عن طريق المعاهد الوطنية للصحة/نكر 5P20RR018788-/المعاهد الوطنية للصحة/نيجمس 8P20GM103471 نحاس منح (شلي د. سميث)، والمعاهد الوطنية للصحة/عرب R21OD019745-01A1 (س-س)، وناشئة بحث منحة من "مؤسسة الصحة استماع" (ترانج س.). محتوى هذا البحث هي المسؤولة الوحيدة عن المؤلفين ولا تمثل بالضرورة وجهات النظر الرسمية "المعاهد الوطنية للصحة".

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco's Modified Eagle's Medium, DMEM	GIBCO-BRL	11965-084
Minimum Essential Medium Eagle, MEME	Sigma	M8042
Fetal bovine serum	Sigma	F2442
Lipofectamine	DharmaFECT	T-2010-03
Sal I	Roche	11745622
EcoRV-HF	New England BioLabs	R3195S
NotI	Roche	13090730
CaspaTag	Millipore	APT523
DAPI	Sigma	D9542
Staurosporine	Sigma	S4400
CyQuant NF cell proliferation kit	Invitrogen	C35007
Retinoblastoma 1 antibody	Abcam	Ab6075
c-Myc antibody	Sigma	M5546
b-actin	Sigma	A5316
Ki-67	Thermofisher scientific	MA5-14520
Phallodin	Thermofisher scientific	A12379
Fluorescence microplate reader	FLUOstar OPTIMA, BMG Labtech
Epifluorescence microscope	NikonEclipse80i
The TetO-DN-CB-myc6-Rb1 (DN-CBRb) mouse line is available from the Jackson Laboratory as JAX#032011.

References

Li, F. Q., et al. Preferential MyoD homodimer formation demonstrated by a general method of dominant negative mutation employing fusion with a lysosomal protease. Journal of Cell Biology. 135 (4), 1043-1057 (1996).
Tarang, S., et al. Generation of a retinoblastoma (rb)1-inducible dominant-negative (DN) mouse model. Frontiers Cellular Neuroscience. 9 (52), (2015).
Kominami, E., et al. The selective role of cathepsins B and D in the lysosomal degradation of endogenous and exogenous proteins. FEBS Letters. 287 (1-2), 189-192 (1991).
Cortellino, S., et al. Defective ciliogenesis, embryonic lethality and severe impairment of the sonic hedgehog pathway caused by inactivation of the mouse complex A intraflagellar transport gene Ift122/Wdr10, partially overlapping with the DNA repair gene Med1/Mbd4. Developmental Biology. 325 (1), 225-237 (2009).
Ferreira, C., et al. Early embryonic lethality of H ferritin gene deletion in mice. Journal of Biological Chemistry. 275 (5), 3021-3024 (2000).
Lee, E. Y., et al. Mice deficient for rb are nonviable and show defects in neurogenesis and haematopoiesis. Nature. 359 (6393), 288-294 (1992).
Turlo, K. A., et al. When cre-mediated recombination in mice does not result in protein loss. Genetics. 186 (3), 959-967 (2010).
Weber, T., et al. Rapid cell-cycle reentry and cell death after acute inactivation of the retinoblastoma gene product in postnatal cochlear hair cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (2), 781-785 (2008).
Zhang, J., et al. The first knockout mouse model of retinoblastoma. Cell Cycle. 3 (7), 952-959 (2004).
Zhao, H., et al. Deletions of retinoblastoma 1 (Rb1) and its repressing target S phase kinase-associated protein 2 (Skp2) are synthetic lethal in mouse embryogenesis. Journal of Biological Chemistry. 291 (19), 10201-10209 (2016).
Yamasaki, L., et al. Loss of E2F-1 reduces tumorigenesis and extends the lifespan of Rb1(+/-) mice. Nature Genetics. 18 (4), 360-364 (1998).
Li, F. Q., et al. Selection of a dominant negative retinoblastoma protein (RB) inhibiting satellite myoblast differentiation implies an indirect interaction between MyoD and RB. Molecular and Cellular Biology. 20 (14), 5129-5139 (2000).
Pitkanen, K., et al. Expression of the human retinoblastoma gene product in mouse fibroblasts: Effects on cell proliferation and susceptibility to transformation. Experimental Cell Research. 207 (1), 99-106 (1993).
Chano, T., et al. Neuromuscular abundance of RB1CC1 contributes to the non-proliferating enlarged cell phenotype through both RB1 maintenance and TSC1 degradation. International Journal of Molecular Medicine. 18 (3), 425-432 (2006).
Kole, R., et al. RNA therapeutics: Beyond RNA interference and antisense oligonucleotides. Nature Reviews Drug Discovery. 11 (2), 125-140 (2012).
Yamamoto, A., et al. The ons and offs of inducible transgenic technology: A review. Neurobiology of Disease. 8 (6), 923-932 (2001).
Houdebine, L. M., et al. Transgenic animal models in biomedical research. Methods in Molecular Biology. 360, 163-202 (2007).
Brehm, A., et al. Retinoblastoma protein recruits histone deacetylase to repress transcription. Nature. 391 (6667), 597-601 (1998).
Lu, Z., et al. E2F-HDAC complexes negatively regulate the tumor suppressor gene ARHI in breast cancer. Oncogene. 25 (2), 230-239 (2006).
Magnaghi-Jaulin, L., et al. Retinoblastoma protein represses transcription by recruiting a histone deacetylase. Nature. 391 (6667), 601-605 (1998).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

143 CB

This article has been published

Video Coming Soon

Keep me updated: