Inibição de proteína inducible e reversível dominante-negativo (DN)

Resumo

Aqui nós apresentamos um protocolo para desenvolver um sistema inducible negativo dominante, em que qualquer proteína pode ser condicionalmente inativada pela superexpressão reversivelmente uma versão mutante dominante negativo dele.

Resumo

Inibição de proteína dominante negativo (DN) é um método poderoso para manipular a função da proteína e oferece diversas vantagens sobre outras abordagens de genoma. Por exemplo, embora quimérico e Cre-LoxP alvos estratégias têm sido amplamente utilizadas, as limitações intrínsecas destas estratégias (ou seja, atividade de promotor gotejante, expressão Cre de mosaico, etc) têm significativamente restringido sua aplicação. Além disso, uma eliminação completa de muitos genes endógenos é embryonically letal, tornando impossível para estudar a função dos genes na vida pós-natal. Para enfrentar estes desafios, temos fez mudanças significativas para um protocolo de engenharia genética precoce e uma versão curta (transgênica) do gene Rb1 aliada a uma protease lisossômica procathepsin B (CB), para gerar um modelo de mouse DN de Rb1 (CBRb). Devido à presença de uma protease lisossômica, a proteína de fusão CB-RB1 inteira e seu complexo de interação são roteadas para degradação mediada por Proteassoma. Além disso, a presença de um elemento de indutor (rtTA) tetraciclina na construção transgênica permite um regulamento inducible e reversível da proteína RB1. A presença de um promotor de ROSA-CAG onipresente no modelo do rato de CBRb torna uma ferramenta útil para realizar ablação de gene Rb1 transitória e reversível e fornecer um recurso de pesquisadores para a compreensão de sua atividade em praticamente qualquer tipo de célula onde RB1 é expresso.

Introdução

A maioria das abordagens visando os gene e proteína ablações dependem de processos de permanentes, que geralmente levam à eliminação completa ou truncamento do gene, sequências de RNA ou proteína de interesse (POI). O objetivo geral deste método é engenheiro uma proteína recombinante para suprimir a função da proteína endógena, selvagem-tipo. Nós temos revisitado e renovada uma estratégia alternativa^1,2, que permite a ablação temporária de um POI através da inibição de DN. Esse método funciona para ambos multiméricas e peptídeos monoméricos, mas é o mais adequado para as proteínas que funcionam em um assembly multiméricas.

O método consiste em fundir a protease lisossômica CB para uma subunidade de uma multiméricas POI (fusão de CB complexo). A fusão de CB resultante complexa pode interagir com e proteoliticamente digerir a proteína endógena ou desviar todo o complexo para o lisossoma para ser degradada³CB-POI. Além disso, uma combinação da fusão CB complexa com a natureza inducible do sistema controlado por tetraciclina ativação transcricional (TetO) permite uma expressão inducible e controlada do transgene em uma moda reversível². Embora útil em muitas circunstâncias, a completa eliminação de genes ou proteínas in vivo pode resultar em letalidade^4,5,6. Da mesma forma, exclusão condicional, tecido-específica de alguns genes ou proteínas utilizando o sistema Cre/Lox pode não ser simples, como, em última análise, conduzirá à perda permanente de elementos críticos de genômica⁷. Portanto, dependendo do gene ou POI, nenhuma dessas abordagens será eficaz em fornecer um modelo útil para estudos posteriores, particularmente dos genes ou dos proteínas estudos funcionais em camundongos adultos e pós-natal atrasados.

Para contornar os problemas associados com tais abordagens e fornecer prova de princípio sobre a eficácia do método proposto, decidimos testar o método apresentado aqui, gerando uma versão DN condicional da proteína do Retinoblastoma 1 (RB1). Várias opções foram propostos^8,9,10 para abolir a função de RB1 endógena; no entanto, todos eles enfrentaram algumas das mesmas limitações discutidas acima: exclusão permanente germline de RB1 é embryonically letal, e, coerente com seu papel de supressor de tumor, permanente exclusão condicional RB1 leva a uma variedade de tumores¹¹. Apesar de uma versão do DN de RB1 não parece ocorrer naturalmente, uma alternativa melhor para as estratégias atualmente disponíveis deve permitir uma inativação temporalmente controlada do RB1 endógena e fornecem um mecanismo alternativo para eventualmente restaurar sua função. A base para tal uma construção foi descrita há mais de duas décadas atrás¹. No entanto, devido às limitações tecnológicas, faltava-lhe um mecanismo de controle do transgene ativação de resposta e especificidade de tecido. Este estudo é o primeiro a combinar a elegância de doxiciclina (Dox)-sistema transcriptional dependente com uma engenharia construção transgênica de protease lisossômica CB e Rb1 proteínas. O modelo resultante do rato CBRb permite um temporariamente regulamentado RB1 mediada por Dox regra². A vantagem de usar uma abordagem baseada em proteoma para estudar a função dos genes é que pode ser adotado para qualquer gene de interesse, com informações mínimas sobre a sua actividade.

A estratégia proposta do transgene DN oferece muitas vantagens sobre as abordagens tradicionais. Primeiro, inibição da proteína de DN leva a apenas uma ablação parcial na atividade da proteína, preservando assim uma expressão residual endógena. Esse resultado é altamente desejável em situações onde uma eliminação completa da atividade da proteína leva a letalidade embrionária, limitando grandemente qualquer investigação para estudar a função do gene em um rato vivo. Em segundo lugar, a presença do sistema de TetO permite ativação do transgene apenas na presença de um antibiótico, o que permite um controle eficiente e reversível da atividade do transgene. Assim, por cessar a administração de antibióticos, o sistema transgênico pode ser desativado, e uma expressão normal de RB1 está de volta em casa. Em terceiro lugar, a especificidade da expressão do transgene pode variar dependendo do promotor da escolha. Enquanto nós escolhemos o promotor ROSA-CAG onipresente para prova de princípio, colocar o transgene sob um promotor de tecido-específica é susceptível de restringir a expressão do transgene indesejados e facilitar estudos sobre a aplicação terapêutica deste transgene metodologia.

Protocolo

Geração de transgênicos CBRb mouse e todos os cuidados com animais e experiências associadas com o estudo foram aprovadas pelos cuidados institucionais do Animal de Creighton University e uso Comité (IACUC) e realizado por suas orientações.

1. transgênicos CB-Myc₆-construção de Rb1

Nota: A clonagem em um vetor de pTet_Splice de CBRb foi feita em um processo de várias etapa (figura 1A e 1B).

1. Realize a clonagem do primeiro estágio, no pCS2 + CB-Myc6 vector.
   1. Para criar a construção CBRb do transgene, amplificar um fragmento de cDNA de Rb1 1583-bp-long (528 aminoácidos correspondente à região de aminoácido 369-896) da proteína RB1 usando o primer seguinte conjunto: para EcoRI +RB 1243F, use GGGGAATTCA TTAAATTCAGCAAGTGATCAACCTTCe XbaI + EcoRV +RB 2826R, use CCCTCTAGATATCTATTTGGACTCTCCTGGGAGATGTTTACTTCC.
   2. Clone o fragmento gerado (1546 bp) entre os locais de restrição EcoR1 e XbaI do pCS2 + CB-Myc6 vetor, como descrito anteriormente,^1,12.
      Nota: A construção de CB-Myc6 de 1012-bp-long (337 aminoácidos) fundida-se para o fragmento de Rb1 resultou em uma proteína de cerca de 865 aminoácidos (cerca de 108 kDa), que é ligeiramente menor do que a proteína endógena do RB1 (~ 110 kDa) (Figura 1 Um), com um tag de₆ CB-Myc no N-terminal e Rb1 no C-terminal.
2. Realize a segunda fase subcloning no vetor pTet-Splice.
   1. Para amplificar o fragmento de fusão CB-RB-Myc6 e ganhar o Tet-promotor, amplificar a fita, consistindo o CB-myc6-Rb1 usando cartilhas contendo o EcoRV (XbaI + EcoRV + RB 2826R) e sites de SalI : para SalI +CBF, Use o CCAGTCGACAGGATGTGGTGGTCCTTGATCCTTC.
   2. Subclone o fragmento gerado (2567 bp) para o vetor pTet-Splice, entre os locais de restrição SalI e EcoRV , de tal forma que sinalizam o transgene TetO-DN-CB-myc6-Rb1 inteiro, incluindo o intrão SV40 e a PolyA, podem ser isolados através de uma simples digestão com NotI (Figura 1B).
      Nota: O fragmento NotI foi usado para gerar os financiadores de transgénicos.

2. em Vitro testes do Transgene TetO-DN-CB-myc6-Rb1

1. Dox-Regulamento: Linha de celular NIH3T3
   Nota: Salvo indicação contrária, todos os volumes foram ajustados para uma placa de 6.
   1. Desenvolvem-se células NIH3T3 seguindo as especificações do fornecedor, utilizando o meio de cultura celular recomendado contendo 10% de soro bovino fetal a 37 ° C, com 10% de CO₂.
   2. Cotransfect as células com pTet-Splice e vetores de pCMV-Tet3G (da etapa 1) por 24 h. sigam os passos abaixo mencionados para cotransfection.
      1. Misture 2 – 4 µ l do reagente baseado em lipídios transfeccao/poço e 1 mL de incompleta (sem o soro) Dulbecco modificado águia médio (DMEM) por 5 min à temperatura ambiente. Por um prato de 24 ou 12 --bem, use 250 ou 500 µ l de meios de cultura, respectivamente e ajustar o volume de reagente de Transfeccao de acordo.
      2. Adicionar 2-3 µ g de Plasmideo DNA/bem para o reagente de transfeccao-DMEM e incubar durante 20 min à temperatura ambiente.
      3. Adicione a mistura que contém DNA e o reagente de transfeccao em DMEM a cada poço. Após 3-4 h de incubação, adicione 1 mL de mídia completa (de modo que o volume final é 2 mL/poço). Manter as alíquotas de estoque Dox (1 mg/mL) e adicionar 2 µ l em cada um dos poços (+ Dox). Incube a 37 ° C com 5% CO₂células.
         Nota: Amostras de controlo devem consistir de cotransfected células não tratadas com Dox (-Dox), bem como NIH3T3 células transfectadas apenas com o vetor de pCMV-Tet3G liberada e tratadocom com Dox, por um período de 24h. Para pCMV-Tet3G, as concentrações de 0,1 a 1 µ g/mL Dox deve ser suficiente para induzir a expressão do transgene.
2. Teste a reversibilidade da construção usando a linha de células HEK293.
   1. Para testar a reversibilidade do transgene TetO-DN-CB-myc6-Rb1 , células de cultura HEK293 do águia mínimo essencial médio (EMEM) seguindo as especificações do fornecedor e cotransfect com vetores tanto pTet-Splice e pCMV-Tet3G para 24h, conforme descrito acima (passo 2.1.2).
   2. Para a inactivação de transgene, remova a mídia contendo Dox após 24 h, lavar a células 2 x-3 x com solução salina tamponada fosfato (PBS) e incube-os em media Dox-free para um adicional 24h.
      Nota: Em cima da Dox-remoção, o transgene inactivação e expressão da proteína regular devem ser retomados nesse prazo de 24 h.
3. Para avaliar a funcionalidade da construção de TetO-DN-CB-myc6-Rb1 em promover a proliferação celular não-programada, realize as análises funcionais usando uma linha de celular HEI-OC1, conforme descrito abaixo.
   1. Células de cultura HEI-OC1 em 10% DMEM sob permissiva condições (33 ° C com 10% CO₂). Para estudos de proliferação celular, conte as células usando um contador de célula e placa 10.000 HEI-OC1 células numa placa de 96 poços em um volume de 200 µ l. Incube as células durante a noite.
   2. No dia seguinte, realizar uma cotransfection transitória de vetores pTet-Splice e pCMV-Tet3G, usando um reagente de transfeccao baseada em lipídios (ver passos 2.1.2). Em um poço separado, execute pmR-ZsGreen1 do transfection at2-µ g usando o reagente de transfeccao baseada em lipídios (etapas 2.1.2) para calcular a taxa de transfecção. Use células não transfectadas como controles.
   3. Detectar a presença de fluorescência verde sob um microscópio de fluorescência (excitação = 485 nm, emissão = 530 nm) para o transfectadas pilhas 24h depois do transfection. Registar a presença ou ausência de fluorescência verde e calcular a taxa de transfecção como o número total de células GFP-positivo (células transfectadas) sobre as células rotuladas com DAPI (células totais).
      Nota: Estimamos uma taxa de transfecção de ~ 70%.
   4. Para induzir a expressão do transgene, adicionar 1 µ g/mL Dox para um subconjunto de células transfectadas enquanto estiver usando o outro subconjunto como controle (-Dox). Use células de IES-OC1 não tratadas como controles adicionais.
   5. Para avaliar a proliferação celular, use um kit de proliferação de células de acordo com o protocolo do fabricante.
      1. Em breve, 48 h após a transfeccao, remover o meio de cultura celular e adicionar 100 µ l de solução corante-vinculação de 1x a cada poço do microplate. Incubar durante 1 h a 37 ° C.
      2. Depois disso, medir a intensidade de fluorescência de cada amostra, usando um leitor de microplacas de fluorescência (excitação = 485 nm, emissão = 530 nm).
   6. Para avaliar usando imunocitoquímica de proliferação celular, células de IES-OC1 em um vidro de tampa em uma placa de 12 da placa e incubar durante uma noite a 37 ° C.
      1. No dia seguinte, cotransfect com a tala pTet e pCMV-Tet3G e realizar o tratamento de Dox (+ Dox). Use células untransfected como controles. Processo HEI-OC1 células para a rotulagem de Ki-67.
      2. Fixe as células com paraformaldeído 4% (PFA) em PBS, pH 7,4, durante 10 minutos à temperatura ambiente. Lavar as células 3 x com PBS gelado e incube as celulas em 0,25% de detergente não-iônico em PBS por 10 min.
      3. Lavar as células novamente, 3 x em PBS por 5 min e bloco usando 10% de soro em uma câmara umidificada por 1h à temperatura ambiente.
      4. Incube as celulas em 500 µ l do anticorpo primário do Ki-67 (diluição de 1: 200) para 3h em temperatura ambiente ou durante a noite a 4 ° C.
      5. Lavar as células 3 x por 5 min com PBS. Depois disso, Incube as celulas com o anticorpo secundário por 1h à temperatura ambiente no escuro.
      6. Remover a solução de anticorpo secundário e lavar as células 3 x com PBS por 5 min no escuro.
      7. Para a rotulagem faloidina, Incube as celulas de IES-OC1 em 1: 200 faloidina por 30 min. Para rotular os núcleos das células, Incube as celulas com 5 µ g/mL DAPI durante 10 minutos à temperatura ambiente.
         Nota: Certifique-se de que o conjugado de tintura faloidina é diferente do que o conjugado anticorpo secundário.

3. geração de /ROSA-CAG-rtTA de CBRb⁺⁺ (CBRb) ratos transgênicos e em testes de Vivo da abordagem DN-CBRb

1. Após a confirmação do Regulamento Dox eficaz do transgene TetO-DN-CB-myc6-Rb1 , purificar o fragmento NotI e microinjeção-los em zigotos de rato, que depois são transferidos para as fêmeas grávidas pseudo.
   Nota: Esses procedimentos foram realizados na Universidade de Nebraska Medical Center (UNMC) Mouse genoma engenharia Core instalação.
2. Após o parto, os filhotes usando um primer conjunto específicos para a região de fusão do CB-Rb1 de genótipo: para F CBRb, use CTGTGGCATTGAATCAGAAATTGTGGCTGG 3 ' 5' e para CBRB R, use 5 ' GTACTTCTGCTATATGTGGCCATTACAACC 3 '.
   Nota: Tamanho do produto do PCR observado em gel de agarose é 401 bp (região de CB 60-bp + 341-bp Rb1 região (tabela 1). Foram identificadas dez linhas de fundador independente, baseado na presença do transgene TetO-DN-CB-myc6-Rb1 . Em cinco destas linhas, descendência herdou o transgene, que confirmou a transmissão do germline do transgene. Uma das linhas transgénicas, finalmente, foi usada para estabelecer e manter a linha e gerar animais experimentais de TetO-DN-CB-myc6-Rb1 para estudos adicionais.
3. Reproduzem os ratos adultos TetO-DN-CB-myc6-Rb1 à linha ROSA-CAG-rtTA tetraciclina indutor (Stock #006965) (Alternativamente, raça para uma linha de indutor de tTA) para gerar experimental DN-CBRb ratos. Genótipo a prole desta cruz usando o seguinte conjunto de primeira demão: para rtTA-WT R, use GGAGCGGGAGAAATGGATATG; para rtTA mutante R, use GCGAGGAGTTTGTCCTCAACC; e para rtTA comum, use AAAGTCGCTCTGAGTTGTTAT. Os tamanhos do produto PCR são 340 bp (mutante), 340 bp e 650 bp (heterozigoto) e 650 bp (tipo selvagem).
4. Gere uma curva de dose-resposta da proteína RB1 Dox no tratamento para determinar a hora e a duração do tratamento necessária para eliciar uma expressão do transgene Dox.
   Nota: Neste experimento, borrão ocidental e qRT-PCR foram utilizados para avaliar o tecido-específica do transgene ativação e expressão de RB1.
5. Execute a fluorescência em situ da hibridação (peixe) para confirmar a inserção genômica do transgene.
   Nota: Isto foi realizado no centro de genômica aplicada do Hospital para crianças doentes (Toronto, Canadá). ELISA ou mancha ocidental (usando anticorpos específicos de proteínas) pode ser usado para avaliar a ativação do transgene, tecido-especificidade e alterações nos níveis do POI endógeno. Para a construção de DN-CB-myc6-Rb1 , foi utilizado um anticorpo anti-RB1.

Resultados

Geralmente, a concepção de uma mutação de DN exige uma quantidade considerável de informações sobre a estrutura e função do POI. Em contraste, a estratégia de DN apresentada aqui é particularmente útil quando as informações estruturais e funcionais para o POI são limitadas. Se o POI é uma proteína multiméricas, uma fusão de uma subunidade de uma protease lisossômica dominante pode inibir o multimer montado e, potencialmente, outros ligantes através de uma combinação...

Discussão

Para contornar as limitações associadas com as estratégias tradicionais de transgénicas, procuramos gerar um modelo de mouse em que um POI endógena pode ser condicionalmente inativado pela superexpressão uma forma mutante de DN do de uma forma spatiotemporal. Suprimir a função de POIs endógenas, várias opções foram propostos^15,16,17. Modificamos um anterior estratégia genética¹ , combinando ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco's Modified Eagle's Medium, DMEM	GIBCO-BRL	11965-084
Minimum Essential Medium Eagle, MEME	Sigma	M8042
Fetal bovine serum	Sigma	F2442
Lipofectamine	DharmaFECT	T-2010-03
Sal I	Roche	11745622
EcoRV-HF	New England BioLabs	R3195S
NotI	Roche	13090730
CaspaTag	Millipore	APT523
DAPI	Sigma	D9542
Staurosporine	Sigma	S4400
CyQuant NF cell proliferation kit	Invitrogen	C35007
Retinoblastoma 1 antibody	Abcam	Ab6075
c-Myc antibody	Sigma	M5546
b-actin	Sigma	A5316
Ki-67	Thermofisher scientific	MA5-14520
Phallodin	Thermofisher scientific	A12379
Fluorescence microplate reader	FLUOstar OPTIMA, BMG Labtech
Epifluorescence microscope	NikonEclipse80i
The TetO-DN-CB-myc6-Rb1 (DN-CBRb) mouse line is available from the Jackson Laboratory as JAX#032011.