Inhibición de la proteína inducible y Reversible dominante negativo (DN)

Resumen

Aquí presentamos un protocolo para desarrollar un sistema inducible negativo dominante, en el que cualquier proteína puede ser condicional inactivada por overexpressing reversiblemente una versión mutante dominante negativo de él.

Resumen

Dominante negativa inhibición de la proteína (DN) es un método potente para manipular la función de la proteína y ofrece varias ventajas sobre otros enfoques basados en el genoma. Por ejemplo, aunque quimérica y Cre-LoxP estrategias objetivos han sido ampliamente utilizados, las limitaciones intrínsecas de estas estrategias (es decir, actividad de promotor agujereado, expresión del Cre de mosaico, etc.) han restringido significativamente su aplicación. Por otra parte, una canceladura completa de numerosos genes endógenos es catequizador letal, lo que hace imposible para el estudio de funciones de los genes en la vida postnatal. Para enfrentar estos desafíos, hemos hecho cambios significativos a un protocolo de ingeniería genética temprana y combina una versión corta (transgénica) del gen Rb1 con una proteasa lysosomal B procathepsin (CB), para generar un modelo de ratón de DN de Rb1 (CBRb). Debido a la presencia de una proteasa lisosomal, la proteína de la fusión completa de CB-RB1 y su complejo de interacción se dirigen para la degradación mediada por el proteasoma. Por otra parte, la presencia de un elemento inductor (rtTA) de tetraciclina en la construcción de transgénico permite una regulación inducible y reversible de la proteína de RB1. La presencia de un promotor de ROSA-CAG omnipresente en el modelo de ratón de CBRb es una herramienta útil para realizar ablación de gene Rb1 transitoria y reversible y proporcionar a los investigadores un recurso para comprender su actividad en prácticamente cualquier tipo de célula donde se expresa el RB1.

Introducción

Enfoques más con el objetivo de la ablación del gen y la proteína dependen de procesos permanentes, que generalmente conducen a la eliminación completa o el truncamiento de la gene, secuencias de ARN o proteínas de interés (POI). El objetivo general de este método es diseñar una proteína recombinante para suprimir la función de la proteína endógena, tipo salvaje. Hemos revisado y renovado una estrategia alternativa^1,2, que permite la ablación temporal de un POI a través de la inhibición de la DN. Este método funciona para multiméricas y péptidos monoméricos pero es el más adecuado para las proteínas que funcionan en una Asamblea de multimérica.

El método consiste en fundir la proteasa lisosomal CB a una subunidad de un multimérica POI (complejo de fusión de la CB). La fusión resultante de CB complejo puede interactuar con proteolytically digerir la proteína endógena y desviar todo el complejo de POI CB al lisosoma para ser degradados³. Por otra parte, una combinación de la fusión de CB compleja con el carácter inducible del sistema de activación transcripcional controlado por tetraciclina (TetO) permite una expresión inducible y controlada del transgén en una manera reversible². Aunque útil en muchas circunstancias, la supresión completa de genes o proteínas in vivo puede resultar en mortalidad^4,5,6. Además, eliminación de tejidos específicos, condicional de algunos genes o proteínas mediante el sistema Cre/Lox puede no ser sencillo, ya que provocaría, en última instancia, a la pérdida permanente de elementos genómicos críticos⁷. Por lo tanto, dependiendo de la genética o POI, ninguno de estos enfoques será eficaz en proporcionar un modelo útil para estudios posteriores, particularmente genes o proteínas los estudios funcionales en ratones adultos y postnatales tardíos.

Para eludir los problemas asociados con estos enfoques y proporcionar prueba de principio sobre la efectividad del método propuesto, hemos optado por probar el método presentado aquí por generar una versión DN condicional de la proteína Retinoblastoma 1 (RB1). Varias opciones han sido propuestos^8,9,10 para suprimir la función de RB1 endógeno; sin embargo, todos ellos frente a algunas de las mismas limitaciones mencionadas: eliminación permanente del germline de RB1 es catequizador letal y, coherente con su función de supresor de tumor, permanente borrado condicional RB1 conduce a una variedad de tumores¹¹. Aunque una versión de DN de RB1 parece no ocurre naturalmente, una mejor alternativa a las estrategias actualmente disponibles debe permitir una inactivación temporal controlada de RB1 endógeno y proporcionar un mecanismo alternativo para finalmente restaurar su función. La base para dicha construcción fue descrita hace más de dos décadas¹. Sin embargo, debido a limitaciones tecnológicas, carecía de un mecanismo de control transgen activación, la respuesta y la especificidad de tejido. Este estudio es el primero en combinar la elegancia de la doxiciclina (Dox)-sistema transcripcional dependiente con una construcción transgénica ingeniería de proteínas de CB y Rb1 proteasa lisosomal. El modelo de ratón de CBRb resultante permite una RB1 mediada por Dox temporalmente regulada regulación². La ventaja de utilizar un enfoque basado en el proteoma para estudiar la función genética es que puede adoptarse para cualquier gen de interés, con la mínima información sobre su actividad.

La estrategia propuesta de transgen DN ofrece muchas ventajas sobre los enfoques tradicionales. En primer lugar, inhibición de la proteína DN conduce a solamente una ablación parcial en actividad de la proteína, preservando así una expresión endógena residual. Ese resultado es muy conveniente en situaciones donde una eliminación completa de la actividad de la proteína conduce a mortalidad embrionaria, limitando grandemente cualquier investigación para estudiar la función del gen en un ratón vivo. En segundo lugar, la presencia del sistema TetO permite activación de transgen sólo en presencia de un antibiótico, que permite un control eficaz y reversible de la actividad del transgen. Así, al dejar la administración de antibióticos, se puede desactivar el sistema de transgénico, y es una expresión normal de RB1 en lugar. En tercer lugar, la especificidad de la expresión del transgen puede variar según el promotor de la opción. Aunque hemos optado por el promotor de ROSA-CAG ubicuo para la prueba de principio, colocar el transgén en un promotor tejido específico es probable restringir la expresión del transgén no deseados y facilitar estudios sobre la aplicación terapéutica de este transgén metodología.

Protocolo

Generación de todo cuidado de los animales en el ratón transgénico de CBRb y experimentos relacionados con el estudio fueron aprobados por el cuidado de Animal institucional de Universidad de Creighton y el Comité uso (IACUC) y realizadas por sus orientaciones.

1. transgénicos CB-Myc₆-construcción de Rb1

Nota: La clonación de CBRb en un vector de pTet_Splice fue hecha en un proceso de múltiples paso (figura 1A y 1B).

1. Llevar a cabo la primera clonación de etapa en la pCS2 + CB-Myc6 vector.
   1. Para crear la construcción del transgén de CBRb, amplificar un fragmento de cDNA de Rb1 de 1583-bp-largo (528 los aminoácidos correspondientes a la región del aminoácido 369 – 896) de la proteína de RB1 utilizando la siguiente cartilla establece: para EcoRI +RB 1243F, utilice GGGGAATTCA TTAAATTCAGCAAGTGATCAACCTTCy XbaI + EcoRV +2826 RBR, CCCTCTAGATATCTATTTGGACTCTCCTGGGAGATGTTTACTTCC.
   2. Copia el fragmento generado (1546 bp) entre los sitios de restricción EcoR1 y XbaI del pCS2 + CB-Myc6 vector como se describió anteriormente^1,12.
      Nota: La construcción de CB-Myc6 1012-bp-larga (337 aminoácidos) fusionados con el fragmento de Rb1 dio lugar a una proteína de aproximadamente 865 aminoácidos (aproximadamente 108 kDa), que es ligeramente más pequeña que la proteína endógena de RB1 (~ 110 kDa) (figura 1 Un), con una etiqueta de₆ CB-Myc en el N-terminal y Rb1 en el C-terminal.
2. Llevar a cabo la segunda etapa subcloning en el vector pTet-empalme.
   1. Amplificar el fragmento de fusión Myc6-RB-CB y ganar el promotor Tet, amplificar el cassette, que consiste en la CB-myc6-Rb1 usando las cartillas que contienen los EcoRV (XbaI + EcoRV + RB 2826R) y SalI : para SalI +CBF, uso de CCAGTCGACAGGATGTGGTGGTCCTTGATCCTTC.
   2. Subclone el fragmento generado (2567 bp) en el vector pTet-empalme, entre los sitios de restricción SalI y EcoRV , de tal manera que el transgén de TetO-DN-CB-myc6-Rb1 todo, incluyendo el intrón SV40 y el PolyA, puede ser aislada mediante una sola digestión con NotI (figura 1B).
      Nota: El fragmento de NotI se utilizó para generar a los transgénicos fundadores.

2. en las pruebas de Vitro del transgén TetO-DN-CB-myc6-Rb1

1. DOX-Reglamento: Línea de células NIH3T3
   Nota: A menos que se indique lo contrario, todos los volúmenes se han ajustado para una placa de 6 pozos.
   1. Crecen las células NIH3T3 siguiendo las especificaciones del proveedor, utilizando los medios de cultivo celular recomendado que contiene 10% de suero fetal bovino a 37 ° C con 10% CO₂.
   2. Cotransfect las células con pTet-empalme y vectores pCMV-Tet3G (desde el paso 1) por 24 h. siguen los pasos mencionados a continuación para cotransfection.
      1. Mezcla de 2-4 μL del reactivo de transfección basada en lípidos/pozo y 1 mL de incompleta (sin suero) de Dulbecco modificado Eagle medio (DMEM) durante 5 minutos a temperatura ambiente. Para una placa de 12 o 24 pocillos, utilice 250 o 500 μl de medio de cultivo, respectivamente y Ayuste el volumen de reactivo de transfección.
      2. Añadir 2 – 3 μg de plásmido ADN/bien al reactivo de transfección-DMEM e incubar durante 20 min a temperatura ambiente.
      3. Añadir la mezcla que contiene el ADN y el reactivo de transfección en DMEM a cada pocillo. Después de 3 – 4 h de incubación, añadir 1 mL de medio completo (de modo que el volumen final es de 2 mL/pocillo). Guardar alícuotas de Dox stock (1 mg/mL) y añadir 2 μL en cada uno de los pozos (+ Dox). Incube las células a 37 ° C con 5% CO₂.
         Nota: Muestras de control deben consistir en cotransfected células no tratadas con Dox (-Dox), así como las células NIH3T3 transfectadas con el vector de Tet3G pCMV transactivator y trataron con Dox por un período de 24 h. Para pCMV-Tet3G, las concentraciones de 0.1-1 μg/mL Dox debe ser suficiente para inducir la expresión del transgén.
2. Prueba de la reversibilidad de la construcción mediante la línea de células HEK293.
   1. Para probar la reversibilidad del transgén TetO-DN-CB-myc6-Rb1 , células en cultivo HEK293 del águila mínimo esencial media (EMEM) siguiendo las especificaciones del proveedor y cotransfect con vectores pTet-empalme y pCMV-Tet3G de 24 h, como se describe arriba (paso 2.1.2).
   2. Para la inactivación del transgen, eliminar los medios de comunicación que contiene Dox después de 24 h, lavar la células 2 x-3 x con tampón fosfato salino (PBS) e incubar en medios libres de Dox para un 24 h adicional.
      Nota: Sobre Dox-retiro, la inactivación del transgen y expresión de la proteína regular deben reanudar dentro de ese plazo de 24 h.
3. Para evaluar la funcionalidad de la construcción de TetO-DN-CB-myc6-Rb1 en la promoción de la proliferación celular no programada, realizar el análisis funcionales utilizando una línea celular de HEI-OC1, como se describe a continuación.
   1. HEI-OC1 células en cultivo en 10% DMEM bajo permisiva condiciones (33 ° C con 10% CO₂). Para estudios de proliferación celular, contar las células usando un contador de células y células de HEI-OC1 placa 10.000 en una placa de 96 pocillos en un volumen de 200 μl. Incube las células durante la noche.
   2. Al día siguiente, realizar una transitoria cotransfection de vectores pTet-empalme y pCMV-Tet3G utilizando un reactivo de transfección basada en lípidos (ver pasos 2.1.2). En un pozo independiente, realizar pmR-ZsGreen1 transfección at2 μg utilizando el reactivo de transfección basada en lípidos (pasos 2.1.2) para calcular la tasa de transfección. Utilice las células transfectadas no como controles.
   3. Detectar la presencia de fluorescencia verde bajo un microscopio de fluorescencia (excitación = 485 nm, emisión = 530 nm) para el transfected las células 24 h después de transfección. Registrar la presencia o ausencia de fluorescencia verde y calcular la tasa de la transfección como el número total de células GFP-positivas (células transfected) sobre las células etiquetadas con DAPI (células totales).
      Nota: Se estimó una tasa de transfección de ~ 70%.
   4. Para inducir la expresión de transgenes, añadir 1 μg/mL Dox a un subconjunto de células transfected mientras usa el otro subconjunto como control (-Dox). Uso de las células no tratadas de HEI-OC1 como controles adicionales.
   5. Para evaluar la proliferación celular, utilice un kit de proliferación celular según protocolo del fabricante.
      1. En Resumen, 48 h después de la transfección, eliminar el medio de cultivo celular y añadir 100 μl de solución de unión a la tinte 1 x a cada pocillo de la microplaca. Incubar durante 1 h a 37 ° C.
      2. Después de eso, medir la intensidad de fluorescencia de cada muestra usando un lector de microplacas de fluorescencia (excitación = 485 nm, emisión = 530 nm).
   6. Para evaluar mediante inmunocitoquímica la proliferación celular, las células de HEI-OC1 en un vidrio de cubierta en una placa de 12 pozos de la placa e incubar durante una noche a 37 ° C.
      1. Al día siguiente, cotransfect pTet-empalme y pCMV-Tet3G y realizar el tratamiento de Dox (+ Dox). Utilice las células untransfected como controles. Células de HEI-OC1 proceso de etiquetado Ki-67.
      2. Fijar las células con 4% paraformaldehido (PFA) en PBS, pH 7,4, 10 min a temperatura ambiente. Lavar las células 3 x con helada PBS e incubar las células en detergente no iónico de 0,25% en PBS durante 10 minutos.
      3. Lavar las células otra vez, 3 veces en PBS por 5 min y bloque con 10% de suero en una cámara humidificada durante 1 h a temperatura ambiente.
      4. Incubar las células en 500 μl de anticuerpo primario de Ki-67 (dilución 1: 200) durante 3 horas a temperatura ambiente o durante la noche a 4 ° C.
      5. Lavar las células 3 x durante 5 minutos con PBS. Después de eso, incubar las células con el anticuerpo secundario por 1 h a temperatura ambiente en la oscuridad.
      6. La solución de anticuerpo secundario de quitar y lavar las células 3 x con PBS durante 5 minutos en la oscuridad.
      7. Para el etiquetado phalloidin, incubar las células HEI-OC1 phalloidin 1: 200 por 30 minutos. Para los núcleos de las células de la etiqueta, incubar las células con DAPI de 5 μg/mL durante 10 minutos a temperatura ambiente.
         Nota: Asegúrese de que el conjugado de tinte phalloidin es diferente al conjugado de anticuerpo secundario.

3. generación de CBRb⁺/ROSA-CAG-rtTA⁺ (CBRb) ratones transgénicos y en Vivo la prueba del enfoque DN CBRb

1. Sobre la confirmación de la efectiva regulación de Dox del transgén TetO-DN-CB-myc6-Rb1 , purificar el fragmento NotI y microinject en cigotos de ratón, que más tarde se transfieren a pseudo-hembras.
   Nota: Estos procedimientos se llevaron a cabo en la Universidad de Nebraska centro (UNMC) ratón genoma ingeniería núcleo facilidad médica.
2. Después de la entrega, el genotipo de las crías con un primer set específicas a la región de fusión CB-Rb1 : para CBRb F, utilice 5' CTGTGGCATTGAATCAGAAATTGTGGCTGG 3 ' y para R de CBRB, 5′ GTACTTCTGCTATATGTGGCCATTACAACC 3′.
   Nota: El tamaño del producto PCR en gel de agarosa es 401 bp (bp 60 CB región + región de Rb1 341-bp (tabla 1). Se identificaron diez líneas fundador independiente, basada en la presencia del transgen TetO-DN-CB-myc6-Rb1 . En cinco de estas líneas, progenie heredó el transgén, que confirmó la transmisión de la línea germinal del transgén. En última instancia, una de las líneas transgénicas se utilizó para establecer y mantener la línea y generar animales experimentales de TetO-DN-CB-myc6-Rb1 para estudios posteriores.
3. Se crían ratones adultos de TetO-DN-CB-myc6-Rb1 a la línea ROSA-CAG-rtTA de inductor de la tetraciclina (Stock #006965) (alternativamente, raza a una línea de tTA inductor) para generar ratones experimentales de DN CBRb. Genotipo de la descendencia de esta cruz con el siguiente conjunto de cartilla: rtTA WT R, utilice GGAGCGGGAGAAATGGATATG; para rtTA mutante R, use GCGAGGAGTTTGTCCTCAACC; y para rtTA común, AAAGTCGCTCTGAGTTGTTAT. Los tamaños del producto PCR son 340 bp (mutante), 340 bp y 650 bp (heterocigoto) y 650 bp (tipo salvaje).
4. Generar una curva de dosis-respuesta de la proteína de RB1 después del tratamiento de Dox para determinar el tiempo y la longitud del Dox tratamiento necesario para obtener una expresión del transgén.
   Nota: En este experimento, western blot y qRT-PCR fueron utilizados para evaluar tejidos específicos transgen activación y expresión de RB1.
5. Realizar en situ hibridación de la fluorescencia (pescado) para confirmar la inserción genómica del transgén.
   Nota: Esto se llevó a cabo en el centro de genómica aplicada del Hospital para niños enfermos (Toronto, Canadá). ELISA o western blot (mediante anticuerpos específicos de proteína) puede utilizarse para evaluar la activación del transgen, especificidad de tejido y cambios en los niveles del PDI endógeno. Para la construcción DN-CB-myc6-Rb1 , se utilizó un anticuerpo anti-RB1.

Resultados

En general, diseñar una mutación DN requiere una cantidad considerable de información sobre la estructura y función de la PDI. En contraste, la estrategia de DN presentada aquí es particularmente útil cuando la información estructural y funcional para el POI es limitada. Si el POI es una proteína multimérica, una fusión de una subunidad a una proteasa lysosomal dominante puede inhibir multimer montado y, potencialmente, otros ligandos a través de una combinación de la proteól...

Discusión

Para eludir las limitaciones asociadas con las estrategias tradicionales de transgénicas, se buscó generar un modelo de ratón en el que un POI endógena puede ser condicional inactivado por overexpressing una forma mutante de DN de él de manera espacio-temporal. Para suprimir la función de POIs endógenos, varias opciones han sido propuestos^15,16,17. Hemos modificado una estrategia genética anterior¹

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco's Modified Eagle's Medium, DMEM	GIBCO-BRL	11965-084
Minimum Essential Medium Eagle, MEME	Sigma	M8042
Fetal bovine serum	Sigma	F2442
Lipofectamine	DharmaFECT	T-2010-03
Sal I	Roche	11745622
EcoRV-HF	New England BioLabs	R3195S
NotI	Roche	13090730
CaspaTag	Millipore	APT523
DAPI	Sigma	D9542
Staurosporine	Sigma	S4400
CyQuant NF cell proliferation kit	Invitrogen	C35007
Retinoblastoma 1 antibody	Abcam	Ab6075
c-Myc antibody	Sigma	M5546
b-actin	Sigma	A5316
Ki-67	Thermofisher scientific	MA5-14520
Phallodin	Thermofisher scientific	A12379
Fluorescence microplate reader	FLUOstar OPTIMA, BMG Labtech
Epifluorescence microscope	NikonEclipse80i
The TetO-DN-CB-myc6-Rb1 (DN-CBRb) mouse line is available from the Jackson Laboratory as JAX#032011.