Induzierbaren und Reversible Dominant-Negative (DN) Protein Hemmung

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um eine Dominant-negativen induzierbaren System zu entwickeln, in der kein Protein bedingt inaktiviert durch reversibel überexprimiert eine Dominant-negativen mutierte Version davon.

Zusammenfassung

Dominant-Negative (DN) Protein Hemmung ist eine leistungsfähige Methode, Proteinfunktion zu manipulieren und bietet mehrere Vorteile gegenüber anderen Genom-basierte Ansätze. Zum Beispiel obwohl Chimären und Cre-LoxP gezielte Strategien sind am meisten benutzt, die immanente Grenzen dieser Strategien (z. B. undichte Promotoraktivität, Mosaik Cre Ausdruck usw.) erheblich eingeschränkt haben ihre Anwendung. Darüber hinaus ist eine vollständige Löschung von vielen endogenen Genen Hochkultur tödlich, macht es unmöglich, die Genfunktion in postnatale Leben zu studieren. Um diesen Herausforderungen zu begegnen, haben wir erhebliche Änderungen an einem frühen Gentechnik-Protokoll und kombiniert eine Kurzversion (transgene) das Rb1-gen mit einer lysosomalen Protease procathepsin B (CB), einem DN-Maus-Modell von Rb1 generieren (CBRb). Aufgrund des Vorhandenseins von lysosomalen Protease werden die gesamten CB-RB1-Fusionsprotein und seinen interagierenden Komplex für Proteasom-vermittelten Abbau weitergeleitet. Darüber hinaus ermöglicht das Vorhandensein von ein Tetracyclin-Induktor (RtTA) Element in der transgenen Konstrukt eine induzierbare und reversibel Regelung des das RB1-Protein. Das Vorhandensein eines allgegenwärtigen ROSA-CAG-Promotors im Mausmodell CBRb macht es ein nützliches Werkzeug, um vorübergehende und reversible Rb1-gen-Ablation durchführen und liefern Forscher eine Ressource für das Verständnis ihrer Tätigkeit in nahezu jedem Zelltyp wo RB1 zum Ausdruck.

Einleitung

Die meisten Ansätze mit dem Ziel der Gene und Proteine Ablationen setzen auf permanente Prozesse, die in der Regel zur vollständigen Beseitigung oder Kürzung des Gens, RNA-Sequenzen oder Protein von Interesse (POI) führen. Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist ein rekombinantes Protein zur Abschaffung der endogenen, Wildtyp Protein-Funktion zu konstruieren. Wir haben neu aufgelegt und überarbeitet eine alternative Strategie^1,2, die für die temporäre Ablation eines POI durch DN Hemmung ermöglicht. Diese Methode funktioniert für Multimeric und Monomeren Peptide aber eignet sich am besten für Proteine, die in einer Assembly Multimeric funktionieren.

Die Methode besteht darin, der Verschmelzung der lysosomalen Protease CB an eine Untereinheit von einem Multimeric POI (CB Fusion Komplex). Die resultierende komplexe CB-Fusion kann interagieren mit und proteolytisch das körpereigene Protein zu verdauen oder umleiten den Gesamtkomplex der CB-POI zu den Lysosomen abgebaut³sein. Darüber hinaus ermöglicht eine Kombination aus der komplexen CB-Fusion mit der induzierbaren Natur des Systems der Tetracyclin-gesteuerte transkriptionelle Aktivierung (TetO) einen induzierbaren und kontrollierte Expression des Transgens in einem reversiblen Mode². Obwohl in vielen Fällen nützlich, führt die vollständige Löschung von Genen oder Proteinen in-vivo Letalität^4,5,6. Ebenso gewebespezifischen, bedingte Löschung einiger Gene oder Proteine mit dem Cre/Lox-System einfach, möglicherweise nicht da es letztlich zu den dauerhaften Verlust von kritischen genomische Elemente⁷führt. Daher, je nach gen oder POI, keiner dieser Ansätze werden wirksam bei der Bereitstellung eines nützlichen Modells für nachfolgende Studien, besonders Gene oder Proteine funktionellen Studien in den späten postnatale und Erwachsenen Mäusen.

Zur Umgehung der Probleme im Zusammenhang mit solchen Ansätzen und Proof of Principle über die Wirksamkeit des vorgeschlagenen Verfahrens, möchten wir hier durch die Erzeugung einer bedingten DN-Version des Proteins Retinoblastom 1 (RB1) vorgestellte Methode zu testen. Mehrere Möglichkeiten wurden vorgeschlagenen^8,9,10 , die Funktion des endogenen RB1 abzuschaffen; jedoch alle den gleichen Einschränkungen oben diskutierten konfrontiert: permanente Keimbahn Löschung von RB1 ist Hochkultur tödlich, und mit seinen Tumorsuppressor Rolle, permanente RB1 bedingte Löschung führt zu einer Vielzahl von Tumoren¹¹. Obwohl eine DN-Version von RB1 nicht natürlich vorkommen scheint, sollte eine bessere Alternative zu den derzeit verfügbaren Strategien erlauben eine zeitlich gesteuerte Inaktivierung von endogenen RB1 und bieten einen alternativen Mechanismus schließlich wiederherstellen ihrer Funktion. Die Grundlage für ein solches Konstrukt wurde vor über zwei Jahrzehnten beschrieben¹. Allerdings fehlte es aufgrund von technischen Einschränkungen, einen Mechanismus zur Kontrolle Transgen Aktivierung, Reaktion und Gewebespezifität. Diese Studie ist die erste verbinden die Eleganz der Doxycyclin (Dox)-abhängige transkriptionelle System mit ein veränderter transgenen Konstrukt der lysosomalen Protease CB und Rb1 Proteine. Die daraus resultierende CBRb-Maus-Modell ermöglicht eine vorübergehend geregelten Dox-vermittelten RB1 Verordnung². Der Vorteil der Verwendung eines Proteom-basierten Ansatzes Genfunktion zu studieren ist, dass es für jedes Gen von Interesse, mit minimalen Informationen über seine Tätigkeit angenommen werden kann.

Die vorgeschlagene DN-Transgen-Strategie bietet viele Vorteile gegenüber herkömmlichen Ansätzen. Erstens führt DN Protein Hemmung zu nur ein teilweiser Ablation Proteinaktivität, um ein passives endogenen Ausdruck. Ein solches Ergebnis ist höchst wünschenswert, in Situationen, wo eine vollständige Beseitigung der Proteinaktivität zu embryonalen Tödlichkeit führt, stark begrenzen jeder Untersuchung um Genfunktion in einer live Maus zu untersuchen. Zweitens ermöglicht die Präsenz des Systems der TetO Transgen Aktivierung nur in Anwesenheit eines Antibiotikums, die für eine effiziente und reversible Kontrolle der Transgen-Aktivität ermöglicht. So durch Beendigung der Antibiotika-Administration, die transgenen System kann deaktiviert werden, und ein normaler RB1 Ausdruck ist wieder an Ihrem Platz. Drittens kann der Veranstalter der Wahl die Spezifität des Transgens Ausdrucks abhängig. Während wir die allgegenwärtigen ROSA-CAG-Promoter für Proof of Principle gewählt haben, dürfte Platzierung des Transgens unter gewebespezifischen Promoter, Studien über die therapeutische Anwendung von diesem Transgen zu unerwünschten Transgene Ausdruck zu beschränken Methodik.

Protokoll

Generation der transgenen CBRb Maus und alle Tierpflege Experimente im Zusammenhang mit der Studie wurden genehmigt von der Creighton Universität institutionelle Tier Pflege und Nutzung Committee (IACUC) und durch ihre Richtlinien durchgeführt.

(1) transgenen CB-Myc₆-Rb1 Konstrukt

Hinweis: Das Klonen von CBRb in einen Vektor pTet_Splice erfolgte in mehreren Schritten (Abb. 1A und 1 b).

1. Führen Sie die erste Stufe Klonen in der pCS2 + CB-Myc6 Vektor.
   1. CBRb Transgen Konstrukt zu schaffen, zu verstärken 1583-bp lange Rb1 cDNA Fragment (528 Aminosäuren entsprechend der Aminosäure Region 369 – 896) des RB1 Proteins mit Hilfe des folgenden Primers festgelegt: für EcoRI +RB 1243F, verwenden GGGGAATTCA TTAAATTCAGCAAGTGATCAACCTTC, und verwenden Sie für XbaI + EcoRV +RB 2826R, CCCTCTAGATATCTATTTGGACTCTCCTGGGAGATGTTTACTTCC.
   2. Klon des Fragments (1546-bp) zwischen EcoR1 und XbaI Restriktionsschnittstellen des pCS2 + CB-Myc6 Vektor als zuvor beschriebenen^1,12erzeugt.
      Hinweis: 1012-bp-langen CB-Myc6 Konstrukt (337 Aminosäuren) auf das Rb1 -Fragment fusioniert resultierte in einem Protein ca. 865 Aminosäuren (etwa 108 kDa), die etwas kleiner als die endogene RB1-Protein (~ 110 kDa) ist (Abbildung 1 Ein), mit einem CB-Myc₆ Tag am N-Terminus und Rb1 am C-Terminus.
2. Führen Sie die zweite Stufe subcloning in den pTet-Spleiß-Vektor.
   1. Die CB-RB-Myc6-Fusion-Fragment zu verstärken und die Tet-Förderer zu gewinnen, verstärken die Kassette, bestehend aus der CB-myc6-Rb1 mit Primer, enthält die EcoRV (XbaI + EcoRV + RB 2826R) und SalI Websites: für SalI +CBF Verwenden Sie CCAGTCGACAGGATGTGGTGGTCCTTGATCCTTC.
   2. Subclone das Fragment erzeugt (2567 bp) in den pTet-Spleiß-Vektor zwischen SalI und EcoRV Restriktionsschnittstellen, so eine Art und Weise, die das gesamte TetO-DN-CB-myc6-Rb1 Transgen, einschließlich der SV40-Intron und der PolyA signalisieren, können durch einen einzigen Verdauung mit NotI (Abbildung 1B) isoliert werden.
      Hinweis: Das NotI-Fragment wurde verwendet, um die transgenen Geldgeber zu generieren.

(2) in vitro-Tests des Transgens TetO-DN-CB-myc6-Rb1

1. DOX-Verordnung: NIH3T3 Zelllinie
   Hinweis: Sofern nicht anders angegeben, sind alle Volumes für eine 6-Well-Platte angepasst worden.
   1. Wachsen Sie NIH3T3 Zellen nach Vorgaben des Herstellers, unter Verwendung der empfohlenen Zellkulturmedien, enthält 10 % fötalen Rinderserum bei 37 ° C mit 10 % CO₂.
   2. Cotransfect die Zellen mit pTet-Spleiß und pCMV-Tet3G Vektoren (aus Schritt 1) für 24 h die Schritte unten zum Cotransfection erwähnt.
      1. Mischen Sie 2 – 4 µL der Lipid-basierte Transfection Reagens/Brunnen und 1 mL der unvollständig (ohne Serum) Dulbecco geändert Eagle Medium (DMEM) für 5 min bei Raumtemperatur. Für ein 12 oder 24-Well-Platte 250 oder 500 µL Kulturmedien, bzw. verwenden, und die Lautstärke Transfection Reagens entsprechend.
      2. Die Transfektion Reagenz-DMEM 2 – 3 µg von Plasmid DNA/Well hinzufügen und 20 min bei Raumtemperatur inkubieren.
      3. Fügen Sie die Mischung mit DNA und die Transfection Reagens in DMEM in jede Vertiefung. Fügen Sie nach 3 – 4 h Inkubation 1 mL der komplette Medien (so dass der letzte Band 2 mL/gut ist). Halten Sie Aliquote Dox Aktie (1 mg/mL) und fügen Sie 2 µL in jedem der Brunnen (+ Dox hinzu). Inkubation der Zellen bei 37 ° C mit 5 % CO₂.
         Hinweis: Kontrollproben sollte bestehen aus cotransfected Zellen, die nicht mit Dox behandelt (-Dox), sowie NIH3T3 Zellen nur mit der Transaktivator pCMV-Tet3G Vektor transfiziert und 24 h lang mit Dox behandelt. Für pCMV-Tet3G, Konzentrationen von 0,1 – 1 µg/mL Dox sollte ausreichen, um die Expression des Transgens zu induzieren.
2. Testen Sie die Reversibilität des Konstrukts mit HEK293-Zelllinie.
   1. Test der Reversibilität des Transgens TetO-DN-CB-myc6-Rb1 Kultur HEK293 Zellen in Adlers Minimum wesentliches Medium (EMEM) nach Vorgaben des Herstellers und cotransfect mit pTet-Spleiß und pCMV-Tet3G Vektoren für 24 h, wie beschrieben oben (Schritt 2.1.2).
   2. Entfernen Sie für die Transgen-Inaktivierung das Dox-haltigen Medium nach 24 h, waschen Sie die Zellen 2 x-3 x mit Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) und inkubieren sie im Dox-freie Medien für weitere 24 h.
      Hinweis: Bei Dox-entfernen sollte das Transgen Inaktivierung und regelmäßige Proteinexpression innerhalb dieser 24-Stunden-Frist wieder aufgenommen werden.
3. Um die Funktionalität des Konstrukts TetO-DN-CB-myc6-Rb1 in Förderung der ungeplante Zellproliferation zu beurteilen, führt die funktionelle Untersuchungen mit einer HEI-OC1 Zelllinie wie unten beschrieben.
   1. HEI-OC1 Zellkulturen in 10 % DMEM unter freizügigen Bedingungen (33 ° C mit 10 % CO₂). Zählen Sie für Zell-Proliferation Studien die Zellen mit einer Zelle-Theke und Platte 10.000 HEI-OC1 Zellen auf einer 96-Well-Platte in einem Volumen von 200 µL. Inkubieren Sie die Zellen über Nacht.
   2. Am folgenden Tag, führen Sie eine transiente Cotransfection pTet-Spleiß und pCMV-Tet3G Vektoren mit einem Lipid-basierte Transfection Reagens (siehe Schritte 2.1.2). Führen Sie in einem separaten gut PmR-ZsGreen1 Transfektion at2-µg mit Lipid-basierte Transfection Reagens (Schritte 2.1.2) zum Berechnen der Transfektion Rate. Verwenden Sie nicht transfizierten Zellen als Steuerelemente.
   3. Das Vorhandensein von grün fluoreszieren unter dem Fluoreszenzmikroskop (Erregung = 485 nm, Emission = 530 nm) für den transfizierten Zellen 24 h nach Transfektion. Zeichnen Sie das Vorhandensein oder Fehlen der grüne Fluoreszenz und berechnen Sie die Rate der Transfektion als die Gesamtzahl der GFP-positiven Zellen (transfizierten Zellen) über die Zellen mit DAPI (total Zellen) gekennzeichnet.
      Hinweis: Eine Transfektion Rate von ~ 70 % geschätzt.
   4. Um Transgene Ausdruck zu induzieren, hinzufügen 1 µg/mL Dox auf eine Teilmenge von transfizierten Zellen während der Verwendung der anderen Teilmenge als Kontrolle (-Dox). Verwenden Sie unbehandelte HEI-OC1 Zellen als zusätzliche Steuerelemente.
   5. Zur Beurteilung der Zellproliferation verwenden Sie eine Zelle Verbreitung Kit laut Protokoll des Herstellers.
      1. Kurz gesagt, 48 h nach Transfektion, entfernen das Zellkulturmedium und 100 µL 1 x Farbstoff-verbindliche Lösung in jede Vertiefung der Mikrotestplatte. 1 h bei 37 ° c inkubieren
      2. Danach messen der Fluoreszenzintensität jeder Probe mit einem Fluoreszenz Mikrotestplatte Reader (Erregung = 485 nm, Emission = 530 nm).
   6. Um Zellproliferation mit Immunocytochemistry weiter zu bewerten, die HEI-OC1 Zellen auf einem Deckglas in einem 12-Well-Platte-Platte und über Nacht bei 37 ° c inkubieren
      1. Am nächsten Tag mit dem pTet-Spleiß und pCMV-Tet3G cotransfect und führen Sie die Dox Behandlung (+ Dox). Verwenden Sie untransfected Zellen als Steuerelemente. Am Prozess HEI-OC1 Zellen für die Kennzeichnung von Ki-67.
      2. Befestigen Sie die Zellen mit 4 % Paraformaldehyd (PFA) mit PBS-Puffer, pH 7,4, für 10 min bei Raumtemperatur. Waschen Sie die Zellen 3 X mit eiskaltem PBS und die Zellen in 0,25 % nicht-ionische Reinigungsmittel mit PBS-Puffer für 10 min inkubieren.
      3. Waschen Sie die Zellen wieder, 3 X mit PBS-Puffer für 5 min und Block mit 10 % Serum in eine feuchte Kammer für 1 h bei Raumtemperatur.
      4. Die Zellen in 500 µL der Ki-67 Primärantikörper (Verdünnung 1: 200) für 3 h bei Raumtemperatur inkubieren oder über Nacht bei 4 ° C.
      5. Waschen Sie die Zellen 3 X 5 min. mit PBS. Danach Inkubation der Zellen mit dem sekundären Antikörper für 1 h bei Raumtemperatur im Dunkeln.
      6. Die sekundäre Antikörper-Lösung entfernen und Waschen der Zellen 3 X mit PBS für 5 min in der Dunkelheit.
      7. Brüten Sie für Phalloidin etikettieren die HEI-OC1 Zellen in 1: 200 Phalloidin für 30 min. Um den Kernen der Zellen zu beschriften, inkubieren Sie die Zellen mit 5 µg/mL DAPI für 10 min bei Raumtemperatur.
         Hinweis: Sicherstellen Sie, dass Phalloidin Farbstoff Konjugat Sekundärantikörpers konjugiert unterscheidet.

3. Generation der CBRb⁺/ROSA-CAG-rtTA⁺ (CBRb) transgenen Mäusen und In Vivo Tests des DN-CBRb Ansatzes

1. Nach Bestätigung der wirksamen Dox-Regulierung des Transgens TetO-DN-CB-myc6-Rb1 reinigen das NotI-Fragment und microinject sie in Maus Zygoten, die später in Pseudo-trächtige Weibchen übertragen werden.
   Hinweis: Diese Verfahren wurden an der University of Nebraska Medical Center (UNMC) Maus Genom Engineering Core Facility durchgeführt.
2. Nach der Geburt die Welpen mit einer Grundierung der CB-Rb1 Fusion Region bestimmten soll Genotyp: für CBRb F, verwenden Sie 3 von 5' CTGTGGCATTGAATCAGAAATTGTGGCTGG ' und für CBRB R, 3 ' 5 ' GTACTTCTGCTATATGTGGCCATTACAACC.
   Hinweis: Die PCR-Produkt-Größe auf Agarosegel beobachtet ist 401 bp (60-bp CB Region + 341-bp Rb1 Region (Tabelle 1). Zehn unabhängige Gründer Linien wurden identifiziert, abhängig vom Vorhandensein des Transgens TetO-DN-CB-myc6-Rb1 . In fünf dieser Linien vererbt Nachkommen das Transgen, das die Keimbahn-Übertragung des Transgens bestätigt. Letztlich diente eines transgenen Linien schaffen und pflegen die Linie und Versuchstieren TetO-DN-CB-myc6-Rb1 für weitere Studien zu generieren.
3. Züchten Sie Erwachsener TetO-DN-CB-myc6-Rb1 Mäuse auf die ROSA-CAG-RtTA Tetracyclin-Induktor Linie (Lager #006965) (Alternativ Zucht zu einer tTA Induktor Linie) um experimentelle DN-CBRb Mäuse zu erzeugen. Genotyp Nachkommen dieses Kreuz mit der folgenden Grundierung: verwenden Sie für RtTA-WT R, GGAGCGGGAGAAATGGATATG; Verwenden Sie für RtTA Mutant R GCGAGGAGTTTGTCCTCAACC; und für gemeinsame RtTA, AAAGTCGCTCTGAGTTGTTAT. Die PCR-Produkt-Größen sind 340 bp (Mutanten), 340 bp und 650 bp (heterozygot) und 650 bp (Wildtyp).
4. Erstellen einer Dosis-Wirkungs-Kurve des RB1 Proteins nach der Dox Behandlung zu bestimmen, die Zeit und Dauer der Dox Behandlung notwendig, einen Transgene Ausdruck zu entlocken.
   Hinweis: In diesem Experiment wurden western-Blot und qRT-PCR zur gewebespezifischen Transgene Aktivierung und RB1 Ausdruck zu bewerten.
5. Führen Sie durch Fluoreszenz in Situ Hybridisierung (FISH), die genomische Einfügung des Transgens zu bestätigen.
   Hinweis: Dies wurde im Zentrum für angewandte Genomik des Spitals für kranke Kinder (Toronto, Kanada) durchgeführt. ELISA oder western Blot (mit Protein-spezifischen Antikörper) lässt sich die Transgen-Aktivierung, Gewebespezifität und Änderungen in den Ebenen des endogenen POI zu beurteilen. Für das DN-CB-myc6-Rb1 -Konstrukt haben wir einen Anti-RB1-Antikörper verwendet.

Ergebnisse

Entwerfen einer DN Mutation erfordert in der Regel, eine beträchtliche Menge von Informationen über die Struktur und Funktion des POI. Im Gegensatz dazu ist die DN-Strategie hier vorgestellten besonders nützlich, wenn die strukturelle und funktionelle Informationen für die POI begrenzt ist. Wenn der POI ein Multimeric Protein ist, eine Verschmelzung von einer Untereinheit zu einer lysosomalen Protease kann dominant hemmen die montierten Multimer und unter Umständen andere Liganden du...

Diskussion

Um die Grenzen verbunden mit traditionellen transgene Strategien zu umgehen, haben wir versucht, ein Mausmodell zu generieren, in denen eine endogene POI bedingt inaktiviert durch ein DN mutierte Form des es in gewissem Sinne raumzeitlichen überexprimiert. Um die Funktion des endogenen POIs abschaffen zu können, wurden mehrere Optionen vorgeschlagenen^15,16,17. Durch die Kombination der Dox-abhängige transkriptionellen Systems...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco's Modified Eagle's Medium, DMEM	GIBCO-BRL	11965-084
Minimum Essential Medium Eagle, MEME	Sigma	M8042
Fetal bovine serum	Sigma	F2442
Lipofectamine	DharmaFECT	T-2010-03
Sal I	Roche	11745622
EcoRV-HF	New England BioLabs	R3195S
NotI	Roche	13090730
CaspaTag	Millipore	APT523
DAPI	Sigma	D9542
Staurosporine	Sigma	S4400
CyQuant NF cell proliferation kit	Invitrogen	C35007
Retinoblastoma 1 antibody	Abcam	Ab6075
c-Myc antibody	Sigma	M5546
b-actin	Sigma	A5316
Ki-67	Thermofisher scientific	MA5-14520
Phallodin	Thermofisher scientific	A12379
Fluorescence microplate reader	FLUOstar OPTIMA, BMG Labtech
Epifluorescence microscope	NikonEclipse80i
The TetO-DN-CB-myc6-Rb1 (DN-CBRb) mouse line is available from the Jackson Laboratory as JAX#032011.