JoVE Logo
Auteurs
Contactez-nous

S'identifier

Un abonnement à JoVE est nécessaire pour voir ce contenu. Connectez-vous ou commencez votre essai gratuit.

Dans cet article

  • Résumé
  • Résumé
  • Introduction
  • Protocole
  • Résultats
  • Discussion
  • Déclarations de divulgation
  • Remerciements
  • matériels
  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

Nous présentons ici un protocole visant à développer un système inductible dominant négatif, dans lequel toute protéine peut être inactivée conditionnellement par réversiblement surexprimant une version mutante dominant négatif de celui-ci.

Résumé

Inhibition de protéine dominant négatif (DN) est une méthode puissante pour manipuler la fonction des protéines et offre plusieurs avantages par rapport aux autres approches axées sur la génomique. Par exemple, bien que chimérique et Cre-LoxP stratégies de ciblage ont été largement utilisés, les limitations intrinsèques de ces stratégies (activité du promoteur qui fuit, expression de Cre de mosaïque, etc.) ont considérablement restreint leurs demande. En outre, un effacement complet de nombreux gènes endogènes est une létalité embryonnaire, rendant impossible d’étudier la fonction du gène dans la vie postnatale. Pour relever ces défis, nous avons apporté des changements importants à un protocole de génie génétique précoce et combiné (transgénique) version courte du gène Rb1 avec une protéase lysosomale B procathepsin (CB), générer un modèle de souris DN de Rb1 (CBRb). En raison de la présence d’une protéase lysosomale, la protéine de fusion CB-RB1 entière et son interaction complexe sont acheminés pour dégradation induite par le protéasome. En outre, la présence d’un élément inducteur (rtTA) de tétracycline dans la construction transgénique permet une régulation inductible et réversible de la protéine RB1. La présence d’un promoteur de ROSA-CAG omniprésent dans le modèle de souris CBRb rend un outil utile pour procéder à l’ablation de gène Rb1 transitoire et réversible et de fournir aux chercheurs une ressource pour comprendre son activité dans pratiquement n’importe quel type de cellules où la RB1 est exprimé.

Introduction

La plupart des approches visant à l’ablation des gènes et des protéines s’appuient sur des processus permanents, qui se traduisent généralement par l’élimination complète ou la troncation de la gène, de séquences d’ARN ou protéine d’intérêt (POI). L’objectif général de cette méthode est à l’ingénieur une protéine recombinante pour l’abolition de la fonction des protéines endogènes, sauvage. Nous avons revu et remanié une stratégie alternative1,2, qui permet l’ablation temporaire d’un POI par inhibition de la DN. Cette méthode fonctionne pour les multimères et peptides monomères mais est plus adaptée pour les protéines qui fonctionnent dans une assemblée de multimères.

La méthode consiste à fusionner la protéase lysosomale CB à une sous-unité d’un multimériques POI (complexe de fusion de CB). La résultante complexe de fusion CB peut interagir avec et clivage protéolytique digérer la protéine endogène ou détourner l’ensemble CB-POI pour le lysosome être dégradées3. En outre, une combinaison de la fusion de CB complexe avec le caractère inductible du système contrôlé par tétracycline l’activation transcriptionnelle (Fifi) permet une expression inductible et contrôlée du transgène dans un mode réversible2. Bien qu’utiles dans de nombreuses circonstances, la suppression complète des gènes ou des protéines in vivo peut entraîner la létalité4,5,6. De même, tissu-spécifique, conditionnelle délétion de certains gènes ou les protéines utilisant le système Cre-Lox ne peut pas être simple, comme elle, en fin de compte, entraînera la perte permanente des éléments critiques de génomique7. Par conséquent, selon le gène ou POI, aucune de ces approches seront efficaces en fournissant un modèle utile pour des études ultérieures, en particulier des gènes ou des protéines des études fonctionnelles chez les souris adultes et postnatals fin.

Pour contourner les problèmes liés à ces approches et fournir preuve de principe sur l’efficacité de la méthode proposée, nous avons choisi de tester la méthode présentée ici en générant une version DN conditionnelle de la protéine du rétinoblastome 1 (RB1). Plusieurs options ont été proposées8,9,10 à abolir la fonction de RB1 endogène ; Cependant, chacun d’eux fait face à certaines limitations mêmes discutées plus haut : suppression de cellules germinales permanente de RB1 est mortelle embryonnaire et, conforme à son rôle de suppresseur de tumeur, permanente RB1 suppression conditionnelle mène à une variété de tumeurs11. Même si une version DN de RB1 ne semble pas se produire naturellement, une meilleure alternative pour les stratégies actuellement disponibles devrait permettre une inactivation temporellement contrôlée de la RB1 endogène et prévoient un autre mécanisme pour finalement restaurer sa fonction. La base d’une telle construction a été décrite il y a plus de vingt ans1. Toutefois, en raison des limitations technologiques, il lui manquait un mécanisme d’activation de transgène de contrôle, d’intervention et spécificité tissulaire. Cette étude est le premier à combiner l’élégance de la doxycycline (Dox)-système transcriptionnelle dépendant par une ingénierie construction transgénique de protéines de CB et Rb1 protéases lysosomales. Le modèle de souris CBRb qui en résulte permet une RB1 temporairement réglementée de Dox-mediated règle2. L’avantage d’utiliser une approche axée sur le protéome pour étudier la fonction du gène est qu’il peut être adopté pour n’importe quel gène d’intérêt, avec un minimum d’informations sur son activité.

La stratégie proposée du transgène DN offre de nombreux avantages par rapport aux approches traditionnelles. Tout d’abord, l’inhibition de protéine DN mène à seulement une ablation partielle en activité de la protéine, préservant ainsi une expression endogène résiduelle. Un tel résultat est hautement souhaitable dans des situations où une élimination complète de l’activité de la protéine entraîne une létalité embryonnaire, limitant grandement toute enquête pour étudier la fonction des gènes dans une souris vivante. En second lieu, la présence du système TetO permet l’activation du transgène qu’en présence d’un antibiotique, ce qui permet un contrôle efficace et réversible de l’activité du transgène. Ainsi, en cessant l’administration d’antibiotiques, le système transgénique peut être désactivé, et une expression normale de la RB1 est remis en place. En troisième lieu, la spécificité de l’expression de transgènes peut varier selon le promoteur de choix. Alors que nous avons choisi le promoteur omniprésent de ROSA-CAG pour preuve de principe, plaçant le transgène sous un promoteur spécifique aux tissus est susceptible de restreindre l’expression transgénique non désirées et de faciliter les études sur l’application thérapeutique de ce transgène méthodologie.

Protocole

Génération de la souris transgénique de CBRb et tous les soins aux animaux et expériences liées à l’étude ont été approuvés par l’Université Creighton institutionnels, protection des animaux et utilisation Comité (IACUC) et effectué par des lignes directrices.

1. transgéniques CB-Myc6-Rb1 Construct

Remarque : Le clonage de CBRb dans un vecteur de pTet_Splice a été fait dans un processus en plusieurs étapes (Figure 1 a et 1 b).

  1. Effectuer le premier clonage d’étape dans le Bureau2 + vecteur CB-Myc6.
    1. Pour créer la construction du transgène CBRb, amplifier un fragment de cDNA de Rb1 1583-bp-long (528 acides aminés correspondant à la zone de l’acide aminé 369 – 896) de la protéine RB1 utilisant l’amorce suivante jeu : pour EcoRI +RB 1243F, utilisez GGGGAATTCA TTAAATTCAGCAAGTGATCAACCTTCet XbaI + EcoRV +RB 2826R, utilisez CCCTCTAGATATCTATTTGGACTCTCCTGGGAGATGTTTACTTCC.
    2. Clone le fragment généré (bp 1546) entre les sites de restriction EcoR1 et XbaI du Bureau2 + vecteur CB-Myc6 comme décrit précédemment1,12.
      Remarque : La construction de la CB-Myc6 1012-bp-long (337 aminoacides) fusionnée au fragment Rb1 a donné lieu à une protéine d’environ 865 acides aminés (environ 108 kDa), qui est légèrement plus petite que la protéine RB1 endogène (~ 110 kDa) (Figure 1 Un), avec une étiquette de6 CB-Myc à l’extrémité N-terminale et Rb1 à l’extrémité C-terminale.
  2. Effectuer la deuxième étape subcloning dans le vecteur pTet-épissure.
    1. Pour amplifier le fragment de fusion CB-RB-Myc6 et d’acquérir le Tet-promoteur, amplifient la cassette, consistant en la CB-myc6-Rb1 en utilisant des amorces contenant les EcoRV (XbaI + EcoRV + RB 2826R) et les sites de SalI : pour SalI +CBF, Utilisez CCAGTCGACAGGATGTGGTGGTCCTTGATCCTTC.
    2. Subclone le fragment généré (2567 bp) dans le vecteur pTet épissure, entre les sites de restriction SalI et EcoRV , de telle manière que le transgène TetO-DN-CB-myc6-Rb1 entière, y compris l’intron SV40 et la PolyA signal, peuvent être isolés par une simple digestion avec NotI (Figure 1B).
      Remarque : Le fragment de NotI a été utilisé pour générer les bailleurs de fonds transgéniques.

2. in Vitro test du transgène TetO-DN-CB-myc6-Rb1

  1. Dox-règlement : Lignée de cellules NIH3T3
    Remarque : Sauf indication contraire, tous les volumes ont été ajustées pour une plaque 6 puits.
    1. La croissance de cellules NIH3T3 conformément aux spécifications du vendeur, en utilisant les milieux de culture de cellule recommandée contenant du sérum de veau fœtal de 10 % à 37 ° C, avec 10 % de CO2.
    2. Cotransfect les cellules avec épissure pTet et vecteurs cmvp-Tet3G (de l’étape 1) pendant 24 h. suivent les étapes mentionnées ci-dessous pour analyse.
      1. Mélanger 2 – 4 µL de réactif/puits transfection à base de lipides et 1 mL de Dulbecco incomplète (sans sérum) modifié Eagle (DMEM) pendant 5 min à température ambiante. Pour une plaque de 12 ou 24 puits, utiliser 250 ou 500 µL de milieux de culture, respectivement et régler le volume de réactif de transfection en conséquence.
      2. Ajouter 2 à 3 µg de plasmide ADN/puits dans le réactif de transfection-DMEM et incuber pendant 20 min à température ambiante.
      3. Ajoutez le mélange contenant l’ADN et le réactif de transfection dans DMEM dans chaque puits. Après 3 – 4 h d’incubation, ajouter 1 mL de médias complet (de sorte que le volume final est de 2 mL/puits). Gardez les aliquotes de Dox stock (1 mg/mL) et ajouter 2 µL dans chacun des puits (+ Dox). Incuber les cellules à 37 ° C, avec 5 % de CO2.
        Remarque : Échantillons de contrôle doivent être composé de cellules cotransfectés non traités par Dox (-Dox), ainsi que les cellules NIH3T3 transfectées seulement avec le vecteur de cmvp-Tet3G transactivateur et traitement par Dox pendant une période de 24h. Pour cmvp-Tet3G, les concentrations de 0,1 et 1 µg/mL Dox devrait être suffisante pour induire l’expression du transgène.
  2. Tester la réversibilité de la construction à l’aide de la lignée de cellules HEK293.
    1. Pour tester la réversibilité du transgène TetO-DN-CB-myc6-Rb1 , cellules HEK293 en culture dans la moyen essentiel d’aigle-Minimum (EMEM) conformément aux spécifications du vendeur et cotransfect avec les vecteurs d’épissure pTet tant cmvp-Tet3G pendant 24 h, tel que décrit (étape 2.1.2) ci-dessus.
    2. Pour l’inactivation du transgène, retirez le support contenant Dox après 24h, laver le cellules 2 de x x-3 avec du sérum physiologique tamponné au phosphate (PBS) et les incuber dans des milieux sans Dox pendant 24 h supplémentaires.
      Remarque : Lors du retrait-Dox, le transgène inactivation et l’expression de la protéine régulière devraient être repris dans ce délai de 24h.
  3. Afin d’évaluer les fonctionnalités de la construction de TetO-DN-CB-myc6-Rb1 dans la promotion de la prolifération cellulaire non programmée, effectuer des analyses fonctionnelles, à l’aide d’une lignée de cellules de HEI-OC1, tel que décrit ci-dessous.
    1. Dans 10 % des cellules de culture HEI-OC1 DMEM sous permissive des conditions (33 ° C avec 10 % de CO2). Pour les études de prolifération cellulaire, compter les cellules à l’aide d’un compteur de cellules et les cellules de HEI-OC1 plaque 10 000 sur une plaque à 96 puits en un volume de 200 µL. Incuber les cellules pendant la nuit.
    2. Le lendemain, effectuer une analyse transitoire des vecteurs pTet épissure et cmvp-Tet3G à l’aide d’un réactif à base de lipides transfection (voir étapes 2.1.2). Dans un endroit bien distinct, effectuer des pmR-ZsGreen1 transfection at2-µg en utilisant le réactif de transfection à base de lipides (étapes 2.1.2) pour calculer le taux de transfection. Utiliser les cellules non transfectées comme témoins.
    3. Détecter la présence d’une fluorescence verte sous un microscope à fluorescence (excitation = 485 nm ; émission = 530 nm) pour le transfectées cellules 24h après la transfection. Enregistrer la présence ou l’absence de fluorescence verte et calculer le taux de la transfection, le nombre total de cellules (cellules transfectées) de la GFP-positives sur les cellules marquées au DAPI (cellules totales).
      Remarque : Nous avons estimé un taux de transfection d’environ 70 %.
    4. Pour induire l’expression du transgène, ajouter 1 µg/mL Dox à un sous-ensemble de cellules transfectées tout en utilisant l’autre sous-ensemble comme contrôle (-Dox). Utiliser des cellules de HEI-OC1 non traitées comme des contrôles supplémentaires.
    5. Pour évaluer la prolifération des cellules, utilisez un kit de prolifération cellulaire selon le protocole du fabricant.
      1. En bref, 48 h après la transfection, enlevez le milieu de culture cellulaire et ajouter 100 µL de solution de colorant-liaison 1 x dans chaque puits de la microplaque. Incuber pendant 1 heure à 37 ° C.
      2. Par la suite, mesurer l’intensité de la fluorescence de l’échantillon à l’aide d’un lecteur de microplaques de fluorescence (excitation = 485 nm ; émission = 530 nm).
    6. Pour évaluer plus précisément la prolifération des cellules à l’aide d’immunocytochimie, les cellules de HEI-OC1 sur une lamelle couvre-objet dans une plaque de 12 puits de la plaque et incuber une nuit à 37 ° C.
      1. Le lendemain, cotransfect avec le pTet épissure et cmvp-Tet3G et exécuter le traitement Dox (+ Dox). Utiliser les cellules celllulaire comme témoins. Cellules de HEI-OC1 process pour l’étiquetage de Ki-67.
      2. Fixer les cellules avec 4 % de paraformaldéhyde (PFA) dans du PBS, pH 7,4, pendant 10 min à température ambiante. Laver les cellules 3 x avec PBS glacée et incuber les cellules dans un détergent non ionique 0,25 % dans du PBS pendant 10 min.
      3. Laver les cellules encore une fois, 3 fois en PBS pendant 5 min et bloc à l’aide de 10 % de sérum dans une chambre humidifiée pendant 1 h à température ambiante.
      4. Incuber les cellules de 500 µL d’anticorps primaire de Ki-67 (dilution 1 : 200) pendant 3 h à température ambiante ou pendant la nuit à 4 ° C.
      5. Laver les cellules 3 x pendant 5 min avec du PBS. Après cela, incuber les cellules avec l’anticorps secondaire pendant 1 h à température ambiante dans l’obscurité.
      6. Enlever la solution de l’anticorps secondaire et laver les cellules 3 x avec PBS de 5 min chacun, dans l’obscurité.
      7. Pour l’étiquetage de la phalloïdine, incuber les cellules HEI-OC1 au 1 : 200 phalloïdine pendant 30 min. Pour étiqueter les noyaux des cellules, incuber les cellules avec 5 µg/mL DAPI pendant 10 min à température ambiante.
        Remarque : Assurez-vous que le conjugué de colorant phalloïdine est différent que le conjugué d’anticorps secondaire.

3. génération de CBRb+/ROSA-CAG-rtTA+ (CBRb) des souris transgéniques et In Vivo, essais de l’approche de DN-CBRb

  1. Lors de la confirmation d’une réglementation effective du transgène TetO-DN-CB-myc6-Rb1 Dox, purifier le fragment NotI et leur microinject en zygotes de souris, qui sont ensuite transférés dans les femelles pseudo-gestantes.
    Remarque : Ces procédures ont été menées à l’University of Nebraska Medical Center (UNMC) souris centre génomique de l’ingénierie Core.
  2. Après l’accouchement, les chiots utilisant une amorce la valeur spécifiques à la région de fusion CB-Rb1 le génotype : pour CBRb F, utilisez 5' CTGTGGCATTGAATCAGAAATTGTGGCTGG 3′ et CBRB R, 5′ GTACTTCTGCTATATGTGGCCATTACAACC 3′.
    Remarque : La taille du produit PCR sur gel d’agarose est 401 bp (région de CB 60-bp + région de Rb1 341-pb (tableau 1). Une dizaine de lignes fondateur indépendant ont été identifiés, basée sur la présence du transgène TetO-DN-CB-myc6-Rb1 . Dans cinq de ces lignes, la progéniture a hérité du transgène, qui a confirmé la transmission de la lignée germinale du transgène. Une des lignées transgéniques a été finalement utilisée pour l’établir et de maintenir la ligne et de générer des animaux de laboratoire TetO-DN-CB-myc6-Rb1 pour poursuivre ses études.
  3. Se reproduisent des souris adultes de TetO-DN-CB-myc6-Rb1 jusqu'à la ligne d’inducteur tétracycline ROSA-CAG-rtTA (Stock #006965) (alternativement, race à une ligne d’inducteur de tTA) pour générer des souris de DN-CBRb expérimentales. Génotype de la progéniture de cette croix à l’aide de l’ensemble suivant d’apprêt : usage rtTA-WT R, GGAGCGGGAGAAATGGATATG ; pour rtTA Mutant R, utiliser GCGAGGAGTTTGTCCTCAACC ; et pour rtTA commun, utilisez AAAGTCGCTCTGAGTTGTTAT. Les tailles de produit PCR sont 340 bp (mutant), 340 bp et 650 bp (hétérozygote) et 650 bp (type sauvage).
  4. Générer une courbe dose-réponse de la protéine RB1 après le traitement de Dox pour déterminer l’heure et la durée du traitement Dox nécessaire pour obtenir une expression du transgène.
    Remarque : Dans cette expérience, la tache occidentale et qRT-PCR ont été utilisés pour évaluer l’activation spécifique aux tissus transgene et RB1 expression.
  5. Effectuer l’hybridation in situ par fluorescence (FISH) pour confirmer l’insertion génomique du transgène.
    Remarque : Cela a été réalisée au Centre de génomique appliquée de l’Hospital for Sick Children (Toronto, Canada). ELISA ou western blot (à l’aide de protéines spécifiques anticorps) peut être utilisé pour évaluer l’activation du transgène, spécificité tissulaire et des changements dans les niveaux de l’IPE endogène. Pour la construction de DN-CB-myc6-Rb1 , nous avons utilisé un anticorps anti-RB1.

Résultats

En règle générale, concevoir une mutation DN nécessite une quantité considérable d’informations sur la structure et la fonction du POI. En revanche, la stratégie de DN présentée ici est particulièrement utile lorsque les informations structurales et fonctionnelles pour le POI sont limitées. Si le pi est une protéine de multimères, une fusion d’une sous-unité d’une protéase lysosomale peut inhiber principalement les multimères assemblé et, éventuellement, d’autres...

Discussion

Afin de contourner les limitations associées à des stratégies traditionnelles de transgéniques, nous avons cherché à créer un modèle de souris dans lequel un POI endogène peut être inactivé conditionnellement en surexprimant une forme mutante de DN de celui-ci d’une manière spatio-temporelle. Pour l’abolition de la fonction de POI endogène, plusieurs options ont été proposées15,16,17. Nous avons modifié une ...

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Le Bureau2 + CB-Myc6 vector est un cadeau de Marshall Horwitz (University of Washington, Seattle, WA, é.-u.). Les cellules de HEI-OC1 ont été gracieusement fournis par Fedrico Kalinec (David Geffen School of Medicine, UCLA, Los Angeles, CA, é.-u.). Support technique a été fourni par l’UNMC souris Genome Engineering Core (C.B. Gurumurthy, Don Harms, Rolen Quadros) et la Creighton University intégré Biomedical Imaging Facility (Richard Hallworth, John Billheimer). Le génie du génome de souris UNMC a été soutenue par une bourse de développement institutionnel (IDea) de la NIH/NIGM, accorder le numéro P20 GM103471. La fonction intégrée Biomedical Imaging était soutenue par la Creighton University School of Medicine et subventions GM103427 et GM110768 de la NIH/NIGM. L’installation a été construite avec l’aide de subventions du National Center for Research Resources (RR016469) et la NIGM (GM103427). Les lignées de souris générées dans cette étude ont été maintenues à un centre de ressources de l’Université de Creighton Animal, dont l’infrastructure a été améliorée grâce à une subvention de NIH/RRRNC G20RR024001. Ce travail a reçu au-delà de prise en charge via un NIH/RRRNC 5P20RR018788-/ NIH/NIGM 8P20GM103471 COBRE accorder (à Shelley D. Smith), NIH/ORIP R21OD019745-01 a 1 (s.-S.) et une subvention de recherche émergents de la fondation de santé auditive (à S. Normand). Le contenu de cette recherche est la seule responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement l’opinion officielle de la National Institutes of Health.

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
Dulbecco's Modified Eagle's Medium, DMEMGIBCO-BRL11965-084
Minimum Essential Medium Eagle, MEME Sigma M8042
Fetal bovine serumSigma F2442 
Lipofectamine DharmaFECTT-2010-03
Sal IRoche11745622
EcoRV-HFNew England BioLabsR3195S
NotIRoche13090730
CaspaTag MilliporeAPT523
DAPISigma D9542
StaurosporineSigma S4400
CyQuant NF cell proliferation kit InvitrogenC35007
Retinoblastoma 1 antibodyAbcamAb6075
c-Myc antibodySigma M5546
b-actinSigma A5316
Ki-67 Thermofisher scientificMA5-14520
PhallodinThermofisher scientificA12379
Fluorescence microplate readerFLUOstar OPTIMA, BMG Labtech
Epifluorescence microscope NikonEclipse80i
The TetO-DN-CB-myc6-Rb1 (DN-CBRb) mouse line is available from the Jackson Laboratory as JAX#032011. 

Références

  1. Li, F. Q., et al. Preferential MyoD homodimer formation demonstrated by a general method of dominant negative mutation employing fusion with a lysosomal protease. Journal of Cell Biology. 135 (4), 1043-1057 (1996).
  2. Tarang, S., et al. Generation of a retinoblastoma (rb)1-inducible dominant-negative (DN) mouse model. Frontiers Cellular Neuroscience. 9 (52), (2015).
  3. Kominami, E., et al. The selective role of cathepsins B and D in the lysosomal degradation of endogenous and exogenous proteins. FEBS Letters. 287 (1-2), 189-192 (1991).
  4. Cortellino, S., et al. Defective ciliogenesis, embryonic lethality and severe impairment of the sonic hedgehog pathway caused by inactivation of the mouse complex A intraflagellar transport gene Ift122/Wdr10, partially overlapping with the DNA repair gene Med1/Mbd4. Developmental Biology. 325 (1), 225-237 (2009).
  5. Ferreira, C., et al. Early embryonic lethality of H ferritin gene deletion in mice. Journal of Biological Chemistry. 275 (5), 3021-3024 (2000).
  6. Lee, E. Y., et al. Mice deficient for rb are nonviable and show defects in neurogenesis and haematopoiesis. Nature. 359 (6393), 288-294 (1992).
  7. Turlo, K. A., et al. When cre-mediated recombination in mice does not result in protein loss. Genetics. 186 (3), 959-967 (2010).
  8. Weber, T., et al. Rapid cell-cycle reentry and cell death after acute inactivation of the retinoblastoma gene product in postnatal cochlear hair cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (2), 781-785 (2008).
  9. Zhang, J., et al. The first knockout mouse model of retinoblastoma. Cell Cycle. 3 (7), 952-959 (2004).
  10. Zhao, H., et al. Deletions of retinoblastoma 1 (Rb1) and its repressing target S phase kinase-associated protein 2 (Skp2) are synthetic lethal in mouse embryogenesis. Journal of Biological Chemistry. 291 (19), 10201-10209 (2016).
  11. Yamasaki, L., et al. Loss of E2F-1 reduces tumorigenesis and extends the lifespan of Rb1(+/-) mice. Nature Genetics. 18 (4), 360-364 (1998).
  12. Li, F. Q., et al. Selection of a dominant negative retinoblastoma protein (RB) inhibiting satellite myoblast differentiation implies an indirect interaction between MyoD and RB. Molecular and Cellular Biology. 20 (14), 5129-5139 (2000).
  13. Pitkanen, K., et al. Expression of the human retinoblastoma gene product in mouse fibroblasts: Effects on cell proliferation and susceptibility to transformation. Experimental Cell Research. 207 (1), 99-106 (1993).
  14. Chano, T., et al. Neuromuscular abundance of RB1CC1 contributes to the non-proliferating enlarged cell phenotype through both RB1 maintenance and TSC1 degradation. International Journal of Molecular Medicine. 18 (3), 425-432 (2006).
  15. Kole, R., et al. RNA therapeutics: Beyond RNA interference and antisense oligonucleotides. Nature Reviews Drug Discovery. 11 (2), 125-140 (2012).
  16. Yamamoto, A., et al. The ons and offs of inducible transgenic technology: A review. Neurobiology of Disease. 8 (6), 923-932 (2001).
  17. Houdebine, L. M., et al. Transgenic animal models in biomedical research. Methods in Molecular Biology. 360, 163-202 (2007).
  18. Brehm, A., et al. Retinoblastoma protein recruits histone deacetylase to repress transcription. Nature. 391 (6667), 597-601 (1998).
  19. Lu, Z., et al. E2F-HDAC complexes negatively regulate the tumor suppressor gene ARHI in breast cancer. Oncogene. 25 (2), 230-239 (2006).
  20. Magnaghi-Jaulin, L., et al. Retinoblastoma protein represses transcription by recruiting a histone deacetylase. Nature. 391 (6667), 601-605 (1998).

Réimpressions et Autorisations

Demande d’autorisation pour utiliser le texte ou les figures de cet article JoVE

Demande d’autorisation

Explorer plus d’articles

Num ro 143Dominant n gatifr tinoblastomepreprocathepsin CBg n tiquer versibleinductibletransg nique

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Confidentialité

Conditions d'utilisation

Politiques

Contactez-nous

RECOMMANDER À LA BIBLIOTHÈQUE

NEWSLETTERS JoVE

Recherche

Enseignement

Auteurs

Bibliothécaires

À PROPOS DE JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. Tous droits réservés.