ميكروهيموررهاجيس الدماغي شبه الحاد الناجم عن حقن ليبوبوليساكتشاريدي في الفئران

Summary

نقدم بروتوكولا للحث والكشف عن كمهس الناجمة عن لبس حقن الفئران سبراغ داولي، التي قد تكون استخدمت في المستقبل التحقيقات للبحث في الآلية المرضية من كمهس.

Abstract

شائعة في المرضى الذين تتراوح أعمارهم بين ميكروهيمورهاجيس الدماغي (كمهس) وترتبط بالاضطرابات العصبية المختلفة. مسببات كمهس معقدة، وكثيراً ما يلاحظ neuroinflammation كتواجد المشارك. وهنا، يمكننا وصف شبه حادة نموذج الفئران كمهس الناجم عن حقن lipopolysaccharide (LPS)، فضلا عن أسلوب للكشف عن حقن كمهس. "لبس المنهجي" بسيط نسبيا، واقتصادا، وفعالة من حيث التكلفة. ميزة واحدة كبرى لحقن لبس هو استقرارها للحث على التهاب. كمهس الناجم عن حقن لبس يمكن الكشف عنها بواسطة المراقبة الإجمالية وتوضع وتلطيخ ويوزين (أنه)، بيرل تلطيخ البروسية، إيفانز الأزرق (EB) مزدوجة-وضع العلامات والتصوير بالرنين المغناطيسي-قابلية مرجح التصوير (التصوير بالرنين المغناطيسي-SWI) التكنولوجيا. وأخيراً، تناقش أيضا أساليب أخرى لتطوير نماذج حيوانية كمهس، بما في ذلك مزايا و/أو عيوب، في هذا التقرير.

Introduction

ميكروهيمورهاجيس الدماغية الكلاسيكية (كمهس) تشير إلى الودائع ارتشاح صغيرة من نواتج انحلال الدم مثل هيموسيديرين من خلايا الدم الحمراء في المخ¹. وفقا "دراسة مسح روتردام"، يمكن العثور على كمهس في ما يقرب من 17.8% أشخاص الذين تتراوح أعمارهم بين 60-69 سنة و 38.3 في المائة في تلك ما يزيد على 80 عاماً². انتشار كمهس في كبار السن مرتفع نسبيا، ووجود علاقة بين تراكم كمهس والإدراكية والنفسية العصبية الخلل ثابتة^3،4. العديد من النماذج الحيوانية من كمهس ذكرت في الآونة الأخيرة، بما في ذلك نماذج القوارض الناجم عن النوع الرابع كولاجيناز حقن ستيريوتاكسيك⁵والتطبيق المعدلة وراثيا⁶، التعرض β-N-ميثيلامينو-L-ألانين⁷، و⁸من ارتفاع ضغط الدم، مع كمهس الناجمة عن الالتهابات الجهازية كواحد من الخيارات الأكثر قبولا جيدا. فيشر وآخرون ⁹ أول من استخدم لبس المستمدة من typhimurium السالمونيلا إلى وضع نموذج ماوس كمهس حاد. وفي وقت لاحق، أفادت نفس المجموعة تطوير طراز الماوس كمهس شبه حادة باستخدام النهج نفسه².

ويعتبر لبس كحافز تحريضية موحدة عن طريق حقن داخل. أكدت الدراسات السابقة أن حقن لبس يمكن أن يسبب نيوروينفلاميشن كما يتبين من كميات كبيرة من microglia ونماذج التنشيط أستروسيتي في الحيوان^2،10. وعلاوة على ذلك، كان ارتباط إيجابي بين التنشيط لتفعيل نيوروينفلاميشن وعدد كمهس المنشأة^2،10. استناداً إلى هذه الدراسات السابقة، نحن كانت تطالب بوضع نموذج فأر كمهس بالحقن داخل للبس.

التقدم في الكشف عن التكنولوجيات قد أدت إلى زيادة في عدد التحقيقات للبحث عن كمهس. الأكثر على نطاق واسع وتشمل أساليب الكشف عن كمهس الكشف عن خلايا الدم الحمراء الهيماتوكسيلين ويوزين (أنه) تلطيخ، كشف الحديديك الحديد قبل Blue البروسية تلطيخ⁹، الكشف عن إيفانز الأزرق (EB) ترسب من الفلورة التصوير، والتصوير بالرنين المغناطيسي-التعرض المرجحة تسلا 7.0 التصوير (التصوير بالرنين المغناطيسي-SWI)¹⁰. وتهدف الدراسة الحالية لتطوير طريقة للكشف عن كمهس.

Protocol

جميع الأساليب الموصوفة هنا أقرها "العناية بالحيوان" واستخدام اللجنة (ACUC) من المستشفى العام في الجيش جيش التحرير الشعبي الصيني.

1-المواد

1. التحضير للحقن بلبس
   1. إضافة 25 مل ماء المقطر إلى 25 ملغ مسحوق لبس المستمدة من S. typhimurium بتركيز 1 ملغ/مل نهائي. تخزين الحقن في أنبوب عقيم في 4 درجات مئوية.
      تنبيه: لبس السامة.
   2. إعداد حل المجلس التنفيذي 2% في المحلول الملحي 0.9% العادي لإبقاء EB حقن بتركيز العمل.

2-الحيوانات

1. إدارة لبس لذكور الفئران سبراغ داولي (SD)، الذين تتراوح أعمارهم بين 10 أسابيع (متوسط الوزن: 280 ± 20 g) بالحقن داخل.
   تنبيه: إذا الفئران يتم شراؤها من منظمة أخرى، ثم مرحلة التكيف ينبغي أن لا تكون أقل من 7 أيام.

3-لبس حقن

1. حقن لبس إينترابيريتونيلي في كل الفئران بجرعة مقدارها 1 مغ/كغ، والعودة على الفئران إلى القفص المنزل.
   ملاحظة: التخدير غير ضروري.
2. وبعد ست ساعات حقن جرعة نفس لبس بالحقن في الفئران.
3. ستة عشر ساعة في وقت لاحق بنفس جرعة لبس حقن الفئران.
   تنبيه: حقن الفئران SD مع لبس عند جرعة مقدارها 1 مغ/كغ قد ينتج بمعدل وفيات 5%. ويمكن زيادة معدل وفيات في الفئران الأصغر أو الأكبر سنا أو إناث الفئران الحوامل.
4. العودة على الفئران إلى اقفاصها بعد حقن لبس وتقديم إعلانية libitum الحصول على الطعام والشراب.
   ملاحظة: سوف يحمل الفئران استجابة التهابات الجهازية متميزة، وبالتالي فمن الضروري أن تظل الأقفاص نظيفة طوال التجربة. الجرذان ينبغي أن يكون كثيرا ما (يوم 2 x) رصد للوزن والمظهر العام والموقف بعد حقن لبس أول. إذا الفئران ابدأ إلى المعرض موقف متحدب، الرغبة في التحرك، فقدان وزن كبير (> 20%)، البورفيرين تلطيخ أن تكون إنسانية euthanized قبل يوم 7 نقطة نهاية الدراسة EB.

4. جمع العينات

1. حقن EB
   1. سبعة أيام بعد الحقن الأول، تخدير الفئران التي إينترابيريتونيلي وفقا لبروتوكول IACUC المعتمد الخاص بك.
   2. الانتظار 1-2 دقيقة حتى الفئران لا تظهر الردود منعكس القرنية. أداء مم 5 – 8-ثقب القلب عميقة على كل الفئران؛ وينبغي أن تكون نقطة •اجراء 5 مم إلى الهامش الأيسر من القص في الفضاء إينتيركوستالس الثالثة والرابعة.
   3. الانتظار لحين استرداد الدم ويلاحظ ومن ثم ضخ EB بجرعة 0.2 مل/100 جم من وزن الجسم في البطين الأيسر من القلب.
      تنبيه: ثقب القلب وحقن EB ينبغي إمعان إجراء. قد حقنت EB داخل تجويف الصدر أو تامور بدلاً من البطين الأيسر من القلب.
      1. تمتص مرة أخرى مع أنبوب فارغ واستبدال هذا المجلد مع أنبوب EB قبل الحقن للمساعدة على تقليل معدل الفشل (على سبيل المثال-، الحقن إلى القفص الصدري عن طريق الخطأ).
   4. ابق الفئران في موقف ضعيف لمدة 10 دقائق.
      ملاحظة: إذا لم يتم استخدام عينة للكشف عن التسرب EB في تصوير الفلورة، ثم هذه الخطوة قد تكون محذوفة.
2. المراقبة الإجمالي
   1. أداء القلب بيرفوسيونس استخدام المثلج م 1 الفوسفات المالحة المخزن المؤقت (PBS) لمسح المفرج الدماغي والعقول.
      1. استخدام مشرط، جعل شق البطن عبر طول الحاجز.
      2. غادر قطع من خلال الأضلاع فقط من خط الوسط القفص الصدري.
      3. فتح تجويف الصدر. استخدام المشابك لفضح القلب وتسهيل تصريف الدم والسوائل الأخرى.
      4. أثناء الضغط بثبات القلب مع الملقط (لا يزال ينبغي أن يكون ضرب القلب)، مباشرة تأمين إدراج إبرة في بروز البطين الأيسر لتوسيع هذا إلى حوالي 5 ملم. الإبرة في هذا الموضع لقط قرب نقطة الدخول.
         تنبيه: لا تمتد مفرطة الإبرة، كما يمكن اختراق الجدار الداخلية وحل وسط تداول الحلول.
      5. الإفراج عن صمام للسماح بتدفق الجليد برنامج تلفزيوني الحل (200-300 مل) بمعدل بطيء وثابت في حوالي 20 مل/دقيقة باستخدام مضخة التروية. إذا الحيوانات يتطلب التثبيت بدلاً من مراقبة الإجمالي، ثم استخدم نفس جرعة المثلج المحلول الملحي 0.9 في المائة.
      6. باستخدام مقص حاد، جعل شق في الحديقة الشتوية، ضمان أن الحل باستمرار تدفق. إذا كان السائل لا تتدفق بحرية أو قادم من الحيوان في آنفة أو فمه، قم بتغيير موضع الإبرة.
   2. الشاشة كمهس بالمراقبة الإجمالي.
      ملاحظة: إذا لم يتم استخدام العينة في حساب عدد كمهس بالمراقبة الإجمالي، ثم هذه الخطوة يمكن إهماله.
3. التثبيت
   1. أداء القلب بيرفوسيونس استخدام المثلج 0.9% المحلول الملحي (200-300 مل) لمسح المفرج الدماغي والعقول.
   2. أداء القلب بيرفوسيونس استخدام المثلج 4% بارافورمالدهيد للتثبيت.
   3. قطع رأس الفئران، وعزل الدماغ، وتزج في الدماغ في محلول السكروز 20% على الأقل من 6 ح.
   4. تغيير الحل إلى السكروز 30% وإصلاح لآخر ح 6.
4. إعداد 10 مقاطع أنسجة الدماغ مم سميكة استخدام كريوستات.

5-وقال أنه يلطخ

ملاحظة: يتم تنفيذ هذا الإجراء استخدام "أنه يلطخ عدة".

1. يغسل الشرائح في ماء مقطر.
2. وصمة عار في الحل توضع على 8 كحد أدنى من المياه والصرف الصحي في تشغيل مياه الحنفية لمدة 5 دقائق.
3. التفريق في الكحول حمض 1% ليغسل س. 30 في إدارة مياه الحنفية لمدة 1 دقيقة.
4. وصمة عار في 0.2% الأمونيا المائية (لالتشطيب) أو كربونات الليثيوم المشبعة الحل لمدة 30 ثانية إلى 1 دقيقة أغسل في إدارة مياه الحنفية لمدة 5 دقائق.
5. شطف في الكحول 95% (10 الانخفاضات).
6. كونتيرستين مع الحل ثم لمدة 30 ثانية إلى 1 دقيقة.
7. يذوي من خلال الكحول 95%، اثنين من التغييرات من الكحول المطلق، لمدة 5 دقائق.
8. واضح في زيلين نفط لمدة 30 ثانية.
9. جبل استخدام الأسلوب ليو⁹.
10. تحليل استخدام مجهر الأسفار برايتفيلد.
    ملاحظة: تظهر خلايا الدم الحمراء صدر من الأوعية الدموية، وهي مكونات كمهس، في الأحمر-البرتقالي تحت أنه يلطخ.

6-بيرل البروسية الأزرق تلطيخ

ملاحظة: يتم تنفيذ هذا الإجراء باستخدام مجموعة "أدوات تلوين بيرلز".

1. تغسل شرائح مع الماء المقطر.
2. وصمة عار في حل رد فعل مع خليط أجزاء متساوية فيروسيانيد وحامض الهيدروكلوريك لمدة 10 دقائق.
3. يذوي وواضحة، وجبل، وتحليل الشرائح كما هو موضح في الخطوات 5.7 – 5.10.

7-EB مزدوجة تلطيخ

ملاحظة: هذا الإجراء يتبع الخطوة 4.1.3.

1. تغسل شرائح مع برنامج تلفزيوني ثلاث مرات لمدة 5 دقائق.
2. احتضان الشرائح مع 4 ', 6-دياميدينو-2-فينيليندولي (DAPI) الحل لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
3. يغسل الشرائح مع برنامج تلفزيوني حل ثلاث مرات لمدة 5 دقائق في كل، وتحميل الشرائح مع الحل والغليسيرول برنامج تلفزيوني.
4. تحليل الصور على مجهر الأسفار. تتم الإشارة إلى ترسب EB بالأسفار الحمراء؛ يتم الإشارة إلى الأنوية الفلورية الزرقاء.

8-التصوير بالرنين المغناطيسي-مؤسسة الرعاية الاجتماعية

1. إجراء التصوير بالرنين المغناطيسي على مغناطيس 7-T مجهزة بنظام تدرج بنشاط محمية (16 سم القطر الداخلي).
2. سبعة أيام بعد العلاج، تخدير الفئران باستنشاق facemask isoflurane % 1.5 – 2.0 باستخدام نظام تخدير إيسوفلوراني.
3. تطبيق مرهم البيطرية على عيون الفئران لمنع جفاف بينما تحت التخدير.
4. الحفاظ على الفئران في موقف المعرضة وإجراء فحص التصوير بالرنين المغناطيسي-مؤسسة الرعاية الاجتماعية.
5. الحصول على فحص SWI المرجح باستخدام تسلسل صدى سبين سريعة باستخدام المعلمات التالية: صدى الوقت (TE) 8 مللي ثانية، تكرار الوقت (TR) 40 مللي ثانية، والوجه زاوية = 12°، مجال الرؤية (FOV) 35 ملم × 35 ملم، اقتناء مصفوفة 384 × 384، للحصول على 1 مم سميكة شرائح.
6. تحديد كمهس في التصوير بالرنين المغناطيسي-مؤسسة الرعاية الاجتماعية وفقا غرينبرغ et al. ¹¹، التي تشمل المعايير التالية: (1) يبلغ قطرها مم دي وان زيرو، والبقع (2) دائرية ومعزولة، وإشارة منخفضة الكثافة.
7. في نهاية التجربة، euthanize على الفئران باستخدام الأسلوب جرعة زائدة من ثاني أكسيد الكربون (تدفق 6 لتر في الدقيقة) أو 30 في المائة من حجم الحاوية.

النتائج

ويمكن الكشف عن كمهس باستخدام نهج مختلف. الأساليب الأكثر قبولا جيدا وتشمل ما يلي: (1) إجمالي المراقبة والتقييم من سطح كمهس (كما هو موضح في الشكل 1، اللوحة العلوية)؛ (2) وتلطيخ للكشف عن خلايا الدم الحمراء (هو مبين في الشكل 2 ألف، اللوحة العلوية) أ?...

Discussion

الدراسات البحثية في كمهس زادت في السنوات القليلة الماضية. ومع ذلك، لا تزال الآلية كمهس غير واضحة، مما دفع العلماء وضع النماذج الحيوانية التي تحاكي هذا الشرط على وجه الخصوص. على سبيل المثال، هوفمان et al. وضع الناجمة عن نقص كمهس ماوس نموذج يوضح أن كمهس هي سبب نقص واضطراب autoregulation المخية

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
LPS	Sigma-Aldrich	L-2630	for inflammation induction
EB	Sigma-aldrich	E2129	for EB leakage detection
DAPI dying solution	Servicbio	G1012	count medium for IF
Perl’s Prussian staining	Solarbio	G1424	Kit for Prussian staining
HE staining	Solarbio	G1120	Kit for HE staining
chloral hydrate	Sigma-Aldrich	47335U	For anesthesia
phosphate buffer saline (PBS)	Solarbio	P1022	a kind of buffer solution commonly used in experiment
0.9% saline solution	Hainan DonglianChangfu Pharmaceutical Co., Ltd., China		solution for perfusion
paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127	a kind of solution commonly used for fixation
20% sucrose solution	Solarbio	G2461	a kind of solution commonly used for fixation
30% sucrose solution	Solarbio	G2460	a kind of solution commonly used for fixation
vet ointment	Solcoseryl eye gel, Bacel, Switzerland		for rat's eyes protection