아 급성 대뇌 Microhemorrhages 쥐에서 Lipopolysaccharide 주입에 의해 유도 된

요약

선물이 유도 하 고 탐지 LPS 주입 수 있습니다 Sprague-Dawley 쥐에 의해 발생 하는 CMHs CMHs의 병 인에 대 한 연구 조사 미래에 활용 하는 프로토콜.

초록

대뇌 microhemorrhages (CMHs) 노인된 환자에서 일반적 이며 다양 한 정신병 무질서에 상관. CMHs의 병 인은 복잡 한, 그리고 neuroinflammation 동시 발생으로 자주 관찰 됩니다. 여기, 우리가 설명 하위 급성 lipopolysaccharide (LPS) 주입, 조직 CMHs. LPS 주입을 탐지 하기 위한 방법에 의해 유도 된 CMHs 쥐 모델은 상대적으로 경제적, 간단 하 고 비용 효율적인. LPS 주입의 주요 장점 중 하나는 염증을 유발 하는 안정성입니다. CMHs LPS 주입으로 인 한 총 관찰, 되며 (그) 오신 얼룩, Perl의 프러시안 얼룩, 에반스 블루 (EB) 더블 라벨 및 자기 공명 영상-민감성 가중치 이미징 (MRI-SWI) 기술 검출 될 수 있었다. 마지막으로, 그들의 이점 및 단점를 포함 하 여 CMHs 동물 모델 개발의 다른 방법 또한이 보고서에 설명 되어 있습니다.

서문

클래식 대뇌 microhemorrhages (CMHs) 뇌¹적혈구에서 작은 혈관 주위 예금 hemosiderin 같은 혈액 저하 제품의를 참조 하십시오. 로테르 담 스캔 연구, CMHs 60-69 년 세의 거의 17.8%와 80 년²에 그들에 38.3%에 찾아낼 수 있었다. 노인에서 CMHs의 보급은 상대적으로 높은, 그리고 CMHs의 축적과 인지 및 정신병 장애 사이의 상관 관계 설립된^3,4되었습니다. 여러 동물 모델 CMHs의 최근 보고 된, 유형 IV 콜라 stereotaxic 주입⁵, APP 유전자 변형⁶, β-N-methylamino-L-알라닌 노출⁷, 및⁸, 고혈압 유발 설치류 모델을 포함 한 와 함께 가장 잘 허용된 선택의 하나로 서 조직의 염증에 의해 유도 된 CMHs. 피셔 외. ⁹ 처음 급성 CMHs 마우스 모델을 개발 살 모 넬 라 typhimurium 에서 파생 된 LPS를 사용. 그 후, 같은 그룹 같은 방법을²를 사용 하 여 하위 급성 CMHs 마우스 모델의 개발을 보도 했다.

LPS는 복 주입을 통해 표준화 된 염증 성 자극으로 간주 됩니다. 이전 연구는 많은 양의 microglia 반영 LPS 주입 neuroinflammation 일으킬 수 및 동물에 사이토 활성화 모델^2,10확인 했습니다. 또한, neuroinflammation 활성화의 활성화 및 CMHs의 수 사이 긍정적인 상관 관계가 설립된^2,10되었습니다. 이러한 이전 연구를 바탕으로, 우리 있었다 하 라는 메시지가 CMHs 쥐 모델 개발 LPS의 복 주사.

검색 기술 CMHs에 대 한 연구 조사에의 증가 귀착되 었 이동 합니다. 가장 널리 인정 hematoxylin와 얼룩, 프러시안 블루⁹, 착 색 제 2 철 철 감지 (그는) 오신 붉은 혈액 세포의 탐지를 포함 하는 검색 하는 CMHs 에반스의 블루 면역 형광에 의해 증 착 (EB) 이미징, 그리고 7.0 테슬라 자기 공명 영상-민감성 가중치 이미징 (MRI-SWI)¹⁰. 현재 연구의 CMHs에 대 한 심사 방법을 개발 하는 것을 목표로.

프로토콜

여기에 설명 된 모든 메서드는 동물 관리 및 사용 위원회 (ACUC) PLA 육군 종합 병원에 의해 승인 되었습니다.

1입니다. 자료

1. LPS 주입의 준비
   1. LPS 분말 1 mg/mL의 최종 농도에 S. typhimurium 에서 파생 된의 25 mg을 증류수 25 mL를 추가 합니다. 저장소 4 ° c.에 무 균 튜브에 주입
      주의: LPS 독성이 있다.
   2. EB 주입 작업 농도에서 계속 정상적인 0.9% 소금물에 2 %EB 솔루션을 준비 합니다.

2입니다. 동물

1. 10 주 세 남성 Sprague-Dawley (SD) 쥐에 LPS를 관리 (평균 무게: 280 ± 20 g) 복 주사.
   주의: 쥐가 다른 조직에서 구입 하는 경우 다음 적응 단계 해서는 안됩니다 7 일 미만.

3. LPS 주사

1. 1 mg/kg의 복용량에 각 쥐에 intraperitoneally LPS를 주입 하 고 그들의 홈 케이지를 쥐를 반환 합니다.
   참고: 마 취는 필요 하지 않습니다.
2. 6 시간 후에, LPS는 쥐로 주입의 동일한 복용량 주입.
3. 16 시간 후 쥐에 LPS의 동일한 복용량을 주사.
   주의: 사망률 5%에서에서 발생할 수 있습니다 1 mg/kg의 복용량에 LPS와 SD 쥐를 주입. 사망 율 더 젊은 이상 쥐 또는 임신 여성 쥐에 증가할 수 있었다.
4. LPS 주입 후 그들의 감 금 소에 쥐를 반환 하 고 음식과 음료에 대 한 광고 libitum 액세스 제공.
   참고: 쥐 별개 조직의 염증 반응, 전시 하 고 따라서 그것은 감 금 소는 실험을 통해 깨끗 한 유지 필수적입니다. 쥐 해야 될 자주 (2 x 일) 모니터링 무게, 일반적인 모양 및 태도 대 한 첫 번째 LPS 주입 후. 쥐 돌출된 자세, 이동 하는 방식은, 상당한 체중 감소를 전시 하기 위하여 시작 하는 경우 (> 20%), 7 일 전에 EB 연구 끝점 안락사 포 르 피 린 착 이어서 편안 하.

4. 샘플 컬렉션

1. EB 주입
   1. 첫 번째 주사 후 7 일 anesthetize intraperitoneally 승인된 IACUC 프로토콜에 의해 쥐.
   2. 쥐 각 막 반사 응답을 표시 하지 않습니다 때까지 1-2 분을 기다립니다. 5-8 밀리미터를 수행-각 쥐;에 깊은 심장 펑크 찌른 포인트 3, 4 늑 공간에 흉 골의 왼쪽된 여백 5 m m 이어야 한다.
   3. 혈액 복구, 관찰 될 때까지 기다려야 하 고 주입 EB 0.2 mL/100 g 체중의 복용량에서 왼쪽된 심장 심 실.
      주의: 심장 펑크와 EB 주입 수 신중 하 게 수행 한다. EB 흉 강 또는 왼쪽된 심장 심 실 대신 심장에 주입 될 수 있습니다.
      1. 빈 관으로 다시 빨 아 하 고 실패율을 줄일 수 있도록 주입 전에 EB 튜브에이 볼륨을 바꿉니다 (예., 오류에 의해 흉 곽에 주입).
   4. 10 분 동안 부정사 위치에 쥐를 유지.
      참고: 샘플 면역 형광 이미징에서 EB 누설 감지를 사용 하지 않으면, 다음이 단계를 생략할 수 있습니다.
2. 총 관찰
   1. 심장 perfusions 대뇌 맥 관 구조와 두뇌를 차가운 1 M 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)를 사용 하 여 수행 합니다.
      1. 메스를 사용 하 여 횡 경 막의 전체 길이 걸쳐 복 부 절 개를 확인 합니다.
      2. 그냥 갈비를 통해 컷 왼쪽 흉 곽 중간.
      3. 흉 강에 열어. 클램프를 사용 하 여 마음을 노출 하 고 혈액과 다른 체액의 배수 장치를 촉진 하기 위하여.
      4. 직접 삽입이 연장에 약 5 mm. 좌 심 실의 돌출에 바늘 항목의 지점 근처 클램핑 하 여 그 위치에 바늘 보안 꾸준히 집게 (심장 해야 여전히 수 박동)와 마음 잡고.
         주의: 하지 지나치게 확장지 않습니다 바늘, 실내 벽을 관통 하 고 타협 솔루션의 순환 수로.
      5. 약 20 mL/min 살포 펌프를 사용 하 여에서 느리고 꾸준한 속도로 흐름 얼음 처럼 차가운 PBS 솔루션 (200-300 mL) 수 있도록 밸브를 해제. 동물 총 관측 대신 고정 필요, 얼음 처럼 차가운 0.9% 생리 식 염 수의 동일한 복용량을 사용 합니다.
      6. 날카로운가 위를 사용 하 여, 아 트리 움, 솔루션 지속적으로 흐름 보장에 절 개를 확인 합니다. 만약 유체 흐름을 자유롭게 하지 않습니다 또는 동물의 코 또는 입에서 오고 있다, 바늘 위치를 변경할.
   2. 총 관찰에 의해 CMHs에 대 한 화면입니다.
      참고: 샘플 총 관찰에 의해 CMHs의 숫자를 계산에 사용 하지 않으면, 다음이 단계를 생략할 수 있습니다.
3. 고정
   1. 심장 perfusions 얼음 0.9% 생리 식 염 수 (200-300 mL) 대뇌 맥 관 구조를 취소 하 고 두뇌를 사용 하 여 수행 합니다.
   2. 심장 perfusions 고정을 위한 얼음 4 %paraformaldehyde 사용 하 여 수행 합니다.
   3. 목을 벨 쥐, 뇌를 분리 하 고 적어도 6 h에 대 한 20% 자당 해결책에 뇌를 담 궈.
   4. 30% 자당 및 다른 6 h. 에 대 한 수정으로 솔루션을 변경
4. cryostat를 사용 하 여 10 m m 두께 뇌 조직 섹션을 준비 합니다.

5. 그 얼룩

참고:이 절차는 그 얼룩 키트를 사용 하 여 수행 됩니다.

1. 씻고 증류수에 슬라이드.
2. 수돗물에 5 분 동안 실행 되며 솔루션 8 분 세척 얼룩.
3. 1 분 동안 수돗물을 실행에 30 미 세척에 대 한 1% 산 알코올에 구분 합니다.
4. 0.2% 암모니아 물 (청소법)에 얼룩 또는 포화 리튬 탄산염 30 솔루션 1 분 씻어 수돗물에 5 분 동안 실행 s.
5. 린스에 95% 알코올 (10 딥).
6. Counterstain 30 오신 솔루션 s 1 분.
7. 95% 알코올, 5 분에 대 한 절대 알코올의 2 개의 변화를 통해 탈수.
8. 30 대 한 자일 렌에 분명 s.
9. Liu의 방법⁹를 사용 하 여 탑재 합니다.
10. 대물 형광 현미경을 사용 하 여 분석 합니다.
    참고: 붉은 혈액 세포는 CMHs의 구성 요소, 혈관에서 발표 레드-오렌지 얼룩 그 아래에 나타납니다.

6. 펄 프러시안 파란 얼룩

참고:이 절차는 Perls 얼룩 키트를 사용 하 여 수행 됩니다.

1. 증류수와 슬라이드를 씻어.
2. 등분 혼합 ferrocyanide 및 10 분에 대 한 염 산의 반응 솔루션에 얼룩.
3. 탈수, 취소, 마운트, 그리고 5.7-5.10 단계에 설명 된 대로 슬라이드를 분석.

7. EB 더블 얼룩

참고:이 절차는 단계 4.1.3 다음과 같습니다.

1. 5 분에 대 한 세 번 PBS와 슬라이드를 씻어.
2. 4', 실 온에서 15 분 동안 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 솔루션으로 슬라이드를 품 어.
3. 각, 5 분에 대 한 세 번 PBS 솔루션 슬라이드를 세척 하 고 PBS 글리세롤 솔루션 슬라이드 마운트.
4. 형광 현미경에서 이미지를 분석 합니다. EB 증 착 빨간 형광;로 표시 핵은 블루 형광으로 표시 됩니다.

8입니다. MRI-SWI

1. 적극적으로 차폐 된 그라데이션 시스템 (내경 16 cm) 7 T 자석에 MRI를 수행 합니다.
2. 치료 후, 7 일 1.5-2.0% isoflurane isoflurane 마 취 시스템을 사용 하 여의 안 면 흡입 하 여 쥐를 anesthetize.
3. 수 의사 연 고 마 취에서 건조를 방지 하기 위해 쥐의 눈에 적용 됩니다.
4. 경향이 위치에 쥐를 유지 하 고 MRI SWI 스캔을 수행.
5. SWI가 중 검사 다음 매개 변수를 사용 하 여 빠른 회전 급강하 에코 시퀀스를 사용 하 여 얻을: 에코 시간 (TE) 8 ms, 반복 시간 (TR) 40 ms, 대칭 이동 각도 = 12 °, 시야 (FOV) 35 m m × 35, 인수 매트릭스 384 × 384, 1 m m 두께 슬라이스를 얻으려고.
6. 그린 버그 외 에 따라 MRI SWI에 CMHs를 식별 ¹¹, 다음 조건을 포함 하는: (1) ≤ 10 mm, 그리고 (2) 원형, 고립 된, 그리고 낮은 신호 강도 반점의 직경.
7. 실험의 끝에, 과다 복용 (6 L/min의 흐름) 또는 컨테이너 볼륨의 30%에서 이산화탄소 방법을 사용 하 여 쥐를 안락사.

결과

CMHs는 다양 한 방법을 사용 하 여 검색할 수 있습니다. 가장 잘 받아들여 메서드는 다음과 같습니다: (1) 총 관찰 및 평가의 표면 CMHs ( 그림 1, 위쪽 패널에에서 표시 된); (2) 그는 적혈구 ( 그림 2A에 표시 된, 상단 패널) 또는 프러시안 얼룩 검출 제 2 철 철의 검출에 대 한 얼룩 적혈구 (그림 2A, 하단 패널);의 ?...

토론

CMHs에 대 한 조사 연구는 지난 몇 년 동안에서 증가 하고있다. 그러나, CMHs의 메커니즘 불분명, 과학자 들이 특정 조건을 시뮬레이션 하는 동물 모델을 확립 하 라는 남아 있습니다. 예를 들어 호프만 외. 개발 hypoxia 유발 CMHs 마우스 모델 CMHs 저 산소 증 및 뇌혈관 autoregulation¹²의 중단에 의해 발생 보여줍니다. 로이터 외. ⁵ 보여준 그 대뇌 아 밀 로이?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
LPS	Sigma-Aldrich	L-2630	for inflammation induction
EB	Sigma-aldrich	E2129	for EB leakage detection
DAPI dying solution	Servicbio	G1012	count medium for IF
Perl’s Prussian staining	Solarbio	G1424	Kit for Prussian staining
HE staining	Solarbio	G1120	Kit for HE staining
chloral hydrate	Sigma-Aldrich	47335U	For anesthesia
phosphate buffer saline (PBS)	Solarbio	P1022	a kind of buffer solution commonly used in experiment
0.9% saline solution	Hainan DonglianChangfu Pharmaceutical Co., Ltd., China		solution for perfusion
paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127	a kind of solution commonly used for fixation
20% sucrose solution	Solarbio	G2461	a kind of solution commonly used for fixation
30% sucrose solution	Solarbio	G2460	a kind of solution commonly used for fixation
vet ointment	Solcoseryl eye gel, Bacel, Switzerland		for rat's eyes protection