ラットにおけるリポ多糖投与による亜急性の脳 Microhemorrhages

要約

誘発して思われる Sprague-dawley ラット LPS 注入による CMHs 活用将来的に CMHs の成因に関する研究調査を検出するためのプロトコルを提案します。

要約

脳 microhemorrhages (CMHs) は高齢患者で共通、さまざまな精神神経疾患に関連しています。CMHs の病因は複雑であり、neuroinflammation が共起関係としてよく見られます。ここで、亜急性は説明 CMHs。 全身 lps の自動検出法と同様に、リポ多糖 (LPS) の注入によって誘起される CMHs ラット モデルが比較的簡単な、経済的な、および費用対効果。Lps の主要な利点の 1 つは、炎症を誘発するその安定性です。Lps による CMHs は、肉眼観察、ヘマトキシリンとエオシン (HE) 染色、Perl のプロイセン染色、エバンス ブルー (EB) ダブル-ラベリングおよび磁気共鳴イメージ投射感受性加重イメージング (MRI SWI) 技術によって検出でした。最後に、他の方法の利点や欠点を含む、CMHs 動物モデルの開発を本報告で述べる。

概要

古典的な脳 microhemorrhages (CMHs) は、脳¹の赤血球からヘモジデリンなど血液分解産物の小さな血管堆積物を参照します。ロッテルダムのスキャン調査によると CMHs は、60-69 歳以上の人の約 17.8% と 80 年の²以上の方で 38.3% でした。CMHs の高齢者の有病率は比較的高いと CMHs の蓄積と認知と神経の機能不全間の相関関係は確立された^3,4をされています。CMHs のいくつかの動物モデルが最近報告されて、タイプ IV コラゲナーゼ定位注射⁵、APP トランスジェニック⁶β N methylamino L-アラニン露出⁷、および高血圧症⁸によって誘起される齧歯動物モデルを含む最も広く受け入れられた選択肢の一つとして全身性炎症による CMHs。フィッシャーら⁹は、まず急性の CMHs マウス モデルを開発するのにサルモネラ菌由来 LPS を使用しました。その後、同じグループは同じアプローチ²を使用して亜急性 CMHs マウス モデルの開発を報告しました。

LPS は、腹腔内投与によって標準化された炎症性刺激として考慮されます。前の研究は、lps は、ミクログリアの大量を反映して neuroinflammation を原因し、^2,10のモデル動物におけるアストロ サイトの活性化を確認しました。さらに、neuroinflammation 活性化の活性化と CMHs の数には正の相関は、確立された^2,10をされています。これらの先行研究に基づいて、我々 は LPS の腹腔内投与によって CMHs ラットのモデルを開発する刺激されました。

進歩検出技術は、CMHs の研究調査の数の増加で起因しました。最も広く CMHs を検出する方法は、ヘマトキシリンとエオシン (HE) 染色、染色⁹、プルシアン ブルーによる鉄検出による赤血球の検出を認めたエバンスの検出ブルー (EB) 抗体法による蒸着イメージング、および 7.0 テスラ磁気共鳴イメージ投射感受性加重イメージング (MRI SWI)¹⁰。本研究は、CMHs のためのスクリーニング法の開発を目指しています。

プロトコル

ここで説明したすべてのメソッドは、動物愛護と PLA の陸軍病院の使用委員会 (ACUC) によって承認されています。

1. 材料

1. LPS 注射液の調製
   1. 最終濃度 1 mg/mL にサルモネラ菌由来 LPS 粉末 25 mg に 25 mL の蒸留水を追加します。ストア 4 ° C での生殖不能の管に注入
      注意: LP は有毒です。
   2. 通常使用濃度で EB 注入を保つために 0.9% 食塩液で 2 %eb ソリューションを準備します。

2. 動物

1. 10 週齢雄 Sprague-dawley (SD) ラットに組合を管理 (平均重量: 280 ± 20 g) 腹腔内投与によって。
   注意: ラットを別の組織から購入した場合、適応位相ならない 7 日以内。

3. 組合注射

1. LPS を 1 mg/kg の用量で各ラットに腹腔内注入し、彼らのホームのケージにラットを返します。
   注: 麻酔は必要ではありません。
2. 6 時間後、同じラット LPS 注入量を注入します。
3. 16 時間後ラット LPS の同じ線量を注入します。
   注意: は 1 mg/kg の用量で LPS を SD ラットに注射 5% の死亡率の可能性があります。死亡率は、若いまたは古いラットまたは妊娠中の雌ラットの更なる増加可能性があります。
4. LPS 投与後ラットを檻に戻り、自由への食べ物や飲み物を提供します。
   注: ラットは明確な全身性炎症反応を示すし、ケージが実験を通してきれいなまま、不可欠であるといえます。ラットが頻繁 (2 x 日) を監視する体重、一般的な外観および態度のため最初の LPS 投与後。ラット背を丸めて姿勢、移動する気力の無さ、有意な体重減少を示すように開始する場合 (> 20%)、EB 研究終点 7 日前に安楽死させたポルフィリン染色彼らが慈悲深くあります。

4. 検体の採取

1. EB 注入
   1. 最初の注射後 7 日間は麻酔ラット腹腔内、承認された IACUC プロトコルによると。
   2. 1-2 分待ってからラット角膜反射反応を示さない。5-8 mm を実行-各ラット; 深い心臓穿刺貫通ポイントは、第 3 および第 4 肋間スペースで胸骨の左の余白を 5 mm にする必要があります。
   3. 血回復が観察されるまで待ち、左心室に 0.2 mL/100 g 体重の投与量で EB を注入します。
      注意: 心臓穿刺と EB 投与慎重に実行してください。EB は、胸腔や心膜ではなく左心室に注入される可能性があります。
      1. 空チューブに戻って吸うし、故障率を減らすために投与前に、の EB 管でこのボリュームを置き換えます (e.g。、エラーによって胸郭への注入)。
   4. ラットを仰臥位で 10 分間にしてください。
      注: 蛍光イメージングで EB 漏れを検出するサンプルを使用しない場合、この手順は省略できます。
2. 肉眼観察
   1. 氷冷 1 M リン酸バッファー生理食塩水 (PBS) を使用した脳血管と脳のクリア心臓 perfusions を実行します。
      1. メスを使用すると、ダイヤフラムの全体にわたって腹部切開を行います。
      2. 肋骨だけのカットは、胸郭の正中線の左。
      3. 胸腔内にオープン。クランプを使用して、中心部を公開する、血液や他の液体の排水を容易にします。
      4. 挿入拡張に約 5 mm. に左心室の突起に針のエントリ ポイント近くクランプによってその位置に針を安全な直接鉗子 (心臓を破ってまだべきである)、着実に心を押しながら。
         注意: は過度に内部の壁に穴を開けるし、ソリューションの循環を妥協することができます針を拡張します。
      5. 灌流ポンプを使用して 20 mL/分前後で低速かつ安定した速度で流れ氷冷 PBS ソリューション (200-300 mL) を許可するようにバルブをリリースします。動物は、肉眼観察ではなく固定を必要とする場合は、冷たい 0.9% 食塩水の同量を使用します。
      6. 鋭いはさみを使用して、ソリューションが連続的に流れていることを確認、アトリウムに切開を行います。流体が自由に流れない、動物の鼻の穴や口から来ている針の位置を変更します。
   2. 肉眼観察で CMHs の画面。
      注: サンプルは肉眼観察によって CMHs の番号の計算を使用しない場合、この手順は省略できます。
3. 固定
   1. 冷たい 0.9% 食塩液 (200-300 mL) 脳血管系をクリアして脳を使用して心臓の perfusions を実行します。
   2. 固定のため氷の 4% パラホルムアルデヒドを使用して心臓の perfusions を実行します。
   3. ネズミの首をはねる、脳を分離、少なくとも 6 時間の 20% ショ糖液で脳を浸します。
   4. 30% ショ糖溶液ならびに別 6 h.の修正プログラム ソリューションに変更します。
4. クライオスタットを用いた 10 mm 厚脳組織セクションを準備します。

5. 彼の汚損

メモ: この手順は彼染色キットを使用して実行されます。

1. 蒸留水でスライドを洗います。
2. 5 分間流水で 8 分洗浄のヘマトキシリン液で染色します。
3. 1 %1 分の水道の流水で 30 s. 洗浄酸アルコールで区別しなさい。
4. 0.2% アンモニア水 (ブルーイング) で染色または飽和リチウム炭酸溶液 30 s 5 分水道の流水で 1 分洗浄します。
5. 95% アルコール (10 dip) ですすいでください。
6. エオシン ソリューション 30 の対比染色 1 分 s。
7. 95% アルコール、無水アルコール、5 分間の 2 つの変更で水分を取り除きます。
8. 30 キシレンのクリア s。
9. 劉方法⁹を使用してマウントします。
10. 明視野蛍光顕微鏡を用いて分析します。
    注: CMHs のコンポーネントである血管から赤血球は HE 染色で赤オレンジ色で表示されます。

6. Perl プルシアン ブルー染色

メモ: この手順は Perl 染色キットを使用して実行されます。

1. 蒸留水とスライドを洗います。
2. フェロシアン化と 10 分のための塩酸の等量混合物と反応液で染色します。
3. 脱水、オフ、マウント、および 5.7-5.10 の手順で説明するように、スライドを分析します。

7. 理事会の二重染色

注: この手順に従います手順 4.1.3。

1. PBS で 3 回各 5 分用のスライドを洗います。
2. スライド 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) ソリューション室温で 15 分間、インキュベートします。
3. 洗浄は 3 回、それぞれ 5 分の PBS 溶液で滑るし、PBS-グリセリン溶液でスライドをマウントします。
4. 蛍光顕微鏡のイメージを分析します。EB 蒸着されて赤い蛍光性;核は、青色蛍光によって示されます。

8. MRI SWI

1. 積極的にシールド グラデーション システム (16 cm 内径) を搭載した 7 T の磁石で MRI を実行します。
2. 治療後 7 日間は、イソフルラン麻酔システムを使用して 1.5-2.0% イソフルランのフェイス マスク吸入ラットを麻酔します。
3. 麻酔中の乾燥を防ぐためにラットの目に獣医軟膏を塗る。
4. 腹臥位でラットを維持し、MRI SWI スキャンを実行します。
5. 次のパラメーターを使用して高速回転のエコー順序を使用して加重 SWI スキャンを取得: エコーの時間 (TE) 8 ms の繰り返し時間 (TR) 40 ms、反転角度 12 °、視野 (FOV) 35 mm × 35 mm の取得マトリックス 384 × 384、1 mm の厚さにスライスを取得する =。
6. グリーンバーグらによると MRI SWI で CMHs を識別します。¹¹、次の条件を含まれている: (1) 直径 ≤10 mm (2) 円形、分離、および低信号強度スポット。
7. 実験の終わりには、過剰摂取 (6 L/分の流れ) やコンテナー量の 30% で二酸化炭素法を用いたラットを安楽死させます。

結果

CMHs は、さまざまなアプローチを使用して検出できます。最も広く受け入れられた方法次のとおりです: (1) 肉眼観察と (図 1、上部のパネルに示すように); 表面の CMHs の評価(赤い血液細胞 (図 2 a、下部のパネル) の換散に由来する 2) 彼は染色の赤血球 (図 2 aに示すように、上部のパネル) またはプロイ?...

ディスカッション

CMHs に関する調査研究は、過去数年間で増加しています。ただし、CMHs のメカニズムは不明で、この特定の条件をシミュレートするモデル動物を確立する科学者を求めます。たとえば、ホフマンらCMHs が低酸素症および脳の自己調節¹²の中断によって引き起こされることを示す低酸素状態における CMHs マウス モデルを開発しました。ロイターら⁵...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
LPS	Sigma-Aldrich	L-2630	for inflammation induction
EB	Sigma-aldrich	E2129	for EB leakage detection
DAPI dying solution	Servicbio	G1012	count medium for IF
Perl’s Prussian staining	Solarbio	G1424	Kit for Prussian staining
HE staining	Solarbio	G1120	Kit for HE staining
chloral hydrate	Sigma-Aldrich	47335U	For anesthesia
phosphate buffer saline (PBS)	Solarbio	P1022	a kind of buffer solution commonly used in experiment
0.9% saline solution	Hainan DonglianChangfu Pharmaceutical Co., Ltd., China		solution for perfusion
paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127	a kind of solution commonly used for fixation
20% sucrose solution	Solarbio	G2461	a kind of solution commonly used for fixation
30% sucrose solution	Solarbio	G2460	a kind of solution commonly used for fixation
vet ointment	Solcoseryl eye gel, Bacel, Switzerland		for rat's eyes protection