Subaguda Microhemorrhages Cerebral induzida pela injeção de lipopolissacarídeo em ratos

Resumo

Apresentamos um protocolo para induzir e detectar CMHs causadas pela injeção de LPS em ratos Sprague-Dawley, que pode ser utilizaram no futuro pesquisa investigações na patogênese do CMHs.

Resumo

Microhemorrhages cerebrais (CMHs) são comuns em pacientes idosos e estão correlacionados com vários distúrbios neuropsiquiátricos. A etiologia da CMHs é complexa e neuroinflammation frequentemente é observada como uma co-ocorrência. Aqui, descrevemos um sub-aguda CMHs modelo de rato induzido pela injeção de lipopolissacarídeo (LPS), bem como um método para a detecção de injeção CMHs. LPS sistêmica é relativamente simples, econômica e rentável. Uma grande vantagem da injeção de LPS é sua estabilidade para induzir a inflamação. CMHs causadas pela injeção de LPS podem ser detectadas pela observação bruta, hematoxilina e coloração eosina (HE), do Perl coloração prussiano, double-rotulagem de azul de Evans (EB) e tecnologia de (MRI-SWI) imagem de ressonância magnética-susceptibilidade ponderada. Finalmente, outros métodos de desenvolver modelos animais CMHs, incluindo suas vantagens ou desvantagens, também são discutidos neste relatório.

Introdução

Microhemorrhages cerebrais clássicas (CMHs) consulte perivascular pequenos depósitos de produtos de degradação do sangue tais como hemossiderina de células vermelhas do sangue no cérebro¹. De acordo com o estudo de varredura de Rotterdam, CMHs podem ser encontrados em cerca de 17,8% das pessoas com idade entre 60-69 anos e 38,3% daqueles com 80 anos². A prevalência do CMHs no idoso é relativamente alta, e uma correlação entre a acumulação de CMHs e disfunção cognitiva e neuropsiquiátricas tem sido estabelecida^3,4. Vários modelos animais de CMHs recentemente têm sido relatados, incluindo modelos de roedores induzidos pelo tipo IV colagenase injeção estereotáxica⁵, APP transgênicos⁶, β-N-metilamino-L-alanina exposição⁷e hipertensão⁸, com CMHs induzidas por inflamação sistêmica como uma das escolhas mais bem aceitas. Fisher et al . ⁹ primeiro usado LPS derivados de Salmonella typhimurium para desenvolver um modelo de mouse CMHs agudo. Posteriormente, o mesmo grupo relatou o desenvolvimento de um modelo de mouse CMHs sub-aguda usando a mesma abordagem².

LPS é considerado como uma injeção de estímulo inflamatório padronizado via intraperitoneal. Estudos anteriores confirmaram que injeção de LPS poderia causar neuroinflammation como refletido por grandes quantidades de micróglia e ativação de astrocyte no animal modelos^2,10. Além disso, uma correlação positiva entre a ativação de neuroinflammation ativação e o número de CMHs tem sido estabelecida^2,10. Baseado nestes estudos anteriores, recebemos para desenvolver um modelo do rato CMHs por injeção intraperitoneal de LPS.

Os avanços na deteção tecnologias resultaram em um aumento no número de investigações de pesquisa sobre CMHs. A mais amplamente reconhecida de métodos de detecção de CMHs incluem a detecção de células vermelhas do sangue pela hematoxilina e eosina (HE), coloração, deteção de ferro férrico por⁹, a coloração azul da Prússia deteção de Evans blue deposição (EB) por imunofluorescência imagem e ressonância magnética-susceptibilidade ponderada 7,0 Tesla da imagem latente (MRI-SWI)¹⁰. O presente estudo tem como objetivo desenvolver um método de triagem para CMHs.

Protocolo

Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo Comitê de uso (ACUC) do Hospital Geral do exército de PLA e cuidado Animal.

1. materiais

1. Preparação da injeção de LPS
   1. Adicione 25 mL de água destilada a 25 mg de pó de LPS derivado de S. typhimurium a uma concentração final de 1 mg/mL. Loja a injeção em um tubo estéril a 4 ° C.
      Cuidado: LPS é tóxico.
   2. Prepare uma solução EB 2% no normal 0,9% de solução salina para manter a injeção EB na concentração do trabalho.

2. os animais

1. Administrar LPS para ratos machos Sprague-Dawley (SD), com 10 semanas de idade (peso médio: 280 ± 20 g) por injeção intraperitoneal.
   Cuidado: Se ratos são comprados de outra organização, então a fase de adaptação não deve ser inferior a 7 dias.

3. LPS injeções

1. Injetar LPS intraperitonealmente em cada rato na dose de 1 mg/kg e retornar os ratos de sua gaiola em casa.
   Nota: Não é necessária anestesia.
2. Seis horas mais tarde, injete a mesma dose de injeção de LPS em ratos.
3. Dezesseis horas depois injetar a mesma dose de LPS em ratos.
   Cuidado: Injetando ratos SD com LPS na dose de 1 mg/kg pode resultar em uma taxa de mortalidade de 5%. A taxa de mortalidade pode aumentar ainda mais em mais novos ou mais velhos ratos ou ratos fêmeas grávidos.
4. Regressar os ratos das gaiolas após injeção de LPS e fornecer acesso ad libitum para comida e bebida.
   Nota: Ratos irão expor uma resposta inflamatória sistêmica distinta, e, portanto, é essencial que as gaiolas mantenham limpas durante todo o experimento. Ratos deve ser frequentemente (2x dia) monitoramento de peso, aparência geral e atitude após a primeira injeção de LPS. Se os ratos começam a exibir uma postura encurvada, relutância em se mover, perda de peso significativa (> 20%), porfirina coloração que eles ser humanamente sacrificados antes do dia 7 ponto de extremidade de estudo EB.

4. coleta de amostra

1. Injeção de EB
   1. Sete dias após a primeira injeção, anestesia o rato por intraperitonealmente, de acordo com o protocolo IACUC aprovado.
   2. Espere 1 a 2 min até os ratos não mostrar respostas de reflexas corneais. Executar um 5 por 8 mm-punção profunda cardíaca em cada rato; o ponto perfurar deve ser de 5 mm para a margem esquerda do esterno no espaço intercostais 3ª e 4ª.
   3. Espere até a recuperação de sangue é observada e então injetar EB na dose de 0,2 mL/100 g de massa corporal para o ventrículo esquerdo do coração.
      Cuidado: EB injeção e punção cardíaca devem ser cuidadosamente realizadas. EB pode ser injetado em cavidade torácica ou pericárdio em vez do ventrículo esquerdo do coração.
      1. Chupar com um tubo vazio e substituir este volume com um tubo EB antes da injeção para ajudar a reduzir a taxa de falha (ex., injeção a caixa torácica por erro).
   4. Mantenha o rato em uma posição supina por 10 min.
      Nota: Se a amostra não é usada para detectar vazamento EB em imagiologia de imunofluorescência, então esta etapa pode ser omitida.
2. Observação bruta
   1. Execute perfusions cardíacas usando gelada 1 M salina tampão de fosfato (PBS) para limpar o interior da vasculatura cerebral e cérebro.
      1. Usando um bisturi, faça uma incisão abdominal através de todo o comprimento do diafragma.
      2. Corte através de apenas de costelas esquerda da linha média do tórax.
      3. Abra a cavidade torácica. Utilize braçadeiras para expor o coração e para facilitar a drenagem de sangue e outros fluidos.
      4. Segurando firmemente o coração com fórceps (o coração ainda deve estar batendo), diretamente de inserir uma agulha para a saliência do ventrículo esquerdo a alargá-la a aproximadamente 5 mm. fixar a agulha naquela posição, fixando-se perto do ponto de entrada.
         Cuidado: Não excessivamente se estendem a agulha, que pode perfurar a parede interior e comprometer a circulação de soluções.
      5. Libere a válvula para permitir que a solução de PBS gelada da fluxo (200-300 mL) a uma taxa lenta e constante em torno de 20 mL/min utilizando uma bomba de perfusão. Se os animais necessitam de fixação em vez de observação bruta, em seguida, use a mesma dose de solução salina gelada de 0,9%.
      6. Usando a tesoura afiada, fazer uma incisão no átrio, garantindo que a solução flui continuamente. Se o fluido não flui livremente ou está vindo de narinas ou na boca do animal, reposicione a agulha.
   2. Tela para CMHs pela observação grosseira.
      Nota: Se a amostra não é usada no cálculo do número de CMHs pela observação bruta, então esta etapa pode ser omitida.
3. Fixação
   1. Execute perfusions cardíacas usando gelada solução salina 0,9% (200-300 mL) para limpar a vasculatura cerebral e cérebro.
   2. Execute perfusions cardíacas usando gelada paraformaldeído 4% para fixação.
   3. Decapitar o rato, isolar o cérebro e mergulhe o cérebro na solução de sacarose 20% pelo menos 6 h.
   4. Transformar a solução em 30% de sacarose e correção para outro 6h.
4. Prepare-se 10 seções de tecidos cerebrais mm de espessura, usando um criostato.

5. ele mancha

Nota: Este procedimento é realizado usando um ele Kit de coloração.

1. Lave as lâminas em água destilada.
2. Mancha na solução de hematoxilina de 8 min. Lave em água corrente por 5 min.
3. Diferencie em álcool ácido de 1% por 30 s. lavagem em água corrente por 1 min.
4. Mancha na água de amônia de 0,2% (Anil) ou carbonato de lítio saturado solução por 30 s a 1 min. Lave em água corrente por 5 min.
5. Enxaguar em 95% de álcool (10 mergulhos).
6. Corante de contraste com solução de eosina por 30 s a 1 min.
7. Desidrata-se através de 95% de álcool, duas mudanças de álcool absoluto, por 5 min cada.
8. Clara em xilol por 30 s.
9. Montagem utilizando método^{9 de Liu}.
10. Analise usando um microscópio de fluorescência brightfield.
    Nota: glóbulos vermelhos, lançado de vasos sanguíneos, que são os componentes do CMHs, aparecem em vermelho-laranja sob ele mancha.

6. Perl azul da Prússia de coloração

Nota: Este procedimento é realizado usando um Kit de coloração de Perls.

1. Lave os slides com água destilada.
2. Mancha na solução de reação com a mistura de partes iguais de ferrocianeto e ácido clorídrico por 10 min.
3. Desidrata-se, limpar, montar e analisar os slides conforme descrito nas etapas 5.7 – 5.10.

7. EB duplo-coloração

Nota: Este procedimento segue passo 4.1.3.

1. Lave os slides com PBS, três vezes por 5 min cada.
2. Incube com 4', solução de 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) durante 15 minutos à temperatura ambiente.
3. Lavar as lâminas com solução de PBS, três vezes por 5 min cada e montar lâminas com solução de PBS-glicerol.
4. Analise imagens em um microscópio de fluorescência. Deposição de EB é indicada por fluorescência vermelha; núcleos são indicados por fluorescência azul.

8. RESSONÂNCIA MAGNÉTICA-SWI

1. Realize MRI em um ímã 7-T equipado com um sistema de gradiente ativamente blindado (16 cm de diâmetro interno).
2. Sete dias após o tratamento, anestesia os ratos, por inalação de máscara de isoflurano 1,5-2,0%, usando um sistema de anestesia de isoflurano.
3. Aplica o vet pomada para os olhos do rato para evitar ressecamento enquanto sob anestesia.
4. Manter os ratos em posição prona e executar uma varredura de MRI-SWI.
5. Obter digitalizações SWI ponderada utilizando uma sequência de fast-spin eco, usando os seguintes parâmetros: eco tempo (TE) 8 ms, repetição tempo (TR) 40 ms, ângulo da aleta = 12° campo de visão (FOV) 35 mm × 35 mm, matriz de aquisição 384 × 384, para adquirir fatias de 1 mm de espessura.
6. Identificar CMHs no MRI-SWI segundo Greenberg et al . ¹¹, que incluiu os seguintes critérios: (1) de diâmetro ≤ 10 mm e manchas (2) circular, isolado e sinal de baixa intensidade.
7. No final do experimento, eutanásia os ratos usando o método de dióxido de carbono (um fluxo de 6 L/min) ou 30% do volume do recipiente de sobredosagem.

Resultados

CMHs podem ser detectadas usando várias abordagens. Os métodos mais bem aceitados incluem o seguinte: (1) Observação bruta e avaliação da superfície CMHs (mostrado na Figura 1, painel superior); (2) ele mancha para a detecção de células vermelhas do sangue (mostrado na Figura 2A, painel superior) ou prussiana coloração detectando ferro férrico derivado da lise das células vermelhas do sangue (Fi...

Discussão

Estudos sobre CMHs têm aumentado nos últimos anos. No entanto, o mecanismo de CMHs permanece obscuro, levando cientistas para a criação de modelos animais que simulam esta condição particular. Por exemplo, Hoffmann et al . desenvolveu um modelo de rato CMHs induzida por hipóxia que mostra que CMHs são causadas pela hipoxia e o rompimento de autoregulação cerebrovascular¹². Reuter et al . ⁵ estabeleceu um modelo CMHs em ratos transgénicos-APP23, ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
LPS	Sigma-Aldrich	L-2630	for inflammation induction
EB	Sigma-aldrich	E2129	for EB leakage detection
DAPI dying solution	Servicbio	G1012	count medium for IF
Perl’s Prussian staining	Solarbio	G1424	Kit for Prussian staining
HE staining	Solarbio	G1120	Kit for HE staining
chloral hydrate	Sigma-Aldrich	47335U	For anesthesia
phosphate buffer saline (PBS)	Solarbio	P1022	a kind of buffer solution commonly used in experiment
0.9% saline solution	Hainan DonglianChangfu Pharmaceutical Co., Ltd., China		solution for perfusion
paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127	a kind of solution commonly used for fixation
20% sucrose solution	Solarbio	G2461	a kind of solution commonly used for fixation
30% sucrose solution	Solarbio	G2460	a kind of solution commonly used for fixation
vet ointment	Solcoseryl eye gel, Bacel, Switzerland		for rat's eyes protection