Subaigus Microhemorrhages cérébrales induites par l’Injection de lipopolysaccharides chez le rat

Résumé

Nous présentons un protocole pour induire et détecter CMHs provoquées par injection de LPS chez le rat Sprague-Dawley, qui peut être utilisé à l’avenir des recherches sur la pathogénie de CMHs.

Résumé

Microhemorrhages cérébrales (CMHs) sont fréquentes chez les patients âgés et sont corrélées aux divers troubles neuropsychiatriques. L’étiologie de CMHs est complexe et neuro-inflammation est souvent observé comme une cooccurrence. Nous décrivons ici une subaiguë CMHs modèle de rat induit par l’injection du lipopolysaccharide (LPS), mais aussi une méthode de détection injection systémique LPS CMHs. est relativement simple, économique et rentable. Un avantage majeur de l’injection du LPS est sa stabilité pour induire une inflammation. CMHs provoquées par injection LPS pouvaient être décelées par l’observation brute, hématoxyline et éosine (HE) coloration, de Perl souillure Prusse, marquage double bleu Evans (EB) et une technologie d’imagerie (MRI-SWI) sensibilité à la résonance magnétique pondérée. Enfin, les autres méthodes d’élaboration de modèles animaux CMHs, y compris leurs avantages ou désavantages, sont également abordées dans ce rapport.

Introduction

Classiques microhemorrhages cérébrales (CMHs) Voir périvasculaires minuscules dépôts de produits de dégradation du sang comme l’hémosidérine de globules rouges dans le cerveau¹. Selon l’étude de Scan de Rotterdam, CMHs figurait dans près de 17,8 % des personnes âgées de 60 à 69 ans et 38,3 % dans ceux de plus de 80 ans². La prévalence de CMHs chez la personne âgée est relativement élevée, et une corrélation entre l’accumulation de CMHs et dysfonctionnement cognitif et neuropsychiatrique a été établi^3,4. Plusieurs modèles animaux de CMHs ont récemment été rapportés, y compris les modèles de rongeurs induites par le type IV collagénase stéréotaxiques injection⁵, APP transgéniques⁶, exposition de β-N-methylamino-L-alanine,⁷et⁸de l’hypertension, avec CMHs induites par l’inflammation systémique comme l’un des choix plus reconnus. Fisher et al. ⁹ d’abord utilisé LPS dérivés de Salmonella typhimurium pour élaborer un modèle de souris CMHs aiguë. Par la suite, le même groupe a signalé l’élaboration d’un modèle de souris CMHs subaiguë en utilisant la même approche².

LPS est considéré comme une stimulus inflammatoire normalisés par injection intrapéritonéale. Des études antérieures ont confirmé qu’injection LPS pourrait causer la neuro-inflammation telle que reflétée par les grandes quantités de cellules microgliales et activation des astrocytes dans les animaux modèles^2,10. En outre, une corrélation positive entre l’activation de l’activation de la neuro-inflammation et le nombre de CMHs a été établie^2,10. Se fondant sur ces études antérieures, nous a invités à élaborer un modèle de rat CMHs par injection intrapéritonéale de LPS.

Les progrès dans la détection technologies ont entraîné une augmentation du nombre de recherches sur CMHs. Le plus largement reconnu de méthodes de détection CMHs incluent la détection de globules rouges par l’hématoxyline et éosine (HE), coloration, détection de fer ferrique de bleu de Prusse coloration⁹, détection des Evans blue des dépôts par immunofluorescence (EB) imagerie et 7,0 Tesla imagerie par résonance magnétique-susceptibilité pondérée d’imagerie (MRI-SWI)¹⁰. La présente étude vise à développer une méthode de dépistage CMHs.

Protocole

Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvés par l’utilisation Comité (ACUC) de l’hôpital général d’armée PLA et animalier.

1. les matériaux

1. Préparation de l’injection de la LPS
   1. Ajouter 25 mL d’eau distillée à 25 mg de poudre de LPS dérivé de Salmonella typhimurium , à une concentration finale de 1 mg/mL. Stocker l’injection dans un tube stérile à 4 ° C.
      ATTENTION : LPS est toxique.
   2. Préparer une solution EB 2 % dans une solution saline normale 0,9 % à garder une injection d’EB à concentration de travail.

2. les animaux

1. Administrer les LPS à des rats Sprague-Dawley (SD) mâles, âgés de 10 semaines (poids moyen : 280 ± 20 g) par injection intrapéritonéale.
   ATTENTION : Si les rats sont achetés auprès d’une autre organisation, puis la phase d’adaptation ne doit pas être inférieur à 7 jours.

3. Injections de LPS

1. Injecter par voie intrapéritonéale LPS tous les rats à une dose de 1 mg/kg et retourner les rats à la cage de leur maison.
   Remarque : L’anesthésie n’est pas nécessaire.
2. Six heures plus tard, injecter la même dose d’injection de LPS dans les rats.
3. Seize heures plus tard injecter la même dose de LPS dans les rats.
   ATTENTION : Injection de rats SD avec LPS à une dose de 1 mg/kg peut entraîner un taux de mortalité de 5 %. Le taux de mortalité pourrait augmenter encore en rats plus jeunes ou plus âgés ou des rates gravides.
4. Regagner leurs cages les rats après injection de LPS et fournir un accès à la nourriture et de boisson ad libitum .
   NOTE : Rats exposera une réponse inflammatoire systémique distincte, et il est donc essentiel que les cages restent propres tout au long de l’expérience. Rat devrait être fréquemment (2 x jour) surveillance des poids, aspect général et l’attitude après la première injection de LPS. Si les rats commencent à exposer une posture voûtée, la réticence à se déplacer, la perte de poids significative (> 20 %), porphyrine coloration qu’ils être humainement euthanasiés avant le jour 7 EB étude de point de terminaison.

4. le prélèvement

1. Injection de EB
   1. Sept jours après la première injection, anesthésier le rat par voie intrapéritonéale selon votre protocole IACUC approuvé.
   2. Attendre 1 à 2 min jusqu'à ce que les rats ne montrent pas les réponses réflexes cornéens. Effectuer un 5 à 8 mm-perforation cardiaque profond sur chaque rat ; le point perforation devrait être de 5 mm sur la marge gauche du sternum à l’espace intercostaux 3e et 4e.
   3. Attendez jusqu'à ce que la récupération du sang est observée et ensuite injecter EB à une dose de 0,2 mL/100 g de poids corporel dans le ventricule cardiaque gauche.
      ATTENTION : Ponction cardiaque et l’EB injection doivent être effectuées avec soin. EB pourrait être injecté dans la cavité thoracique ou péricarde au lieu du ventricule cardiaque gauche.
      1. Sucer avec un tube vide et remplacer ce volume avec un tube EB avant l’injection pour aider à réduire le taux d’échec (e.g., injection à la cage thoracique par erreur).
   4. Garder le rat dans une position couchée pendant 10 min.
      Remarque : Si l’échantillon n’est pas utilisé pour détecter une fuite d’EB en imagerie de l’immunofluorescence, alors cette étape peut être omise.
2. Observation de brute
   1. Effectuer des perfusions cardiaques en utilisant glacée 1 M saline du tampon phosphate (PBS) pour effacer les vaisseaux cérébraux et la cervelle.
      1. À l’aide d’un scalpel, faites une incision abdominale sur toute la longueur du diaphragme.
      2. Coupe à travers les côtes justes à gauche de la médiane de la cage thoracique.
      3. Ouvert vers le haut de la cavité thoracique. Utilisez des attaches pour exposer au cœur et à faciliter l’écoulement de sang et autres fluides.
      4. Tout en maintenant constamment le cœur avec une pince (cœur devrait encore être battu), directement insérer une aiguille dans la partie saillante du ventricule gauche à l’étendre à environ 5 mm. fixer l’aiguille à cette position de serrage près du point d’entrée.
         ATTENTION : Ne vont pas excessivement l’aiguille, car il peut percer la paroi intérieure et la circulation des solutions de compromis.
      5. Relâcher la valve pour permettre à la solution de PBS glacee débit (200 à 300 mL) à un rythme lent et régulier, à environ 20 mL/min à l’aide d’une pompe à perfusion. Si les animaux ont besoin de fixation au lieu de l’observation brute, puis utiliser la même dose de glacee 0,9 % solution saline.
      6. À l’aide de ciseaux pointus, faites une incision dans l’atrium, veiller à ce que la solution s’écoule en continu. Si le liquide ne s’écoule pas librement ou provenance des narines ou la bouche de l’animal, repositionner l’aiguille.
   2. Écran pour CMHs par observation brute.
      Remarque : Si l’échantillon n’est pas utilisé dans le calcul du nombre de CMHs par observation brute, alors cette étape peut être omise.
3. Fixation
   1. Effectuer des perfusions cardiaques en utilisant glacee 0,9 % solution saline (200 à 300 mL) pour effacer les vaisseaux cérébraux et la cervelle.
   2. Effectuer des perfusions cardiaques à l’aide de paraformaldéhyde glacée de 4 % pour la fixation.
   3. Décapiter le rat, d’isoler le cerveau et immergez le cerveau dans la solution de saccharose de 20 % pendant au moins 6 h.
   4. Changez la solution à 30 % de saccharose et de fixer un autre 6 h.
4. Préparer 10 sections de tissus de cerveau mm d’épaisseur à l’aide d’un cryostat.

5. il a une coloration

Remarque : Cette procédure est effectuée à l’aide d’un Kit de coloration de l’il.

1. Laver les lames dans l’eau distillée.
2. Tache dans la solution de l’hématoxyline pendant 8 min. laver à l’eau courante pendant 5 min.
3. Différencier dans 1 % d’alcool acide pour 30 s. lavage à l’eau courante pendant 1 min.
4. Détachant à 0,2 % d’eau ammoniaque (bleuissement) ou saturée au lithium carbonate solution pendant 30 s à 1 min. laver à l’eau courante pendant 5 min.
5. Rincer à l’alcool à 95 % (10 dips).
6. Contre-colorant avec solution d’éosine pendant 30 s à 1 min.
7. Déshydrater à travers de l’alcool à 95 %, deux changements d’alcool absolu, de 5 min chacun.
8. Claire dans le xylène pendant 30 s.
9. Montez à l’aide de la méthode^{9 de Liu}.
10. Analyser à l’aide d’un microscope à fluorescence fond clair.
    NOTE : culots globulaires, libéré des vaisseaux sanguins, qui sont les constituants de CMHs, figurent en rouge-orangé il coloration sous.

6. bleu de Prusse de Perl coloration

Remarque : Cette procédure est effectuée à l’aide d’un Kit de coloration de Perls.

1. Les lames avec de l’eau distillée.
2. Une coloration en solution de réaction avec mélange de parties égales de ferrocyanure et acide chlorhydrique pendant 10 min.
3. Déshydrater, effacer, monter et d’analyser les diapositives comme décrit aux points 5.7 – 5.10.

7. EB double coloration

Remarque : Cette procédure suit étape 4.1.3.

1. Les lames avec du PBS trois fois de 5 min chacun.
2. Incuber les lames avec 4', 6-diamidino-2-phénylindole solution de (DAPI) pendant 15 min à température ambiante.
3. Laver les lames avec une solution de PBS trois fois de 5 min chacun et monter les lames avec une solution de PBS-glycérol.
4. Analyser les images sur un microscope à fluorescence. Les dépôts de EB sont indiquée par une fluorescence rouge ; les noyaux sont indiqués par fluorescence bleue.

8. IRM-SWI

1. Effectuer MRI sur un aimant 7-T équipé d’un système de gradient activement blindé (diamètre intérieur de 16 cm).
2. Sept jours après le traitement, anesthésier les rats par inhalation d’un masque de 1,5 à 2,0 % isoflurane, à l’aide d’un système d’anesthésie isoflurane.
3. Pommade vétérinaire sur les yeux du rat pour prévenir le dessèchement tandis que sous anesthésie.
4. Gardez les rats en position couchée et effectuer un balayage de MRI-SWI.
5. Obtenir des scans SWI pondérée à l’aide d’une séquence d’écho de spin rapide utilisant les paramètres suivants : écho temps (TE) 8 ms, répétition (TR) du temps 40 ms, flip angle = 12°, champ de vision (FOV) 35 mm × 35 mm, matrice acquisition 384 × 384, afin d’acquérir 1 tranches de mm d’épaisseur.
6. Identifier CMHs dans MRI-SWI selon Greenberg et al. ¹¹, qui comprenait les critères suivants : (1) de diamètre ≤ 10 mm et taches d’intensité (2) circulaire, isolé et faible signal.
7. À la fin de l’expérience, euthanasier les rats en utilisant la méthode de dioxyde de carbone (un débit de 6 L/mn) ou 30 % du volume contenant de surdosage.

Résultats

CMHs peuvent être détectées en utilisant diverses approches. Les méthodes plus reconnus sont les suivants : (1) brut d’observation et d’évaluation de surfaces CMHs (illustré à la Figure 1, panneau supérieur) ; (2) il a une coloration pour la détection des culots globulaires (illustré à la Figure 2 a, panneau supérieur) ou prussien coloration ferrique détection dérivé de la lyse des globules rouges (

Discussion

Études de recherche sur CMHs ont augmenté au cours des dernières années. Toutefois, le mécanisme de CMHs reste peu clair, ce qui incite les chercheurs à établir des modèles animaux qui simulent cette condition particulière. Par exemple, Hoffmann et al. mis au point un modèle de souris CMHs induite par l’hypoxie qui montre que CMHs sont causées par l’hypoxie et la perturbation de l’autorégulation cérébrovasculaire¹². Reuter et al. ⁵ a é...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
LPS	Sigma-Aldrich	L-2630	for inflammation induction
EB	Sigma-aldrich	E2129	for EB leakage detection
DAPI dying solution	Servicbio	G1012	count medium for IF
Perl’s Prussian staining	Solarbio	G1424	Kit for Prussian staining
HE staining	Solarbio	G1120	Kit for HE staining
chloral hydrate	Sigma-Aldrich	47335U	For anesthesia
phosphate buffer saline (PBS)	Solarbio	P1022	a kind of buffer solution commonly used in experiment
0.9% saline solution	Hainan DonglianChangfu Pharmaceutical Co., Ltd., China		solution for perfusion
paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127	a kind of solution commonly used for fixation
20% sucrose solution	Solarbio	G2461	a kind of solution commonly used for fixation
30% sucrose solution	Solarbio	G2460	a kind of solution commonly used for fixation
vet ointment	Solcoseryl eye gel, Bacel, Switzerland		for rat's eyes protection