التركيب البلوري للمجال الطرفي ن من مستقبلات ريانوديني من إكسيلوستيلا بلوتيلا

Summary

في هذه المقالة، نحن وصف بروتوكولات تحديد التعبير وتنقية وبلورة وبنية البروتين المجال الطرفي ن من مستقبلات ريانوديني من فراشة diamondback (إكسيلوستيلا بلوتيلا).

Abstract

قد تم تطوير مبيدات حشرية قوية وفعالة تستهدف مستقبلات ريانوديني الحشرات (ريرس) من اهتمام كبير في مجال السيطرة على الآفات الزراعية. حتى الآن، العديد من مبيدات الحشرات دياميدي تستهدف مكافحة الآفات قد تم تسويقها ريرس، التي تدر الدخل السنوي 2 بیلیون دولار أمريكي. ولكن فهم طريقة عمل المبيدات الحشرية استهداف RyR محدودة بسبب الافتقار إلى المعلومات الهيكلية المتعلقة بالحشرات RyR. هذا بدوره يحد من فهم التنمية لمقاومة المبيدات الحشرية في الآفات. العثة diamondback (DBM) هو آفة مدمرة تدمير المحاصيل الصليبية في العالم، الذي ذكر أيضا تبدي مقاومة للمبيدات الحشرية دياميدي. ولذلك، أنها ذات أهمية عملية كبيرة لتطوير المبيدات الحشرية رواية استهداف RyR ديسيبل، تستهدف خصوصا منطقة مختلفة من موقع الربط دياميدي التقليدية. نقدم هنا، بروتوكولا لوصف المجال الطرفي ن من RyR من ديسيبل هيكلياً. بنية بلورية الأشعة السينية تم حلها عن طريق الاستبدال الجزيئي بدقة من 2.84، الذي يوضح فكرة قابلة لطي بيتا-البرسيم والحلزون ألفا ترافقه. هذا البروتوكول يمكن تكييفها للتعبير، وتنقية وتوصيف الهيكلية للبروتينات أو المجالات الأخرى بشكل عام.

Introduction

مستقبلات ريانوديني (ريرس) هي قنوات أيون محددة، والتوسط تخلل Ca^{2 +} الأيونات عبر الأغشية شبكية الشبكة (SR) في خلايا العضلات. ولذلك، أنها تلعب دوراً مهما في اقتران عملية انكماش الإثارة. في شكله الوظيفي، تجمع RyR هومو تيترامير مع كتلة جزيئية من > 2 نجمة داود الحمراء، مع كل وحدة فرعية تتألف من بقايا الأحماض الأمينية ~ 5000. في الثدييات، هناك ثلاثة إيسوفورمس: RyR1-نوع الهيكل العظمى والعضلات وعضلة القلب نوع RyR2-وأعربت عن أوبيكويتوسلي في أنسجة مختلفة¹-RyR3.

في الحشرات هناك نوع واحد فقط من RyR، التي يعبر عنها في أنسجة العضلات والجهاز العصبي². RyR الحشرات أكثر مماثلة للثدييات RyR2 مع هوية تسلسل من حوالي 47%³. تم تطوير مبيدات الحشرات دياميدي استهداف RyR قشريات الجناح و Coleoptera وتسويقها من قبل شركات كبرى مثل باير (فلوبيندياميدي)، دوبون (تشلورانترانيليبرولي) وسينجينتا (سيانترانيليبرولي). منذ إطلاقها مؤخرا نسبيا، أصبحت المبيدات الحشرية دياميدي واحدة من الفئة الأسرع نمواً من المبيدات الحشرية. حاليا، تجاوزت المبيعات من هذه المبيدات الحشرية ثلاثة سنوياً 2 بیلیون دولار أمريكي بمعدل نمو بلغ أكثر من 50% منذ 2009 (أجرانوفا).

وأفادت الدراسات الأخيرة وضع المقاومة في الحشرات بعد بضعة أجيال من استخدام هذه المبيدات الحشرية^4،،من^56،،من⁷⁸. المقاومة الطفرات في المجال ترانسميمبراني من ريرس من العثة diamondback (ديسيبل)، إكسيلوستيلا بلوتيلا (G4946E، I4790M) والمواقف المقابلة في نافقة أوراق الحمضيات الطماطم, توتا absoluta (G4903E، I4746M) تبين أن المنطقة قد يكون متورطا في ربط المبيد الحشري دياميدي كما هو معروف في هذه المنطقة أن تكون حاسمة بالنسبة النابضة للقناة^4،،من⁸⁹. على الرغم من بحوث مستفيضة في هذا المجال، لا تزال الآليات الجزيئية الدقيقة للمبيدات الحشرية دياميدي بعيدة المنال. وعلاوة على ذلك، من غير الواضح ما إذا كانت تؤثر الطفرات المقاومة على التفاعلات مع دياميديس اللوستيريكالي مباشرة أو غير مباشرة.

وأفادت الدراسات السابقة بنية المجالات RyR العديد من أنواع الثدييات، وهيكل كامل طول RyR1 الثدييات و RyR2 بعلم البلورات بالأشعة السينية والميكروسكوب الإلكتروني cryo، على التوالي^{10،11، 12،13،،}من^{1415،16،17،،}من^1819،20،21 . ولكن حتى الآن، لا يوجد هيكل الحشرات RyR لم يبلغ، التي تحظر لنا من فهم تعقيدات الجزيئية لوظيفة مستقبلات فضلا عن الآليات الجزيئية لعمل المبيدات الحشرية والتنمية لمقاومة المبيدات الحشرية.

في هذه المخطوطة، نقدم بروتوكول معمم لتوصيف الهيكلي الطرفي ن β-البرسيم المجال من مستقبلات ريانوديني من العثة diamondback، الآفات مدمرة إصابة المحاصيل الصليبية في العالم²². تم تصميم بنية وفقا لأرنب المنشورة RyR1 NTD كريستال هياكل^23،24والبرد-م النماذج الهيكلية^16،17،،من^{1819، 20 , 21}-هذا هو هيكل عالي الاستبانة الأولى ذكرت للحشرات RyR، الذي يكشف عن إليه لقناة النابضة ويقدم نموذجا هاما لتطوير المبيدات الحشرية إبلاغها باستخدام المخدرات على أساس هيكل تصميم. لتوضيح الهيكل، استخدمنا علم البلورات بالأشعة السينية، الذي يعتبر بمثابة 'المعيار الذهبي' لتصميم هيكل البروتين في القرب من القرار الذري. على الرغم من أن عملية تبلور يمكن التنبؤ بها وكثيفة العمالة، وهذا البروتوكول خطوة بخطوة ستساعد الباحثين التعبير عن وتنقية وتوصيف مجالات أخرى من الحشرات RyR أو غيرها من البروتينات بشكل عام.

Protocol

1-استنساخ الجينات والتعبير البروتين، وتنقية

1. [بكر] تضخيم الحمض النووي المقابلة للبروتين للفائدة (بقايا 1-205 من RyR ديسيبل، بنك الجينات الإدارية لا. AFW97408) واستنساخ في ناقلات الحيوانات الأليفة-28 ألف-جرارات باستنساخ مستقلاً عن عملية ربط (يسانس)²⁵. ناقل هذا يحتوي على علامة الحامض الأميني والعلامة MBP وموقع TEV انقسام حوزتي في ن-المحطة¹⁵-
   1. تصميم المحامي كبسولة تفجير لتضخيم جينات المستهدفة مع الملحقات المتوافقة مع المحامي 5 ':
      إلى الأمام المحامي التمهيدي:
      تاكتككاتككاتجكاتجكجاجكجاججج 3 '5'
      عكس المحامي التمهيدي:
      تاتككاكتككاتجتاتاتاتجككجتكككجتاكجك 3 '5'
   2. الجمع بين المكونات رد فعل (50 ميكروليتر): 1 ميكروليتر من قوالب الحمض النووي (100 نانوغرام/ميكروليتر)، 1 ميكروليتر من التمهيدي إلى الأمام (10 ميكرومترات)، 1 ميكروليتر من عكس التمهيدي (10 ميكرومترات)، ميكروليتر 0.5 من بوليميريز الحمض النووي (NEB)، ميكروليتر 5 10 x رد فعل المخزن المؤقت، 1 ميكروليتر من دنتب (25 مم) ، 40.5 ميكروليتر من رناسي مجاناً ddH₂o.
      1. ضع المخلوط رد فعل في جهاز PCR وتشغيل البرنامج التالي.
      2. احتضان عند 95 درجة مئوية لمدة 3 دقائق، ثم قم بتشغيل دورات 30 (95 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، 58 درجة مئوية لمدة 15 ق، 72 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة). احتضان عند 72 درجة مئوية لمدة 5 دقائق وثم اضغط على 4 درجة مئوية.
      3. تشغيل هذا المزيج رد كامل (50 ميكروليتر) على 2% [اغروس] هلام واستخراج مع "مجموعة استخراج هلام". اتبع البروتوكول الخاص بالشركة المصنعة.
   3. مستقلة عن عملية ربط الاستنساخ (يسانس)
      1. أداء SspI الهضم (60 ميكروليتر): 20 ميكروليتر من ناقلات الحمض النووي (50 نانوغرام/ميكروليتر)، ميكروليتر 6 من 10 س رد فعل المخزن المؤقت و 4 ميكروليتر من SspI ميكروليتر 30 ddH₂إينكوباتي سين في 37 درجة مئوية حاء 3 تشغيل رد فعل كامل المزيج على 1% [اغروس] هلام واستخراج مع "مجموعة استخراج هلام". اتبع البروتوكول الخاص بالشركة المصنعة.
      2. إجراء معاملة T4 دنا بوليميريز ناقل وإدراج الحمض النووي. الجمع بين ما يلي: 5 ميكروليتر من الحمض النووي متجه أو إدراج (50 نانوغرام/ميكروليتر)، ميكروليتر 2 10 x T4 المخزن المؤقت بوليميراز الدنا، 1 ميكروليتر من دجتب (25 مم) لناقل أو 1 ميكروليتر من دكتب (25 مم) لإدراج الحمض النووي، 1 ميكروليتر من DTT (100 ملم)، 0.4 ميكروليتر من T4 دنا بوليميريز (المحامي مؤهل) ، و 9.6 ميكروليتر ddH₂O. إينكوباتي ردود الفعل في درجة حرارة الغرفة لأنزيم 40 دقيقة إلغاء تنشيط الحرارة عند 75 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
         ملاحظة: ناقل المحامي وإدراج الحمض النووي يجب معاملة منفصلة من ردود الفعل.
      3. أداء المحامي الصلب رد فعل. الجمع بين ما يلي: 2 ميكروليتر إدراج معاملة T4 الحمض النووي، 2 ميكروليتر من المحامي معاملة T4 ناقلات الحمض النووي. تبني رد الفعل في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق.
2. تحويل BL21 (DE3) كولاي الخلايا مع هذا بلازميد المؤتلف.
   1. ذوبان الجليد الخلايا المختصة (50 ميكروليتر في أنبوب مايكرو--أجهزة الطرد المركزي) على الجليد.
   2. إضافة حوالي 1 ميكروليتر (50 نانوغرام) من بلازميد في الأنبوب. مزيج الخلايا والحمض النووي بالتحريك بلطف الأنبوب 2 – 3 مرات. ضع الأنبوبة في الثلج لمدة 20 دقيقة.
   3. حرارة صدمة في 42 درجة مئوية لمكان س. 40 الأنبوب على الجليد مرة أخرى للحد الأدنى 2 إضافة 1 مل من وسائل الإعلام في درجة حرارة الغرفة رطل إلى الأنبوب.
   4. مكان الأنبوب المخلوط في شاكر 250 دورة في الدقيقة في 37 درجة مئوية ل 45 دقيقة نشر 150-200 ميليلتر من المخلوط على لوحات مختارة. عكس اللوحة واحتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
3. اختيار مستعمرة واحدة وثقافة الخلايا في المتوسط 2YT 100 مل يحتوي على 50 ميكروغرام/مل كاناميسين عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها. صباح اليوم التالي، تطعيم 1 لتر 2YT المتوسطة التي تحتوي على 50 ميكروغرام/مل كاناميسين مع 10 مل ثقافة بين عشية وضحاها، واحتضان في 37 درجة مئوية شاكر حاضنة 250 لفة في الدقيقة، حتى يصل OD₆₀₀ ~ 0.6. وبعد ذلك حمل الثقافة مع إيبتج بتركيز نهائي من 0.4 مم وتنمو لآخر ح 5 في 30 درجة مئوية.
4. حصاد الخلايا باستخدام الطرد المركزي في س 8,000 ز لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية، وجمع الخلايا وريسوسبيند كل الخلايا ز 10 في المخزن المؤقت لتحلل 40 مل (10 ملم حبيس الأس الهيدروجيني 7.4، 250 ملم بوكل، β-mercaptoethanol 10 مم، 25 ميكروغرام/مل lysozyme، 25 ميكروغرام/مل الدناز ، 1 مم بمسف).
   1. عرقلة من قبل سونيكيشن في السعة 65% لمدة 8 دقائق مع 1 ق ق 1 وعلى الخروج. إزالة الأنقاض الخلية باستخدام الطرد المركزي في 40,000 س ز لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية. تصفية المادة طافية بتمرير من خلال 0.22 ميكرومتر التصفية وتحميله في حلقة عينة.
5. تنقية البروتين الانصهار وتنشق العلامة وإعادة تنقية البروتين الهدف.
   1. تنقية البروتين الانصهار باستخدام عمود ني-جاتا (المخزن المؤقت ملزم: 10 ملم حبيس الأس الهيدروجيني 7.4، 250 ملم بوكل؛ وشطف المخزن المؤقت: 10 ملم حبيس الأس الهيدروجيني 7.4، 250 ملم بوكل، ايميدازول 500 ملم) وتنقية بنظام تنقية، مع تدرج خطي ايميدازول 20-250 ملم.
   2. تنشق البروتين المستهدف التيد بحوزتي TEV (01:50 نسبة) بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
   3. تنقية الخليط رد فعل الانقسام باستخدام عمود الراتنج اميلوز (ربط المخزن المؤقت: 10 ملم حبيس الأس الهيدروجيني 7.4، 250 ملم بوكل؛ وشطف المخزن المؤقت: 10 ملم حبيس الأس الهيدروجيني 7.4، 250 ملم بوكل، مالتوس 10 ملم) وعمود ني-الإدارة الوطنية للسياحة لإزالة العلامة وحوزتي TEV. سوف تكون البروتين المستهدف في التدفق من خلال جزء صغير من هذين العمودين.
   4. دياليزي العينة ضد المخزن المؤقت للغسيل الكلوي (الرقم الهيدروجيني 10 ملم تريس-HCl 8.8، 50 مم بوكل، β-mercaptoethanol 10 ملم لخفض تركيز الملح. تنقية العينة على عمود صرف شاردة (المخزن المؤقت ملزم: 10 ملم تريس-HCl الأس الهيدروجيني 8.8، 10 مم β-mercaptoethanol؛ وشطف المخزن المؤقت: 10 ملم تريس-HCl الأس الهيدروجيني 8.8، 1 م بوكل، β-mercaptoethanol 10 ملم) بتدرج خطي من 20 – 500 مم بوكل في المخزن المؤقت شطف.
   5. كخطوة أخيرة في عملية تنقية، تركيز البروتين باستخدام مركزات الطرد المركزي (كاتشين موكو 10) وحقن في عمود هلام ترشيح للتأكد من التجانس سوبيرديكس 200 26/600.
6. فحص نقاء البروتين بتشغيله على الحزب الديمقراطي الصربي 15% صفحة.
   ملاحظة: يتم تشغيل كافة الأعمدة على نظام تنقية بروتين مع تدفق ملزم بمعدل 2 مل/دقيقة، ومعدل تدفق شطف 4 مل/دقيقة باستثناء الترشيح جل في 1 مل/دقيقة.

2-البروتين إعداد وبلورة

1. تركيز العينة البروتين المنقي إلى 10 ملغ/مل تستخدم exchange المخزن المؤقت إلى المخزن المؤقت لبلورة ومركزات الطرد المركزي (كاتشين موكو 10) قبل تخزينها في-80 درجة مئوية.
2. إجراء فحص التبلور (نسبة 1:1، 200 nL من البروتين و 200 nL من المخزن المؤقت للخزان) بالجلوس إسقاط أسلوب نشر بخار في ك 295 مع عدة مجموعات تبلور باستخدام سائل الآلي التعامل مع نظام الروبوتية في شكل 96-جيدا.
   ملاحظة: قمنا باستخدام مجموعات من البحث الأبعاد الجزيئية وهامبتون ومناولة السائل النظام الآلي العنقاء.
3. إغلاق لوحة تبلور 96-جيدا لمنع التبخر وتمكين الموازنة انخفاض البروتين مع المخزن المؤقت الخزان. ثم الاحتفاظ اللوحات في الحاضنة كريستال عند 18 درجة مئوية.
4. تحقق من لوحات 96-جيدا دورياً باستخدام مجهر ضوء لرصد تشكيل الكريستال والنمو.
5. للتفريق بين بلورات البروتين من بلورات الملح، استخدم صبغة بروتين. أضف 1 ميليلتر من صبغة لإسقاط الهدف. انتظر حوالي 1 ح ومراقبة تحت المجهر. سوف تتحول بلورات البروتين الأزرق.
6. استخدام شروط تبلور الإيجابية (كبريتات أمونيوم 1.5 م، م 0.1 تريس pH 8.0) لمواصلة تحسين بلورات معلقة باستخدام إسقاط أسلوب نشر بخار في لوحات 24-جيدا.
   1. تحسين درجة الحموضة من 7.0 إلى 8.5 مع الأس الهيدروجيني 0.5 وحدة الفاصل الزمني كل خطوة. تحسين تركيز كبريتات الأمونيوم من 1.2 متر إلى 1.7 متر مع الفاصل 0.1 م كل خطوة. (في حالتنا كان أفضل حالة إنتاج بلورات كبيرة على شكل لوحة كبريتات الأمونيوم pH 7.0 و 1.6 متر حبيس 0.1 M)

3. الكريستال تصاعد وجمع البيانات بالأشعة السينية، وتصميم هيكل

1. جبل البلورات في كريولوب وبارد فلاش في النتروجين السائل باستخدام محلول خزان يحتوي على الجلسرين 20% كالبرد-protectant. ضع البلورات في أونيبوك للتخزين والنقل.
2. قبل شاشة بلورات البروتين باستخدام ديفراكتور الأشعة سينية ريجاكو داخلية. اختر أفضل منها بقرارات أعلى لجمع البيانات في مرافق السنكروتروني (لدينا مجموعة من البيانات تم تجميعها من BL17U1 في شانغهاي الإشعاع السنكروتروني مرفق).
   1. استخدام برمجيات التحكم بيمليني بلويسي²⁶ لتحميل ومركز البلورات بوظيفة التوسيط التلقائي أو اليدوي. إجراء اختبار التعرض لتحديد استراتيجية جمع البيانات، بما في ذلك ابتداء من الزاوية والمسافة الكاشف، عرض الإطار ووقت التعرض الأرقام.
   2. جمع البيانات وبناء على ذلك (جمعنا إطارات 180 مع وقت التعرض s 1، عرض الإطار 1° والمسافة للكشف عن 350 مم).
3. فهرسة ودمج وتوسيع نطاق مجموعة البيانات باستخدام HKL2000 جناح²⁷. أولاً القيام بوظيفة البحث الذروة للبحث عن البقع الحيود، والفهرس ثم البقع وحدد مجموعة الفضاء الصحيح. بعد التكامل الذروة، وتوسيع نطاق مجموعة البيانات مع النموذج الصحيح خطأ وحفظ ملف.sca الإخراج.
4. حل مشكلة المرحلة باستبدال الجزيئية باستخدام فيزر²⁸ في فينيكس²⁹.
   1. حساب عدد جزيئات البروتين في الوحدة غير المتناظر نسخة ممكن إكسترياجي³⁰.
   2. البحث عن قوالب بنية سليمة مع تسلسل عالية التشابه الهيكلية والهوية كالبروتين المستهدفة باستخدام الهياكل المعروفة من الأدب أو النماذج التي تولدها بنية التنبؤ الخادم مثل Phyre2³¹ (استخدمنا الأرنب RyR1 NTD ك نموذج بحث، 2XOA معرف PDB).
   3. تشغيل فيزر باستخدام ملف البيانات الحيود وقالب بنية الملف والملف تسلسل البروتين لإيجاد الحل.
5. أداء أوتوبويلد³² في فينيكس²⁹ لتوليد النموذج الأولى باستخدام ملف الإخراج من فيزر وملف تسلسل من البروتين الهدف.
6. يدوياً بناء الهيكل في كثافة الإلكترون التجريبية المعدلة باستخدام أبله³³ وصقل باستخدام phenix.refine³⁴ في دورات متكررة.
7. التحقق من صحة النموذج النهائي باستخدام أدوات التحقق من صحة في فينيكس¹⁸.

النتائج

تنقية

وأعرب المجال الطرفي ن من RyR ديسيبل بروتين انصهار مع علامة هيكساهيستيديني وعلامة MBP وموقع انقسام حوزتي TEV. نحن اتباع استراتيجية تنقية خمس خطوات للحصول على بروتين نقي جداً، مناسبة لغرض بلورة. في البداية، كان تنقية البروتين الانصهار من ا...

Discussion

في هذه الورقة، ونحن تصف الإجراء الذي ريكومبينانتلي إكسبريس وتنقية وبلورة وتحديد هيكل ديسيبل RyR NTD. للتبلور، شرط حاسم للحصول على البروتينات مع الذوبان العالية والنقاء والتجانس. لدينا بروتوكول، اخترنا أن استخدام ناقلات الحيوانات الأليفة-28 ألف-جرارات كما أنه يحتوي على علامة هيكساهيستيديني ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
pET-28a-HMT vector			This modified pET vector contains a hexahistidine tag, an MBP fusion protein and a TEV protease cleavage site at the N-terminus (Lobo and Van Petegem, 2009)
E. coli BL21 (DE3) strain	Novagen	69450-3CN
HisTrapHP column (5 mL)	GE Healthcare	45-000-325
Amylose resin column	New England Biolabs	E8021S
Q Sepharose high-performance column	GE Healthcare	17-1154-01
Amicon concentrators (10 kDa MWCO)	Millipore	UFC901008
Superdex 200 26/600 gel-filtration column	GE Healthcare	28-9893-36
Automated liquid handling robotic system	Art Robbins Instruments	Gryphon
96 Well CrystalQuick	Greiner bio-one	82050-494
Uni-Puck	Molecular Dimensions	MD7-601
Mounted CryoLoop - 20 micron	Hampton Research	HR4-955
CryoWand	Molecular Dimensions	MD7-411
Puck dewar loading tool	Molecular Dimensions	MD7-607
Nano drop	Thermo Scientific	NanoDrop One
Crystal incubator	Molecular Dimensions	MD5-605
X-Ray diffractor	Rigaku	FRX
PCR machine	Eppendorf	Nexus GX2
Plasmid mini-prep kit	Qiagen	27104
Gel extraction kit	Qiagen	28704
SspI restriction endonuclease	NEB	R0132S
T4 DNA polymerase	Novagen	2868713
Kanamycin	Scientific Chemical	25389940
IPTG	Genview	367931
HEPES	Genview	7365459
β-mercaptoethanol	Genview	60242
Centrifuge	Thermo Scientific	Sorvall LYNX 6000
Sonnicator	Scientz	II-D
Protein purification system	GE Healthcare	Akta Pure
Light microscope	Nikon	SMZ745
IzIt crystal dye	Hampton Research	HR4-710
Electrophoresis unit	Bio-Rad	1658005EDU
Shaker Incubator	Zhicheng	ZWYR-D2401
Index crystal screen	Hampton Research	HR2-144
Structure crystal screen	Molecular Dimensions	MD1-01
ProPlex crystal screen	Molecular Dimensions	MD1-38
PACT premier crystal screen	Molecular Dimensions	MD1-29
JCSG-plus crystal screen	Molecular Dimensions	MD1-37