Estrutura cristalina do domínio N-terminal do Ryanodine Receptor de Plutella plutella

Resumo

Neste artigo, descrevemos os protocolos de determinação de estrutura, purificação, cristalização e expressão da proteína do domínio N-terminal do receptor de ryanodine do diamondback moth (Plutella plutella).

Resumo

Desenvolvimento de inseticidas potentes e eficientes como alvo receptores ryanodine inseto (RyRs) tem sido de grande interesse na área de controle de pragas agrícolas. Até à data, vários insecticidas de diamido visando pragas que ryrs ter sido comercializados, que geram receita anual de 2 bilhões de dólares. Mas a compreensão do modo de ação de inseticidas RyR-direcionamento é limitada pela falta de informações estruturais sobre inseto RyR. Isto por sua vez restringe a compreensão do desenvolvimento da resistência de inseticida em pragas. O diamondback moth (DBM) é uma praga devastadora destruindo crucíferas culturas em todo o mundo, que também tem sido relatada para mostrar resistência aos inseticidas de diamido. Portanto, é de grande importância prática para desenvolver novas inseticidas visando o RyR DBM, especialmente visando uma região diferente do local de ligação do diamido tradicional. Aqui, apresentamos um protocolo para caracterizar estruturalmente o domínio N-terminal do RyR da DBM. A estrutura de cristal de raio-x foi resolvida por substituição molecular em uma resolução de 2.84 Å, que mostra um motivo de dobramento de beta-trevo e uma acompanhamento alfa-hélice. Este protocolo pode ser adaptado para a expressão, purificação e caracterização estrutural de proteínas ou outros domínios em geral.

Introdução

Ryanodine receptors (RyRs) são canais de íon específico, que mediam a permeação dos íons de Ca^{2 +} através das membranas do retículo sarcoplasmático (RS) em células musculares. Portanto, eles jogam um papel importante na processo de acoplamento excitação contração. Na sua forma funcional, RyR monta como um homo-tetrâmero com uma massa molecular de > 2 MDa, com cada subunidade composto por resíduos de aminoácidos ~ 5000. Em mamíferos, existem três isoformas: RyR1 - tipo de músculo esquelético, RyR2 - tipo de músculo cardíaco e RyR3-ubiquitously expressa em tecidos diferentes¹.

Em insetos, há apenas um tipo de RyR, que é expresso no tecido muscular e nervoso². Inseto RyR é mais semelhante a mamíferos RyR2 com uma identidade de sequência de cerca de 47%³. Inseticidas de diamido segmentação RyR de Lepidoptera e Coleoptera foram desenvolvidas e comercializadas por grandes empresas como Bayer (flubendiamida), DuPont (chlorantraniliprole) e Syngenta (cyantraniliprole). Desde o seu lançamento relativamente recente, diamido inseticidas tornaram-se uma das classe mais rápido crescimento de inseticidas. Atualmente, as vendas destes três inseticidas anualmente cruzaram 2 bilhões dólares americanos com uma taxa de crescimento de mais de 50% desde 2009 (Agranova).

Estudos recentes têm relatado o desenvolvimento de resistência em insetos, depois de algumas gerações de uso destes inseticidas^4,5,6,7,8. As resistência mutações no domínio transmembrana de RyRs do diamondback moth (DBM), Plutella plutella (G4946E, I4790M) e as posições correspondentes em Minador do tomate, Tuta absoluta (G4903E, I4746M) mostram que a região pode ser envolvido na ligação de inseticida de diamido como esta região é conhecida por ser crítico para retenção do canal^4,8,9. Apesar de inúmeras pesquisas nesta área, os mecanismos moleculares exatos de diamido inseticidas permanecem indescritíveis. Além disso, não está claro se as mutações de resistência afetam as interações com diamides diretamente ou qual alostericamente.

Estudos anteriores relataram a estrutura de vários domínios RyR de espécies de mamíferos e a estrutura de completos mamíferos RyR1 e RyR2 por cristalografia de raios x e microscopia cryo-elétron, respectivamente^{10,11, 12,13,14,15,16,17,18,19,20,21} . Mas até agora, nenhuma estrutura de insecto RyR foi relatada, que nos proíbe de compreender os meandros moleculares da função do receptor, bem como os mecanismos moleculares de ação inseticida e desenvolvimento de resistência de inseticida.

Este manuscrito, apresentamos um protocolo de generalizadas para caracterização estrutural de domínio de β-trevo N-terminal do receptor de ryanodine do diamondback moth, uma praga destrutivo infectando crucíferos culturas no mundo²². A construção foi projetada de acordo com o coelho publicado RyR1 NTD cristal estruturas^23,24e o cryo-EM modelos estruturais^{16,17,18,19, 20 , 21}. esta é a primeira estrutura de alta resolução, relatada por inseto RyR, que revela o mecanismo de retenção de canal e fornece um modelo importante para o desenvolvimento de inseticidas espécie-específicos usando drogas baseada em estrutura de design. Para a elucidação da estrutura, utilizamos a cristalografia de raios x, que é considerada como o "padrão ouro" para a determinação da estrutura da proteína em perto de resolução atômica. Embora o processo de cristalização é imprevisível e trabalho intensivo, este protocolo passo a passo ajudará pesquisadores a express, purificar e caracterizar outros domínios de inseto RyR ou qualquer outras proteínas em geral.

Protocolo

1. Gene clonagem e expressão de proteínas purificação

1. PCR amplificar DNA correspondente à proteína de interesse (resíduos 1-205 de DBM RyR, Genbank ACC. n. AFW97408) e clone em vetor de animal de estimação-28a-HMT por clonagem independente de ligadura (LIC)²⁵. Este vetor contém uma marca de histidina, tag MBP e um local de clivagem de protease TEV no N-terminal¹⁵.
   1. Projeto LIC primers para amplificação do gene alvo com extensões 5' LIC-compatível com:
      Encaminhar a cartilha LIC:
      5' TACTTCCAATCCAATGCAATGGCGGAAGCGGAAGGGG 3'
      Cartilha LIC inversa:
      5' TTATCCACTTCCAATGTTATTATATGCCGGTCCCGTACGGC 3'
   2. Combinar os componentes da reação (50 μL): 1 μL de modelos de DNA (100 ng/μL), 1 μL de primer para a frente (10 μM), 1 μL de primer reverso (10 μM), 0,5 μL de DNA polimerase (NEB), 5 μL de reação 10x buffer, 1 μL de dNTP (25 mM) , 40.5 μL de RNase free ddH₂O.
      1. Coloque a mistura de reação em uma máquina PCR e executar o programa a seguir.
      2. Incubar a 95 ° C por 3 min, e em seguida, executar 30 ciclos de (95 ° C por 30 s, 58 ° C, por 15 s, 72 ° C por 1 min). Incubar a 72 ° C por 5 min e em seguida, mantenha a 4 ° C.
      3. Executar a mistura de reação inteira (50 μL) em um gel de agarose 2% e extrair com um Kit de extração do Gel. Siga o protocolo do fabricante.
   3. Independente de ligadura da clonagem (LIC)
      1. Realizar a digestão SspI (60 μL): 20 μL de DNA de vetor (50 ng/μL), 6 μL de 10 x 30 μL de DDQ₂O. Incubar a 37 ° C por 3 h. executar a reação inteira, 4 μL de SspI e amortecedor da reação misturar em gel de agarose 1% e extrair com um Kit de extração do Gel. Siga o protocolo do fabricante.
      2. Realizar o tratamento T4 DNA Polymerase do vetor e inserir DNA. Combinar o seguinte: 5 μL de DNA vetor ou insert (50 ng/μL), 2 μL de tampão, DNA polimerase 10 x T4, 1 μL de dGTP (25 mM) para vector ou 1 μL do dCTP (25 mM) para inserir DNA, 1 μL de TDT (100 mM), 0,4 μL de T4 DNA Polymerase (LIC-qualificado) e 9.6 μL de DDQ₂O. Incubar as reacções à temperatura ambiente por 40 min. calor-inativar enzimas a 75 ° C por 20 min.
         Nota: O vetor LIC e inserir DNA devem ser tratadas em reações distintas.
      3. Execute o recozimento reação LIC. Combinar o seguinte: 2 μL de T4-tratados inserir DNA, 2 μL de T4-tratados LIC vector DNA. Incube a reação à temperatura ambiente por 10 min.
2. Transformar BL21 (DE3) Escherichia coli células com este plasmídeo recombinante.
   1. Descongele as células competentes (50 μL em microtubo) no gelo.
   2. Adicionar aproximadamente 1 μL (50 ng) do plasmídeo no tubo. Misture as células e DNA por sacudir suavemente o tubo 2 – 3 vezes. Coloca o tubo no gelo por 20 min.
   3. Calor choque a 42 ° C por 40 s. lugar do tubo no gelo novamente por 2 min. adicionar 1 mL de temperatura LB mídia ao tubo.
   4. Lugar do tubo de mistura no shaker 250 rpm a 37 ° C por 45 min. espalhar a 150-200 µ l da mistura nas chapas de seleção. Inverter a placa e incubar durante uma noite a 37 ° C.
3. Escolha uma única colônia e cultura de células em 100 mL de meio de 2YT contendo 50 canamicina µ g/mL a 37 ° C durante a noite. Na manhã seguinte, inocular meio 2YT de 1L contendo 50 canamicina µ g/mL com 10ml de cultura durante a noite e incubar em incubadora de abanador de 37 ° C a 250 rpm, até que o OD₆₀₀ atinge ~ 0.6. Posteriormente, induzir a cultura com IPTG para uma concentração final de 0,4 mM e crescer para outro h 5 a 30 ° C.
4. Recolher as células por centrifugação a 8.000 x g durante 10 minutos a 4 ° C, recolher as células e ressuspender todas as células de 10g em 40 mL de tampão de lise (10 mM HEPES pH 7,4, 250 mM KCl, 10mm β-Mercaptoetanol, 25 lisozima μg/mL, 25 μg/mL DNase 1 mM PMSF).
   1. Interrompê-lo por sonication em amplitude de 65% para 8 min com 1 s s no e 1 fora. Remova os restos de células por centrifugação a 40.000 x g durante 30 min a 4 ° C. Filtrar o sobrenadante, passando através de filtro de 0,22 μm e carregá-lo para o loop de amostra.
5. Purificar a proteína de fusão, cleave a tag e re-purificar a proteína do alvo.
   1. Purificar a proteína de fusão usando coluna Ni-NTA (tampão de ligação: 10 mM HEPES pH 7,4, 250 mM KCl; tampão de eluição: pH HEPES 10mm 7.4, 250 mM KCl, imidazol 500mm) e purificar através de um sistema de purificação, com um gradiente linear de imidazol 20 – 250 mM.
   2. Cleave a proteína alvo eluted com protease do PEV (01:50 ratio) durante a noite a 4 ° C.
   3. Purificar a mistura de reação de clivagem, usando a coluna de resina de amilose (tampão de ligação: 10 mM HEPES pH 7,4, 250 mM KCl; tampão de eluição: pH HEPES 10mm 7.4, 250 mM KCl, maltose 10 mM) e Ni-NTA coluna para remover a tag e protease TEV. A proteína do alvo será na fração de escoamento dessas duas colunas.
   4. Dialize a amostra contra tampão de diálise (10 mM Tris-HCl pH 8.8, 50 mM KCl, 10mm β-Mercaptoetanol para reduzir a concentração de sal. Purificar a amostra em uma coluna de troca de ânion (tampão de ligação: 10 mM Tris-HCl pH 8.8, 10 mM β-Mercaptoetanol; tampão de eluição: pH 10 mM Tris-HCl 8.8, 1 M de KCl, 10mm β-Mercaptoetanol) por um gradiente linear de 20 – 500 mM KCl no buffer de eluição.
   5. Como um passo final no processo de purificação, concentrar a proteína usando o concentrador centrífugo (10 kDa MWCO) e injetar em uma coluna de gel filtração Superdex 200 26/600 para verificar a homogeneidade.
6. Examine a pureza da proteína, executando-o em um SDS 15% página.
   Nota: Todas as colunas estão executando em um sistema de purificação de proteínas com uma taxa de fluxo de ligação de 2 mL/min e uma taxa de fluxo de eluição de 4 mL/min, exceto gel-filtração em 1 mL/min.

2. cristalização e preparação de proteína

1. Concentrar a amostra de proteína purificada para 10 mg/mL, utilizando centrífuga concentrador (10 kDa MWCO) e troca de buffer de buffer de cristalização antes de armazenar a-80 ° C.
2. Realizar triagem de cristalização (proporção de 1:1, 200 nL de proteína e 200 nL de tampão do reservatório) por sessão soltar método de difusão de vapor a 295 K com vários kits de cristalização usando um líquido automatizado sistema robótico em um formato de 96 poços de manipulação.
   Nota: Nós usamos kits da investigação Molecular de dimensões e Hampton e o Gryphon automatizado sistema de manipulação de líquidos.
3. A placa de 96 poços cristalização para evitar a evaporação e habilitar o equilibrio da gota da proteína com o tampão do reservatório do selo. Em seguida, manter as placas na incubadora de cristal a 18 ° C.
4. Verifique as placas de 96 poços, periodicamente, usando um microscópio de luz para monitorar o crescimento e a formação de cristais.
5. Para diferenciar os cristais de proteínas de cristais de sal, use uma tintura de proteína. Adicione 1 µ l de corante para soltar o alvo. Esperar cerca de 1h e observar sob microscópio. Os cristais de proteína ficará azuis.
6. Usar as condições de cristalização positivo (sulfato de amônio de 1,5 M, 0,1 M Tris pH 8.0) para otimizar ainda mais os cristais usando suspensão cair método de difusão de vapor em placas de 24 poços.
   1. Otimize o pH de 7,0 a 8,5 com intervalo de unidade de pH 0,5 cada passo. Otimize a concentração de sulfato de amónio de 1,2 M de 1,7 M, com intervalo de 0,1 M cada passo. (No nosso caso a melhor condição de produzir grandes cristais em forma de placa foi 0,1 M HEPES pH 7.0 e 1.6 M sulfato de amônio)

3. cristal montagem, raio-x coleta de dados e determinação da estrutura

1. Monte os cristais em um cryoloop e flash-cool em nitrogênio líquido usando reservatório solução contendo 20% de glicerol como crio-protetor. Coloque os cristais em unipuck para armazenamento e transporte.
2. Pre-tela usando um difratômetro in-house diffractor de raio-x de cristais de proteína. Escolha os melhores com as resoluções mais altos para coleta de dados nas instalações do síncrotron (o nosso dataset foi colhido em BL17U1 nas instalações de radiação síncrotron de Shanghai).
   1. Use o software de controle de trajetória BluIce²⁶ para montar e centralizar os cristais da função centragem automática ou manual. Realize exposições de teste para determinar a estratégia de coleta de dados, incluindo o início, ângulo, tempo de exposição, distância do detector, largura da moldura e números.
   2. Recolher o dataset em conformidade (recolhemos 180 frames com 1 s tempo de exposição, largura da moldura de 1° e a distância de detector de 350mm).
3. Índice, integrar e dimensionar o dataset usando o HKL2000 suíte²⁷. Primeiro, realizar a função de busca de pico para encontrar os pontos de difração e então os pontos de índice e selecione o grupo de certo espaço. Após a integração de pico, dimensionar o conjunto de dados com o modelo de erro apropriado e salvar o arquivo de saída .sca.
4. Resolva o problema da fase por substituição molecular usando Phaser²⁸ em PHENIX²⁹.
   1. Calcule o número de cópia possível de moléculas de proteína na unidade assimétrica por Xtriage³⁰.
   2. Olhe para os modelos de estrutura apropriada com alta identidade e estrutural similaridades como a proteína do alvo usando estruturas conhecidas da literatura ou os modelos gerados pelo servidor de predição de estrutura como Phyre2³¹ (usamos coelho RyR1 NTD como um modelo de pesquisa, PDB ID 2XOA).
   3. Execute Phaser usando o arquivo de dados de difração, o arquivo de modelo de estrutura e o arquivo de sequência de proteínas para encontrar a solução.
5. Execute AutoBuild³² no PHENIX²⁹ para gerar o modelo inicial usando o arquivo de saída de Phaser e o arquivo de sequência da proteína alvo.
6. Construir a estrutura para a densidade de elétron experimental modificados usando Coot³³ e refinar usando phenix.refine³⁴ em ciclos iterativos manualmente.
7. Valide o modelo final usando as ferramentas de validação no PHENIX¹⁸.

Resultados

Purificação

O domínio N-terminal da DBM RyR foi expressa como uma proteína de fusão com uma marca de hexahistidine, uma marca MBP e um local de clivagem de protease TEV. Nós seguimos uma estratégia de purificação de cinco etapas para obter uma proteína altamente pura, adequada para efeito de cristalização. Em primeiro lugar, a proteína de fusão foi purificada da fracção solúvel de lisado celular por coluna Ni-NTA (...

Discussão

Neste artigo, descrevemos o procedimento para expressar recombinantes, purificar, cristalizar e determinar a estrutura de DBM RyR NTD. Para cristalização, um requisito crucial é a obtenção de proteínas com homogeneidade, pureza e alta solubilidade. Em nosso protocolo, escolhemos usar pET-28a-HMT vetor que contém uma marca de hexahistidine e MBP, ambos os quais poderiam ser utilizados para a purificação obter uma maior pureza de dobra. Além disso, as aids marca MBP na solubilidade da proteína alvo. Nós purific...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
pET-28a-HMT vector			This modified pET vector contains a hexahistidine tag, an MBP fusion protein and a TEV protease cleavage site at the N-terminus (Lobo and Van Petegem, 2009)
E. coli BL21 (DE3) strain	Novagen	69450-3CN
HisTrapHP column (5 mL)	GE Healthcare	45-000-325
Amylose resin column	New England Biolabs	E8021S
Q Sepharose high-performance column	GE Healthcare	17-1154-01
Amicon concentrators (10 kDa MWCO)	Millipore	UFC901008
Superdex 200 26/600 gel-filtration column	GE Healthcare	28-9893-36
Automated liquid handling robotic system	Art Robbins Instruments	Gryphon
96 Well CrystalQuick	Greiner bio-one	82050-494
Uni-Puck	Molecular Dimensions	MD7-601
Mounted CryoLoop - 20 micron	Hampton Research	HR4-955
CryoWand	Molecular Dimensions	MD7-411
Puck dewar loading tool	Molecular Dimensions	MD7-607
Nano drop	Thermo Scientific	NanoDrop One
Crystal incubator	Molecular Dimensions	MD5-605
X-Ray diffractor	Rigaku	FRX
PCR machine	Eppendorf	Nexus GX2
Plasmid mini-prep kit	Qiagen	27104
Gel extraction kit	Qiagen	28704
SspI restriction endonuclease	NEB	R0132S
T4 DNA polymerase	Novagen	2868713
Kanamycin	Scientific Chemical	25389940
IPTG	Genview	367931
HEPES	Genview	7365459
β-mercaptoethanol	Genview	60242
Centrifuge	Thermo Scientific	Sorvall LYNX 6000
Sonnicator	Scientz	II-D
Protein purification system	GE Healthcare	Akta Pure
Light microscope	Nikon	SMZ745
IzIt crystal dye	Hampton Research	HR4-710
Electrophoresis unit	Bio-Rad	1658005EDU
Shaker Incubator	Zhicheng	ZWYR-D2401
Index crystal screen	Hampton Research	HR2-144
Structure crystal screen	Molecular Dimensions	MD1-01
ProPlex crystal screen	Molecular Dimensions	MD1-38
PACT premier crystal screen	Molecular Dimensions	MD1-29
JCSG-plus crystal screen	Molecular Dimensions	MD1-37